工程化大肠杆菌高产中链脂肪酸（MCFAs）用于干鱼风味增强

来源：High-yield production of medium-chain fatty acids (MCFAs) via engineered Escherichia coli metabolic pathways for flavor enhancement of dried-fish（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

📎 相关工具：代谢通路设计

导读

中链脂肪酸（MCFAs）是提升干鱼等加工食品感官品质的关键风味增强剂，但传统植物提取路线面临可持续性瓶颈。本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑系统对大肠杆菌MG1655进行系统代谢重编程——依次敲除消耗丙酮酸、乙酰辅酶A的竞争基因及缓解MCFAs毒性的aas基因，并异源表达植物硫酯酶CpFatB1。最优菌株MG9以D-果糖为碳源发酵144小时后，辛酸（C8）产量达680 mg/L，纯化后纯度99.75%、回收率82.15%。将生物合成C8脂肪酸应用于工业干鱼加工，风味化合物相似度从38.57%提升至68.57%。

研究背景

中链脂肪酸（MCFAs）包括辛酸（C8）、癸酸（C10）和月桂酸（C12），在食品、制药和化工领域具有重要工业价值，可作为风味增强剂、抗菌剂和润滑剂增稠剂。然而，传统天然MCFAs生产主要依赖椰子油和棕榈仁油等植物提取，这些来源中MCFAs仅占总脂肪酸的7.9-15%，且面临资源密集型种植、地理和季节限制、提取率低及下游催化精制成本高等固有瓶颈。微生物细胞工厂利用合成生物学和代谢工程手段，提供了一种可再生、可扩展且可能实现碳中性的生物合成替代方案。大肠杆菌因脂肪酸生物合成通路研究深入，已成为游离脂肪酸（FFAs）生产的首选底盘生物。

研究方法

2.1 化学试剂与培养基

化学试剂购自阿拉丁生化科技有限公司（中国上海）或麦克林生化科技有限公司（中国上海）。DNA纯化试剂盒购自诺唯赞生物科技有限公司（中国南京）。

2.2 菌株与质粒构建

本研究所用大肠杆菌菌株及质粒的背景、基因型和来源列于表1。新质粒构建引物列于表S1，基因敲除和质粒消除鉴定引物列于表S2，基因敲除所用sgRNA序列列于表S3。所有菌株均为MG1655衍生株，MG1655购自上海保藏微生物有限公司（SHMCC）。

质粒采用标准分子克隆技术构建。基因敲除所用pTargetF和pCas质粒如图S1所示。通过反向PCR将sgRNA序列插入pTargetF质粒。目标基因缺失的同源臂通过重叠PCR制备。pTargetF质粒用BamHⅠ限制性内切酶线性化后，将同源臂插入。所有构建的质粒均经PCR和DNA测序验证。所有分子操作均遵循标准方案或制造商说明书。菌株以25%甘油储备液保存于-80°C。

硫酯酶基因（CpFatB1）序列由青科生物技术有限公司（中国北京）合成。CpFatB1序列及相关引物列于表S4。使用反向PCR将合成基因序列插入克隆载体pTrc99a。CpFatB1的表达受强诱导型trc启动子系统控制。插入片段的准确性经DNA测序结果再次确认。

2.3 培养基与培养条件

采用Luria–Bertani（LB）肉汤培养基进行培养。在优化过程中，根据需要向培养基中补充碳源和抗生素。所有培养均从LB琼脂平板上挑取单菌落起始，平板由-80°C保存的甘油储备液（25% v/v）划线制备。过夜培养通过接种LB培养基并在37°C、200 rpm振荡条件下进行。

为维持质粒稳定性，根据需要向培养基中添加适当抗生素：氨苄青霉素（100 μg/mL）、卡那霉素（50 μg/mL）或壮观霉素（100 μg/mL）。通过添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度1 mM诱导酰基-ACP硫酯酶表达。主培养时，将过夜培养的细胞以初始OD600为0.05接种于含25 mL培养基的200 mL锥形瓶中。在30°C或37°C、200 rpm振荡条件下培养至OD600达到约0.5。分别在48、96和144小时收集样品用于后续脂肪酸分析。

2.4 脂肪酸分析

脂肪酸定量分析：向400 μL培养物中加入10 mL氯仿/甲醇混合液（1:1，v/v）。混合物经超声处理（80 W，5分钟），室温静置5分钟。8000 × g离心5分钟后收集上清液。向上清液中加入2.5 mL氯仿和3.0 mL 1%（w/v）氯化钠溶液，室温孵育2.5小时。有机层用旋转蒸发仪在50°C下真空蒸发至近干。残留物用5 mL氯仿重新溶解，加入5 mL 0.04 M氢氧化钾甲醇溶液，在密封离心管中于60°C孵育1小时，每10分钟摇动一次。冷却后加入4 mL盐酸/甲醇溶液（1:9，v/v），混合物在60°C下再孵育20分钟。冷却后加入3.0 mL饱和盐水溶液，脂肪酸甲酯（FAMEs）用5 mL正己烷萃取。加入100 μL 20 mg/mL十九烷酸作为内标。

脂肪酸定性分析采用Agilent 7890A-5975C气相色谱-质谱联用（GC-MS）系统，配备DB-WAX毛细管柱（60 m × 0.25 mm × 0.5 μm；Agilent）。进样量2 μL，进样口温度300°C，分流比5:1。高纯氦气为载气，恒流模式流速2 mL/min。柱温程序：50°C保持1分钟，以20°C/min升至200°C，再以3°C/min升至240°C，保持30分钟。质谱采用电子轰击（EI）模式，离子源温度230°C，四极杆温度150°C，扫描范围m/z 29–500。游离脂肪酸定量基于已知浓度纯脂肪酸标准品制备的外标曲线。

2.5 C8脂肪酸的HPLC分析

脂肪酸提取：取1 mL细菌培养液与100 μL HCl和5 mL无水乙醚混合。混合物经超声乳化（80 W，5分钟），室温静置30分钟。分相后，3500g离心10分钟收集上层有机相。该有机相与500 μL 1 M NaOH混合，室温萃取30分钟。下层水相经离心（3500 g，10分钟）回收后，用100 μL HCl酸化，充分混匀，最后经0.22 μm滤膜过滤。

色谱分离条件：C8脂肪酸分离采用Semiprep 50半制备色谱系统（Sepfocus，上海），配备10 × 250 mm色谱柱，填充C18硅胶（10 μm，100 Å）。流动相为乙腈和水（60:40，v/v），流速2 mL/min。检测波长220 nm。进样量0.5 mL至1.5 mL。

2.6 干鱼样品制备

活金鲳鱼（平均重量：500 ± 25 g）购自中国杭州海鲜市场。鱼通过击打致晕处死。随后沿背鳍取鱼片，迅速去除内脏并彻底冲洗。日晒样品（Sun-dry）将鱼片铺在渔网上，在直射阳光下风干3天。烘箱干燥样品（Oven-dry）置于通风循环烘箱中，35°C干燥56小时。辛酸处理样品（Oct-dry）先在相同烘箱条件下干燥16小时，然后喷洒500 μL 1%辛酸溶液，随后继续干燥56小时。

2.7 挥发性化合物的GC-MS分析

采用Liu等（2023）和Yang等（2021）的方法提取挥发性化合物，略有修改。简要而言，称取5 g鱼样品转移至20 mL顶空瓶中，固定在配备50/30 μm（DVB/CAR/PDMS）纤维（Supelco，美国）的萃取平台上，60°C加热40分钟。加入20 μL 1 mg/mL 2,4,6-三甲基吡啶作为内标。然后插入GC-MS进样口进行分析。

GC-MS（7890A-5975C，Agilent，美国）用于挥发性化学物质分析。配备HP-5MS（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）毛细管柱，氦气载气流速1.0 mL/min。色谱条件如下：40°C起始保持2分钟，以3°C/min升至90°C，再以4°C/min升至160°C（保持1分钟），然后以10°C/min升至240°C（保持5分钟）。质谱操作参数：全扫描模式，质量范围35-350 u，离子源温度原文未详述。

【数据】试剂来源：阿拉丁/麦克林（上海）；DNA纯化试剂盒：Vazyme（南京）；菌株背景：MG1655（SHMCC）；敲除系统：pTargetF/pCas；限制酶：BamHⅠ；硫酯酶基因：CpFatB1（青科合成）；载体：pTrc99a；启动子：trc；抗生素浓度：氨苄青霉素100 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL、壮观霉素100 μg/mL；IPTG浓度：1 mM；接种OD600：0.05；培养温度：30°C或37°C；转速：200 rpm；取样时间点：48/96/144 h；脂肪酸提取：氯仿/甲醇(1:1) 10 mL + 超声80 W 5 min + 离心8000 × g 5 min + NaCl 1%(w/v) 3.0 mL + 旋转蒸发50°C + KOH/甲醇0.04 M 60°C 1 h + HCl/甲醇(1:9) 4 mL 60°C 20 min + 正己烷5 mL萃取；内标：十九烷酸20 mg/mL 100 μL；GC-MS：Agilent 7890A-5975C + DB-WAX柱(60 m×0.25 mm×0.5 μm)；进样量2 μL；进样口温度300°C；分流比5:1；载气He 2 mL/min；柱温：50°C(1 min)→20°C/min至200°C→3°C/min至240°C(30 min)；EI源230°C；四极杆150°C；扫描m/z 29-500；HPLC提取：培养液1 mL + HCl 100 μL + 无水乙醚5 mL + 超声80 W 5 min + 静置30 min + 离心3500g 10 min + NaOH 1 M 500 μL + HCl 100 μL + 0.22 μm滤膜；HPLC条件：Semiprep 50系统 + C18柱(10×250 mm, 10 μm, 100 Å) + 乙腈/水(60:40) + 2 mL/min + 220 nm + 进样0.5-1.5 mL；金鲳鱼平均重量：500±25 g；日晒干燥：3天；烘箱干燥：35°C 56 h；辛酸处理：先烘16 h + 500 μL 1%辛酸溶液 + 再烘56 h；挥发性物质提取：样品5 g + 20 mL顶空瓶 + 50/30 μm纤维 + 60°C 40 min + 内标2,4,6-三甲基吡啶20 μL(1 mg/mL)；GC柱：HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气1.0 mL/min；柱温：40°C(2 min)→3°C/min至90°C→4°C/min至160°C(1 min)→10°C/min至240°C(5 min)；MS扫描35-350 u

研究结果

3.1 消除副产物途径对总脂肪酸产量的影响

大肠杆菌是生产FFAs的理想宿主生物，对大肠杆菌脂肪酸生物合成途径的深入了解有助于途径工程改造，从而调控所产生脂肪酸的化学组成。K12 MG1655菌株接近野生型大肠杆菌，作为研究最深入的大肠杆菌菌株，常被选为优选模式生物。因此，本研究选择大肠杆菌作为底盘，以MG1655菌株作为改造的起始宿主。与本研究相关的大肠杆菌脂肪酸代谢途径总结于图2。

为初步评估对总脂肪酸产量的影响，我们构建了一系列单基因敲除突变体以扰动生物合成途径中的关键节点。基于脂肪酸从头合成途径，我们靶向敲除poxB和ldhA基因以减少丙酮酸消耗，从而增加其转化为乙酰-CoA的可用性。此外，敲除pta基因以防止乙酰-CoA分流，增强其进入脂肪酸生物合成途径的通量。为降低MCFAs的细胞毒性，我们靶向敲除aas基因——该基因此前已被证明可破坏MCFAs酯化进入膜脂的过程，从而减轻其对宿主的毒性作用。Aas酶具有双重功能：将FFAs活化为酰基-ACP，并将酰基链转移至溶血磷脂（如2-酰基-GPE），重新形成完整磷脂。当CpFatB1硫酯酶产生大量MCFAs时，Aas将其掺入膜磷脂中，导致膜组成异常、流动性改变和毒性产生。敲除aas阻断了这一再整合途径，MCFAs无法重新酯化进入膜，而是在培养基（或有机覆盖层）中积累，同时膜保持其天然的长链脂质组成。这保护了膜完整性，减少了细胞应激，并提高了MCFAs产量。

为评估基因改造对脂肪酸生产的影响，我们首先监测了所有菌株48小时的生长曲线（图S2）。生长曲线显示所有菌株在24小时后细胞生长趋于稳定，因此选择24小时培养期进行后续脂肪酸提取。

poxB、aas、ldhA和pta基因的单独敲除导致总脂肪酸含量发生显著变化（图3A）。与亲本菌株MG1655（494.39 mg/L）相比，菌株MG2（620.35 mg/L）、MG3（772.43 mg/L）和MG4（756.91 mg/L）的总脂肪酸滴度分别显著提高了25.48%、56.24%和53.10%。

如图3B所示，野生型和工程菌株均仅产生痕量中链脂肪酸（MCFAs）。这与先前报道一致，表明细菌脂肪酸合酶（FAS）活性的主要终产物通常是C16和C18脂肪酸。尽管FAS系统在延伸过程中会产生中链酰基中间体，但这些中间体在达到C16–C18链长之前很少被释放，这解释了观察到的MCFAs积累可忽略不计的现象。与此一致，大肠杆菌的脂肪酸谱以C16、C17:1和C18物种为主（图3A）。

图3A：不同核心酶对总脂肪酸含量的影响。图3B：不同核心酶对中链脂肪酸含量的影响。图3C：不同核心酶对总脂肪酸含量的影响。图3D：不同核心酶对中链脂肪酸含量的影响。

【数据】亲本菌株MG1655总脂肪酸：494.39 mg/L；MG2：620.35 mg/L（+25.48%）；MG3：772.43 mg/L（+56.24%）；MG4：756.91 mg/L（+53.10%）；生长稳定时间：24 h；脂肪酸谱以C16、C17:1、C18为主；MCFAs含量：痕量

3.2 植物硫酯酶表达对中链脂肪酸产量的影响

基于单基因敲除菌株的总脂肪酸产量谱（图3A），我们构建了aas、ldhA和pta的组合缺失以进一步增强MCFAs积累。48小时监测的生长曲线表明所有菌株在36小时后达到稳定生长（图S3），因此选择48小时培养期进行脂肪酸提取。

鉴于aas缺失可减轻MCFAs对宿主的毒性，我们构建了aas与ldhA或pta的双敲除，以及三个基因的三敲除。为便于比较，还构建了ldhA和pta的双敲除。对这四个工程菌株进行了脂肪酸产量评估。

如图3C所示，与亲本MG1655相比，MG5和MG6双敲除菌株的总脂肪酸含量下降，而另外两个组合突变体（MG7和MG8）产量增加。

选择酰基-ACP硫酯酶基因是因为其在植物种子中增强油脂积累方面的作用已被充分证实。在异源表达植物来源的硫酯酶CpFatB1之前，所有菌株的MCFAs水平仍可忽略不计（图3D）。

引入CpFatB1后，四个工程菌株的总脂肪酸滴度均增加，同时MCFAs产量大幅提高（图4）。值得注意的是，菌株MG9产生了最高的MCFAs含量，达到84.11 mg/L。

需要指出的是，微生物合成MCFAs仍具挑战性，原因在于天然细菌代谢中MCFAs丰度本来就低、植物硫酯酶的异源表达效率低下，以及细菌酰基-ACP硫酯酶的底物特异性宽泛。

为进一步评估生产性能，我们测定了48小时培养后的细胞干重（DCW），并计算了C8脂肪酸产率（图S4）。一致的是，MG9也表现出最高的C8脂肪酸产率，达47.29 mg/g DCW。

由于M9菌株产生了最高含量的MCFAs和最高产率的C8脂肪酸，选择M9菌株进行优化以最大化菌株的C8脂肪酸产量。

【数据】生长稳定时间：36 h；培养周期：48 h；MG9 MCFAs含量：84.11 mg/L；MG9 C8产率：47.29 mg/g DCW；总脂肪酸变化：MG5/MG6下降，MG7/MG8增加

3.3 碳源对MCFAs生产的影响

为最大化C8脂肪酸产量，使用四种常见碳源培养MG9菌株：葡萄糖、甘油、D-果糖和α-乳糖。我们首先监测了MG9和亲本菌株MG1655在每种条件下的生长情况（图S5）。两种菌株表现出相似的生长谱，48小时后趋于稳定，在甘油和D-果糖培养中观察到更高的细胞密度。

48小时培养后，定量检测了MCFAs产量、细胞干重（DCW）和C8脂肪酸产率。如图5A所示，C8脂肪酸仍为主要MCFAs。以D-果糖为碳源时获得最高C8滴度（100.28 mg/L）。在优化的碳源补充条件下，DCW（图5B）和C8脂肪酸产率（图5C）均显著增加。甘油（73.23 mg/g DCW）和果糖（61.87 mg/g DCW）培养中获得了最高的C8脂肪酸产率。

甘油因其丰富性、低成本和每碳高度还原性（C3H8O3的κ=4.67，高于葡萄糖C6H12O6的κ=4），是微生物生物合成的有吸引力的底物。类似地，已有报道表明果糖可以增加大肠杆菌的细胞密度和重组基因表达，同时果糖代谢可显著减少乙酸排泄（Crabtree效应）。与常用碳源葡萄糖相比，果糖产生更高水平的MCFAs。推测原因在于，在大肠杆菌中，果糖通过果糖特异性PTS系统转运和磷酸化，生成果糖-1-磷酸（F1P），后者被直接转化……

【数据】碳源种类：葡萄糖、甘油、D-果糖、α-乳糖；生长稳定时间：48 h；D-果糖最高C8滴度：100.28 mg/L；甘油C8产率：73.23 mg/g DCW；果糖C8产率：61.87 mg/g DCW；甘油κ=4.67；葡萄糖κ=4

3.4 D-果糖补料发酵对C8脂肪酸生产的影响（基于结果部分后续内容）

（注：原文此处后续段落未在节选中完整呈现，以下根据可获取文本忠实翻译）

【数据】原文未详述

3.5 干鱼样品风味比较（基于结果部分后续内容）

【数据】原文未详述

讨论与解读

本研究通过CRISPR/Cas9系统敲除竞争丙酮酸（ldhA、poxB）和乙酰-CoA（pta）的基因，以及降低MCFAs毒性的aas基因，最终选择双敲除菌株MG1655△pta△aas（MG9）作为最优生产菌株。随后表达中链特异性硫酯酶（CpFatB1），结合碳源优化和补料分批发酵优化，最终C8脂肪酸滴度达680 mg/L——较仅产生0.76 mg/L的野生型菌株实现了巨大提升。将生物合成的C8脂肪酸应用于工业干鱼加工，显著丰富了风味谱，增加了挥发性化合物的多样性，并提高了与传统日晒产品的感官相似度，但仍存在轻微风味差距。未来工作将集中于阐明MCFAs驱动风味形成的代谢机制，并进一步优化生产和应用工艺以拓宽工业用途。

编译者解读

本研究展示了一条清晰的合成生物学工程路径：从底盘选择、竞争途径系统敲除、异源硫酯酶引入到发酵条件优化，层层递进地解决了MCFAs天然低产的核心瓶颈。方法上的亮点在于组合敲除策略——同时消除前体竞争和产物毒性两大限制因素，而非单一靶点改造。680 mg/L的C8产量和99.75%的纯化纯度已具备一定工业转化潜力。值得思考的是，风味应用验证将生物合成产物与实际食品场景对接，打通了"菌株构建—发酵生产—纯化—应用评价"的完整链条。局限在于目前仍以摇瓶培养为主，发酵罐放大后的产量表现和工艺经济性尚待验证。后续若能在产物连续提取和菌株适应性进化上继续突破，有望进一步降低成本，推动微生物来源MCFAs在食品风味领域的实际落地。

参考来源

期刊：Food Bioscience, 2026

DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109118

DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109118