来源：Glyoxyl-agarose immobilized Bacillus subtilis chitosanase as a reusable biocatalyst for modulated production of chitooligosaccharides（Carbohydrate Polymers）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
酶法生产性质稳定的低分子量壳聚糖与壳寡糖（COS）长期面临瓶颈——游离壳聚糖酶在酸性、高温条件下极易失活。本研究将重组枯草芽孢杆菌壳聚糖酶通过多点共价连接固定于乙醛酸活化琼脂糖载体，在pH 4.5和55°C条件下展现出增强的活性与稳定性，而游离酶在此条件下迅速失活。固定化酶可连续重复使用达10个循环。更重要的是，MALDI-TOF质谱显示固定化酶改变了壳聚糖水解产物的演化轨迹，倾向于积累并维持以DP2–DP4为主的低聚合度寡糖信号模式。这一策略无需改变酶的一级结构，即可同时实现酶稳定化与聚合物降解模式的调控。
研究背景
壳聚糖部分解聚得到的壳聚糖水解物与壳寡糖（COS），作为源自可再生海洋生物质的高附加值功能产品，在生物医药、农业、食品技术和功能材料领域备受关注。这些性质高度依赖壳聚糖混合物的分子大小与分布，使得含COS水解物的定向生产成为壳聚糖增值策略中的关键挑战。酶法水解虽被视为化学法的可持续替代方案，但游离酶在酸性条件下的稳定性不足、操作温度范围狭窄以及对产物分布的控制有限，严重制约了实际应用。特别是游离壳聚糖酶倾向于引发过度二次水解，产生异质性寡糖混合物，难以满足需要一致且窄分布产物的应用需求。本研究旨在通过多点共价固定化策略，在不改变酶一级结构的前提下，同时解决稳定性与产物调控两大难题。
研究方法
2.1 化学试剂
以下分析级试剂被使用：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、磷酸氢二钾（K₂HPO₄）、硫酸卡那霉素、蛋白胨、酵母提取物、D-氨基葡萄糖和缩水甘油（C₃H₆O₂），购自Merck公司（德国达姆施塔特）。6% BCL琼脂糖珠标准品购自Agarose Bead Technologies公司（ABT，西班牙马德里）。来自虾壳的壳聚糖（实用级，Sigma 41,796，脱乙酰度>75%，分子量190,000–375,000 Da）购自Sigma-Aldrich公司（德国施泰因海姆）；用于HPLC和光谱分析的乙酸购自CDH公司（印度新德里达里亚甘杰）。98%氢氧化钠颗粒（AR级）购自Loba Chemie公司（印度马哈拉施特拉邦）；氯化钠（AR级）购自CDH公司（印度新德里达里亚甘杰）；酒石酸钾钠购自CDH公司（印度新德里达里亚甘杰）；3,5-二硝基水杨酸（98%）购自Sigma Aldrich公司（德国施泰因海姆）。
【数据】试剂来源：Merck、ABT、Sigma-Aldrich、CDH、Loba Chemie；壳聚糖脱乙酰度：>75%；壳聚糖分子量：190,000–375,000 Da
2.2 枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的异源表达
用无菌牙签手动挑取经目标质粒（pET28α-BSchito）转化的大肠杆菌C41菌落——该质粒携带枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因（Uniprot O07921）——接种至含5 mL LB培养基（10 g L⁻¹胰蛋白胨、5 g L⁻¹酵母提取物、10 g L⁻¹ NaCl）的25 mL摇瓶中，培养基中添加卡那霉素（50 μg mL⁻¹）。培养物于37°C、250 rpm振荡培养15小时。培养结束后，取900 μL培养物与900 μL无菌50%（v/v）甘油溶液混合，所得保藏物于−80°C保存备用。壳聚糖酶（BSchito）的异源表达通过将10 μL甘油保藏物接种至含10 mL LB培养基（添加卡那霉素50 μg mL⁻¹）的100 mL摇瓶中进行，随后在相同条件下（15小时，37°C，250 rpm）培养。蛋白表达通过添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度50 μM诱导。诱导2.5小时后，培养物于3220 ×g、5°C离心20分钟收获（Eppendorf 5810R，德国汉堡）。弃去细胞沉淀，上清液转移至新的微量滴定板中用于后续酶活测定。
【数据】诱导剂：IPTG，终浓度50 μM；诱导时间：2.5h；离心：3220 ×g，5°C，20min；培养条件：37°C，250rpm，15h；卡那霉素浓度：50 μg mL⁻¹；保藏温度：−80°C
2.3 酶活测定
BSchito的壳聚糖裂解活性采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法在96孔平底微量滴定板中测定。简言之，将200 μL壳聚糖溶液（1.5% w/v，脱乙酰度75%，190,000–375,000 Da）——配制于0.15 M乙酸缓冲液（pH 6.0）——与20 μL含BSchito的培养上清液共同孵育。反应混合物于30°C、800 rpm轨道振荡下孵育2小时。酶促反应通过将样品快速加热至95°C维持10分钟终止。样品随后于−20°C保存，直至使用DNS法 quantification 还原糖。反应产物的等效摩尔浓度由以D-氨基葡萄糖为标准品制备的校准曲线确定。
【数据】底物：壳聚糖1.5% w/v（脱乙酰度75%，190,000–375,000 Da）；缓冲液：0.15M乙酸缓冲液pH 6.0；温度：30°C；时间：2h；转速：800rpm；终止条件：95°C，10min
2.4 壳聚糖酶在乙醛酸活化琼脂糖上的固定化
琼脂糖珠通过缩水甘油活化后经高碘酸钠氧化进行功能化，该方法最初由Mateo及其同事描述，本研究仅作微小程序调整。此处理在琼脂糖基质上引入醛基（乙醛酸）基团，从而能够实现酶的后续共价固定化。壳聚糖酶的共价固定化在乙醛酸活化琼脂糖上进行，酶与载体比例为20 mL g⁻¹。固定化混合物由含重组BSchito的细胞培养上清液（60% v/v）稀释于碳酸氢钠缓冲液（100 mM NaHCO₃，pH 10.0）中组成，最终pH调至10.05。所得悬浮液于10°C、温和搅拌下孵育，直至反应上清液中检测不到酶活进一步变化，表明固定化过程完成。随后，添加硼氢化钠至终浓度0.5 mg mL⁻¹，将酶与载体之间形成的可逆席夫碱键还原为稳定的仲胺键，从而确保不可逆的共价连接。还原15分钟后，通过过滤回收固定化生物催化剂，用蒸馏水充分洗涤，于4°C保存备用。乙醛酸活化并洗涤后，琼脂糖珠以水合/湿态形式使用，在酶固定化之前不进行中间干燥步骤。对于固定化时间过程实验，相对活性以每次独立实验开始时（t=0）测得的活性为100%进行表达。固定化产率（IYₐ）通过监测固定化过程中上清液的残余酶活间接确定，按式(1)计算：
(1) IYₐ = 100 − (Af/As) × 100
其中Af为固定化过程结束时上清液中测得的酶活，As为过程开始时提供的初始酶活。固定化酶的全局活性产率（GYₐ）按式(2)计算：
(2) GYₐ = (A/Ao) × 100
其中Ao为初始提供的总酶活，A为固定化生物催化剂表现出的活性。SDS-PAGE分析用于评估重组BSchito在含酶制备物中的存在及其在固定化后上清液中的存在情况。对应空载体对照、固定化前含诱导BSchito的上清液、固定化后回收的上清液以及未诱导对照的样品，在变性条件下使用蛋白质分子量标记进行分析。蛋白条带通过考马斯亮蓝染色显色。
【数据】酶与载体比例：20 mL g⁻¹；固定化缓冲液：100mM NaHCO₃，pH 10.05；温度：10°C；硼氢化钠浓度：0.5 mg mL⁻¹；还原时间：15min；保存温度：4°C
2.5 pH和温度对壳聚糖酶活性及稳定性的影响
pH对壳聚糖酶活性的影响在96孔平底微量滴定板中评估：将200 μL壳聚糖底物（1.5% w/v）——配制于0.15 M乙酸缓冲液（pH 3.0、4.0、5.0和6.0）——与20 μL固定化酶（250 mg mL⁻¹）或存在于培养上清液中的游离酶共同孵育。反应混合物于30°C、900 rpm轨道振荡下孵育30分钟。酶促反应通过将样品快速加热至95°C维持10分钟终止后进行测定。对于pH和温度活性曲线，将各酶形式在相应实验系列中测得的最高活性视为100%，其余活性相对于该最大值进行表达。基于pH活性曲线，并考虑到壳聚糖在酸性条件下具有更高的溶解性和底物可利用性，选择pH 4.0作为后续实验的代表性操作条件。温度活性曲线通过将200 μL壳聚糖底物（1.5% w/v）——配制于0.15 M乙酸缓冲液（pH 4.0）——与20 μL固定化酶（250 mg mL⁻¹）或游离酶（培养上清液）共同孵育进行评估。反应于900 rpm轨道振荡下进行1小时。酶促反应通过将样品加热至95°C维持10分钟终止。残余活性测定在选定的操作条件下进行。简言之，将200 μL壳聚糖底物（1.5% w/v）——配制于0.15 M乙酸缓冲液（pH 4.0）——与20 μL固定化酶（250 mg mL⁻¹）或游离酶（培养上清液）于55°C、900 rpm轨道振荡下孵育。在不同时间点采集等分试样……
【数据】pH范围：3.0–6.0；底物浓度：1.5% w/v；乙酸缓冲液浓度：0.15M；固定化酶用量：250 mg mL⁻¹；pH活性测定条件：30°C，30min，900rpm；温度活性测定条件：pH 4.0，1h，900rpm；残余活性测定：55°C，900rpm；反应终止：95°C，10min
图1显示，游离酶在整个孵育期间保持高相对活性，表明重组BSchito在固定化所需的碱性条件下稳定。相比之下，上清液中检测到的酶活随孵育时间快速下降，约2小时后变得可忽略不计。这种行为强烈表明酶通过共价连接逐步从液相中去除至乙醛酸活化载体上，且固定化在该时间点基本完成。上清液酶活的快速丧失，加上游离酶（对照）的持续活性，证实了BSchito有效结合至活化琼脂糖基质。
【数据】固定化时间：约2h基本完成；游离酶对照：碱性条件下保持高相对活性
图2展示了琼脂糖在乙醛酸功能化和壳聚糖酶固定化前后的DRIFT-FTIR光谱。天然琼脂糖（蓝色）、乙醛酸功能化琼脂糖（绿色）以及固定化于乙醛酸-琼脂糖上的壳聚糖酶（粉色）的光谱特征反映了各修饰阶段的化学变化。
【数据】光谱分析：DRIFT-FTIR；样品：天然琼脂糖、乙醛酸功能化琼脂糖、固定化壳聚糖酶琼脂糖
研究结果
3.1 壳聚糖酶固定化条件的建立
异源生产获得了具有活性的游离壳聚糖酶，作为固定化和比较研究的参考生物催化剂。为确定适当的固定化时间，首先在pH 10条件下评估该过程——这是促进乙醛酸活化琼脂糖上共价连接所必需的。同时，将游离BSchito在相同条件下孵育，以评估碱性介质在无载体情况下对酶稳定性的影响。
尽管2小时后已达到完全固定化，但在pH 10下更长的暴露时间预期有利于酶与载体之间形成更多共价键，从而增加酶的刚性。基于这些考虑，后续实验选择3小时固定化时间。固定化时间已被广泛认为是影响固定化酶催化行为的关键参数，特别是在基于壳聚糖酶的系统中。多项研究报道，相对较短的固定化时间足以实现壳聚糖酶在固体载体上的有效吸附，而延长接触时间可能降低回收活性——特别是当中性pH下依赖物理吸附机制进行固定化时。相比之下，本工作中乙醛酸活化琼脂糖上的共价固定化在整个固定化过程中维持了酶的催化活性，即使在延长孵育后也是如此。这一观察凸显了吸附型固定化策略与共价连接方法之间的根本差异——在共价连接中，固定化过程中的酶稳定性对于保留催化活性至关重要。
SDS-PAGE分析用于验证固定化所用含酶制备物中重组BSchito的存在。如图S1（补充材料）所示，在固定化前的诱导BSchito上清液中检测到约27 kDa的蛋白条带，与重组枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的预期分子质量一致。该条带在酶固定化后回收的上清液中缺失或强度显著降低，表明重组BSchito在乙醛酸活化琼脂糖固定化过程中从液相中被移除。空载体和未诱导对照未显示相同的蛋白模式，支持该条带与IPTG诱导的BSchito重组生产相关。
评估了不同酶载量对固定化产率和回收活性的影响（表1）。值得注意的是，固定化生物催化剂是直接从含重组BSchito的培养上清液而非纯化酶制备的。因此，上清液中存在的非目标蛋白也可能在固定化过程中附着于乙醛酸活化琼脂糖。在所有情况下均获得了高固定化产率，超过87%，表明在广泛的初始酶活范围内壳聚糖酶均能有效共价附着至乙醛酸活化琼脂糖。尽管固定化产率持续较高，回收的催化活性强烈依赖于酶载量。较低的初始酶活导致较高的酶活回收率，在初始酶活为25 U g⁻¹时观察到最高值。虽然低酶载量下表现出的活性（U g⁻¹）降低，但相对活性回收率增加，表明在这些条件下固定化酶的利用效率更高。这种行为在固定化酶系统中常见，通常归因于高酶密度下产生的扩散限制和空间位阻。当涉及壳聚糖等大分子聚合底物时，这些效应尤为重要，因为受限的底物扩散和有限的活性位点可及性可能显著影响表观催化性能。基于这些结果，选择初始酶活25 U g⁻¹进行后续固定化实验，因为该条件在高固定化产率与改善的催化性能之间提供了适当平衡。
对于壳聚糖等聚合底物，固定化酶的表观催化行为反映了底物可及性和传质限制。由于壳聚糖的高分子量（190–375 kDa）和琼脂糖基质的多孔性质，传统的Michaelis-Menten建模产生的是表观系统级描述符而非固有催化常数。因此，直接的动力学比较可能在物理上不适当。相反，研究者使用系统级功能描述符比较生物催化剂，包括pH/温度活性曲线、定量热失活动力学和比较时间过程解聚，这些提供了操作相关的框架。
【数据】固定化产率：>87%；最佳初始酶活：25 U g⁻¹；SDS-PAGE条带：约27kDa；固定化时间：3h；壳聚糖分子量：190–375kDa
图3显示了琼脂糖珠的SEM显微照片：(a) 天然琼脂糖、(b) 乙醛酸功能化琼脂糖、(c) 固定化于乙醛酸-琼脂糖上的壳聚糖酶，以及(d) 催化操作后的固定化生物催化剂。角图为500×放大，主图为20,000×放大。
【数据】SEM放大倍数：500×（角图）和20,000×（主图）
3.2 乙醛酸活化琼脂糖及固定化生物催化剂的表征
乙醛酸活化琼脂糖是共价酶固定化的成熟载体，已被广泛研究……（后续表征内容原文节选未完整呈现）
图4显示了pH对游离和乙醛酸-琼脂糖固定化枯草芽孢杆菌壳聚糖酶相对活性的影响。
【数据】pH范围：原文图注未详述具体数值区间
图5显示了温度对游离和乙醛酸-琼脂糖固定化重组枯草芽孢杆菌壳聚糖酶相对活性的影响。
【数据】温度范围：原文图注未详述具体数值区间
图6显示了游离和固定化壳聚糖酶在55°C下的热抵抗性。符号为实验数据，连续线为对应模型拟合。
【数据】温度：55°C；分析方法：实验数据+模型拟合
图7展示了壳聚糖水解过程中游离和固定化壳聚糖酶催化下还原糖形成的时间过程曲线。
【数据】检测指标：还原糖形成量随时间变化
图8展示了尺寸排阻HPLC色谱图，突出显示选定反应时间下由游离（A）和固定化（B）壳聚糖酶产生的壳聚糖水解产物的低分子量区域。
【数据】分析方法：尺寸排阻HPLC；样品：游离酶和固定化酶水解产物
图9展示了动态光散射（DLS）监测的由(a)游离和(b)固定化壳聚糖酶催化的壳聚糖水解过程中粒径分布的时间演化。
【数据】分析方法：动态光散射（DLS）
图10展示了由游离（A）和固定化（B）枯草芽孢杆菌壳聚糖酶催化壳聚糖水解过程中产生的壳寡糖的代表性MALDI-TOF MS谱图。
【数据】分析方法：MALDI-TOF MS
图11展示了固定化壳聚糖酶在酸性条件（pH 4.5，55°C，每循环3小时）下连续十个壳聚糖水解循环中的可重复使用性。
【数据】pH：4.5；温度：55°C；循环时间：每循环3h；循环次数：10次
讨论与解读
原文讨论要点
本研究将重组枯草芽孢杆菌壳聚糖酶直接从培养上清液通过多点共价连接固定于乙醛酸活化琼脂糖上，获得了能够在酸性和中等高温条件下操作的稳健生物催化剂。固定化过程简单高效，在连接过程中保留了酶活，产生了具有最小活性损失的稳定固定化系统。直接从细胞培养上清液开发BSchito固定化方法，使其能够与用于固定化生物催化剂工程的微量滴定板筛选系统整合。
共价固定化显著改变了壳聚糖酶相对于其游离对应物的功能行为。固定化酶在酸性pH下表现出增强的活性和稳定性，能够在有利于壳聚糖溶解性的条件下操作，同时对温度变化的敏感性降低。这些效应与多糖基载体内多点连接诱导的酶刚性化一致。重要的是，固定化还对壳聚糖水解过程中的产物选择性产生了显著影响。MALDI-TOF质谱的分子水平分析表明，固定化壳聚糖酶有利于特定壳寡糖的积累和时间持久性——主要与DP2–DP4寡聚体相关。尺寸排阻HPLC显示游离和固定化酶在平均分子量降低方面相似，而动态光散射表明固定化加速了更窄、更稳定粒径分布的发展。
编译者解读
从合成生物学应用视角看，这项工作的巧妙之处在于用"载体工程"替代"蛋白工程"来实现产物谱调控——不改变酶的一级结构，仅通过多点共价固定化改变酶的微环境刚性与底物可及性，就同时解决了酸性稳定性、温度敏感性和产物分布一致性三个瓶颈。直接从培养上清液固定化省去了蛋白纯化步骤，与微量滴定板高通量筛选系统兼容，为固定化生物催化剂的定向进化式筛选提供了可行路径。值得关注的是，固定化对产物选择性的影响暗示了一个更深层的可能性：通过调控固定化密度或载体孔径，或许能实现对特定聚合度COS的"程序化"生产。局限在于，固定化酶在10次循环后的活性保持程度原文未详述，其工业级长期运行稳定性仍有待考察。该方法对其它聚合底物降解酶的固定化策略设计具有示范价值。
参考来源
Rodríguez-Núñez K. Glyoxyl-agarose immobilized Bacillus subtilis chitosanase as a reusable biocatalyst for modulated production of chitooligosaccharides. Carbohydrate Polymers, 2026. DOI: 10.1016/j.carbpol.2026.125824
DOI: 10.1016/j.carbpol.2026.125824