来源：Heterologous production of a temperature and pH-stable laccase from Bacillus vallismortis fmb-103 in Escherichia coli and its application（Process Biochemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
漆酶作为一种多铜氧化酶，在工业染料降解和废水生物修复中具有广阔应用前景。然而，真菌漆酶在高温和高pH条件下活性易衰减，限制了其工业化应用。本研究从 Bacillus vallismortis fmb-103 中克隆漆酶基因，在大肠杆菌 BL21(DE3) 中实现异源表达，通过优化自诱导发酵工艺参数（Cu²⁺添加时机、降温时机、发酵时长），使重组漆酶产量达到 3420 U/L，较 IPTG 诱导策略提高 6 倍。该酶具备优异的热稳定性和 pH 稳定性，并能有效降解孔雀石绿。
研究背景
漆酶（EC 1.10.3.2）属于多铜氧化酶家族，能够氧化多种芳香族底物并将分子氧还原为水。漆酶还可催化染料分解，在废水和污染土壤的生物修复中具有生物技术应用价值。漆酶最初在漆树中发现，随后在昆虫、植物、古菌和细菌中均有发现。多种真菌漆酶已被分离、表征并应用于染料去除，但真菌漆酶的活性在高温和高 pH 条件下通常衰减迅速。相比之下，细菌漆酶在 Cu²⁺ 抗性、热稳定性和 pH 耐受性方面具有优势，且不需要糖基化修饰。细菌漆酶可在大肠杆菌中过表达，其表达水平、稳定性和催化性能易于通过定向进化加以改善。尽管已有多种芽孢漆酶被纯化和表征，但其产量普遍较低。产量是酶应用的重要限制因素，在微生物系统中进行异源表达是克服这一障碍的有效手段。
研究方法
菌株与质粒
B. vallismortis fmb-103 为本实验室前期分离并表征的菌株。pMD 19-T 载体（TaKaRa Mirus Bio，大连，中国）和 pET-23a(+) 载体（Novagen，达姆施塔特，德国）分别用作克隆载体和表达载体。E. coli DH5α 和 E. coli BL21(DE3) 分别用作重组质粒的克隆宿主和表达宿主，均购自 Vazyme Biotech Co., Ltd.。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、2,2-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）、丁香醛连氮（SGZ）、乙酰丁香酮和孔雀石绿（MG）均购自 Sigma Aldrich（St. Louis, MO, USA）。Marker 和 NTA 琼脂糖柱购自 GenScript（南京，中国）。其余化学试剂均为标准试剂级。
【数据】菌株：B. vallismortis fmb-103、E. coli DH5α、E. coli BL21(DE3)；质粒：pMD 19-T、pET-23a(+)；试剂来源：Sigma Aldrich、GenScript
培养基
细菌菌株在 Luria–Bertani（LB）培养基中培养，其组成为：10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L 酵母提取物、10 g/L NaCl、2 g/L d-葡萄糖和 100 μg/mL 氨苄青霉素。重组细菌发酵采用 ZYM-5052 自诱导培养基，参照 Studier 等方法进行。所有表达研究均在含 100 mL 液体培养基的 500 mL 摇瓶中进行。
【数据】LB培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl、2g/L d-葡萄糖、100μg/mL氨苄青霉素；培养容器：500mL摇瓶含100mL培养基
来自 B. vallismortis fmb-103 的漆酶基因克隆
根据 GenBank 数据库中的 GQ184294 序列设计引物。正向引物 lac103-F: 5′-ATGACACTTGAAAAATTTGTGGATGC-3′，反向引物 lac103-R: 5′-TTATTTATGGGGATCAGTTATATCCATCGGTC-3′。PCR 扩增条件为 30 个循环：94°C 变性 50 s，55°C 退火 1 min，72°C 延伸 30 s，最后 72°C 延伸 10 min。PCR 产物经胶回收后连接到 pMD19-T 载体上，构建 pMD19-T-lac103，并在 3730 测序仪（GenScript Co. Ltd.，南京，中国）上进行测序。
【数据】PCR条件：94°C 50s变性、55°C 1min退火、72°C 30s延伸，30个循环，终延伸72°C 10min；测序平台：3730测序仪
漆酶基因的异源表达
为实现 lac103 基因的异源表达并利用 His 标签简化重组酶纯化步骤，设计了另一对引物。正向引物 E-lac103-F: 5′-GGATCC ATGACACTTGAAAAATTTGTGGATGC-3′（下划线为 BamHI 酶切位点），反向引物 E-lac103-R: 5′-GAGCTC TTATTTATGGGGATCAGTTATATCCATCGGTC-3′（下划线为 SacI 酶切位点）。PCR 扩增方法同前。纯化后的 PCR 产物通过 BamHI–SacI 酶切位点插入 pET-23a 载体中，构建 pET-23a-lac103。对所得质粒进行序列验证。将重组质粒 pET-23a-lac103 转化至 E. coli BL21(DE3) 感受态细胞中，挑取单菌落接种于 LB 培养基中，30°C、90 rpm 振荡过夜。取 1 mL 预培养液接种至含 100 mL LB 培养基（含氨苄青霉素）的 500 mL 摇瓶中。混合物在 37°C 旋转振荡培养。当细胞达到指数生长期（OD600 = 0.6）时，加入 IPTG（100 μg/mL）和 CuSO₄（0.25 mmol/L）诱导产酶，并于 16°C 培养 24 h。对于自诱导表达，分别在 OD600 = 0、OD600 = 0.3、OD600 = 0.6 和 OD600 = 0.9 时添加 CuSO₄（0.25 mmol/L），并将温度降至 16°C。同时研究了总发酵时间的影响。采用配备示差折光检测器的 Agilent 1200 HPLC 系统测定发酵液中的葡萄糖和乳糖浓度。色谱柱为 Aminex HPX-87H 离子排阻柱（Bio-Rad，美国），规格 300 × 7.8 mm，洗脱液为 H₂SO₄（5 mM），流速 0.6 mL/min，柱温 30°C。
【数据】IPTG诱导：OD600=0.6时加入IPTG 100μg/mL和CuSO₄ 0.25mmol/L，16°C培养24h；自诱导：CuSO₄ 0.25mmol/L于OD600=0、0.3、0.6、0.9时添加，降温至16°C；HPLC条件：Aminex HPX-87H柱，5mM H₂SO₄，流速0.6mL/min，30°C
重组酶的纯化
收获的细胞重悬于裂解缓冲液中，其组成为 50 mM 磷酸钾缓冲液（pH 6.0）、300 mL/L 甘油、3 mL/L Triton X-100 和 5 mM 咪唑，然后通过超声破碎。细胞碎片通过离心去除（8000 × g，15 min，4°C）。镍柱纯化方法：将可溶性组分分批上样至预先用裂解缓冲液平衡的 2 mL 镍离子 NTA 琼脂糖柱上。目标蛋白用 100–150 mM 咪唑洗脱。收集活性组分，并对 10 mM 磷酸钾缓冲液（pH 6.0）透析。通过 SDS-PAGE 监测重组漆酶（fmb-rL103）的产量和纯度。为简化纯化步骤，将洗脱液加热并对硫酸铵透析。研究了不同加热条件和不同硫酸铵浓度的影响。同时研究了先加热后硫酸铵沉淀（H/AS）和先硫酸铵沉淀后加热（AS/H）两种方法。
【数据】裂解缓冲液：50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)、300mL/L甘油、3mL/L Triton X-100、5mM咪唑；离心：8000×g、15min、4°C；镍柱：2mL NTA琼脂糖柱，100–150mM咪唑洗脱
酶活测定
漆酶活性在 45°C 下以 ABTS 和 SGZ 为底物进行测定。ABTS（1 mM）的氧化在 420 nm 处测定（ε₄₂₀ = 36,000 M/cm），反应缓冲液为 0.1 M 柠檬酸-磷酸缓冲液。SGZ（0.1 mM）的氧化在 525 nm 处检测（ε₅₂₅ = 65,000 M/cm），缓冲液为 0.1 M 柠檬酸-磷酸缓冲液。一个酶活单位（U）定义为每分钟氧化 1 μmol 底物所需的酶量。所有测定均进行三次重复。
【数据】ABTS浓度：1mM，检测波长420nm，ε₄₂₀=36,000M/cm；SGZ浓度：0.1mM，检测波长525nm，ε₅₂₅=65,000M/cm；温度：45°C；缓冲液：0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液
纯化重组酶的生化表征
纯化的 fmb-rL103 在不同温度（30–90°C）下以 ABTS 为底物（pH 5.0）测定活性。为研究温度稳定性，将酶液在三个温度（70、80 和 90°C）下保温 10 h，然后以 ABTS 为底物测定残余活性。最适 pH 在 45°C 下测定：以 ABTS 为底物，使用 0.1 M 柠檬酸-磷酸缓冲液（pH 2.0–7.0）；以 SGZ 为底物，使用 0.1 M Tris-HCl 缓冲液（pH 7.0–9.0）。fmb-rL103 的 pH 稳定性通过在 4°C 下、pH 3.0、7.0 和 8.0 条件下保温漆酶来测定，随后以 ABTS 为底物测定残余活性。抑制剂和金属离子对 fmb-rL103 活性的影响通过酶活测定法在 pH 5.0 下以 ABTS 为底物进行评价。底物特异性在各底物的最大吸收波长下测定。动力学参数在 45°C 下、不同浓度 ABTS（5–500 μM，pH 5.0）和 SGZ（1.25–50 μM，pH 7.4）条件下测定。所有测量均进行三次重复。
【数据】温度范围：30–90°C；温度稳定性：70/80/90°C保温10h；pH范围：ABTS底物pH 2.0–7.0，SGZ底物pH 7.0–9.0；pH稳定性：4°C、pH 3.0/7.0/8.0；动力学参数：ABTS 5–500μM (pH 5.0)，SGZ 1.25–50μM (pH 7.4)
降解实验
在存在或不存在介体（ABTS、乙酰丁香酮和丁香醛，浓度均为 0.1 mM）的条件下，测试 fmb-rL103 对 MG 的降解能力。酶促反应在 0.1 M 柠檬酸-磷酸缓冲液（6 mL）中进行，pH 值分别为 4.0、5.0 和 6.0，体系中含 MG（50 mg/L）和 fmb-rL103（800 mU/mL）。在 37°C 保温 24 h 或 84°C 保温 6 h 后，基于 617 nm 处吸光度的下降，通过分光光度法测定 MG 降解率。脱色活性按以下公式计算：
% 脱色率 = [(I − F)/I] × 100
其中 F 为脱色后培养基的吸光度，I 为初始吸光度。所有实验均进行三次重复。
【数据】介体浓度：0.1mM；MG浓度：50mg/L；酶量：800mU/mL；缓冲液体积：6mL；pH：4.0/5.0/6.0；条件：37°C 24h 或 84°C 6h；检测波长：617nm
研究结果
fmb-rL103 的异源生产
PCR 获得约 1.5 kb 的产物。该 DNA 序列含有一个 1542 bp 的开放阅读框，编码 513 个氨基酸的蛋白质，已提交 GenBank，登录号为 KC859464。来自 B. vallismortis 菌株 fmb-103 的漆酶基因（fmb-L103）被插入 pET-23a 的 T7 启动子序列下游，并转化至 E. coli BL21(DE3) 细胞中。重组漆酶通过工程化大肠杆菌在 LB 和自诱导培养基中生产。在 LB 培养基中，产量为 518 U/L，比活力为 74.26 mU/mg。当使用自诱导培养基，仅在 OD600 = 0.6 时添加 Cu²⁺，并在 16°C 低温条件下，产量达到 1580 U/L，比活力为 86.95 mU/mg。该结果表明自诱导优于 IPTG 诱导表达策略，与已有报道一致。有报道指出，当 BL21(DE3) 在 ZYM-5052 自诱导培养基中生长时，培养物可达到显著更高的细胞密度，系统总产量较传统 IPTG 诱导提高 1.5 倍。Chen 等也报道，采用自诱导发酵策略时，重组胞外普鲁兰酶活性提高至 4.2 U/mL，36 h 时细胞生物量达 7.95 g DCW/L。
为进一步提高 fmb-rL103 的产量，对自诱导工艺参数进行了研究。Cu²⁺ 是表达有活性重组漆酶所必需的，但对大肠杆菌细胞也有害。大肠杆菌中铜稳态的调控已有分析，因此 Cu²⁺ 的添加时间点是影响重组漆酶产量的重要自诱导工艺参数。诱导温度可影响异源基因在大肠杆菌中的表达。一般而言，重组大肠杆菌在低温下生长可通过防止包涵体（IBs）形成来提高重组蛋白的可溶性，但同时会导致细胞生长和蛋白表达变慢。高温生长可获得较高的生物量，但由于蛋白表达速率过高，重组酶通常会形成包涵体。因此，温度控制是自诱导生产重组漆酶的另一个重要参数。本研究采用两阶段温度控制策略以进一步提高产量。有研究发现，在添加 IPTG 后温度从 37°C 降至 25°C 对改善戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶（GLA）的表达也至关重要。
在本研究中，在 OD600 = 0.3 时添加 Cu²⁺，并在 OD600 = 0.9 时改变温度，获得了最高的 fmb-rL103 产量。虽然在 OD600 = 1.2 时改变温度可获得更大的细胞生物量，但酶活性和比活力略低。异源蛋白表达在基因表达诱导后增加，并在一定发酵时间后达到最高产量。延长表达时间可获得更高的生物量，但会降低蛋白质产量。最大化蛋白质表达并最小化表达时间是理想的，因为长时间表达会增加工艺成本，并可能因胞内蛋白酶的意外蛋白水解而降低产物产量。因此，发酵时间作为第三个自诱导工艺参数，通过测定重组漆酶产量和细胞生物量进行了研究。
如图 1(a) 所示，fmb-rL103 的产量在培养 50 h 后达到最大值 3420 U/L，比活力为 100.31 mU/mg。图 1(b) 显示，即使在 50 h 后，生物量仍随发酵时间的延长而持续增加。根据细胞生长速率的变化，将自诱导发酵过程分为 3 个阶段，并分析了培养基中碳源葡萄糖和乳糖的浓度变化。第一阶段约为 0–5 h，葡萄糖被快速利用，但乳糖利用率很低。在此期间，细胞生长速率最快，但检测不到漆酶活性。第二阶段约为 5–30 h，葡萄糖被完全消耗，细菌开始利用乳糖。在 5–10 h 期间，乳糖消耗速率非常快，随后减慢。半乳糖作为乳糖代谢产物之一，可诱导由 T7 启动子控制的漆酶基因表达，胞内漆酶活性在 10 h 时被检测到。同时，由于异源蛋白在体内的积累，细胞生长速率开始减慢。30 h 后的发酵过程属于第三阶段。在此阶段，乳糖利用率很低，细胞生长速率进一步降低。但细胞内的重组漆酶快速积累，并在 50 h 达到最大值。因此，从上述结果推测，使用自诱导发酵策略时，重组细胞生物量和重组蛋白产量应受葡萄糖与乳糖浓度及其比例的影响，相关研究正在进行中。
迄今为止，已有多个漆酶基因被克隆并异源表达。重组漆酶的活性大多在数百 U/L 左右（以 ABTS 测定）。在本研究中，通过控制自诱导发酵工艺参数——包括添加铜和降低发酵温度的时间点以及总发酵时间——最终产量达到 3420 U/L。该值比 IPTG 诱导策略（518 U/L）高出 6 倍，也高于此前报道的数值。这些结果也为在大肠杆菌中提高其他酶的异源产量提供了参考。
【数据】LB培养基产量：518 U/L，比活力74.26mU/mg；自诱导产量：1580 U/L（OD600=0.6加Cu²⁺，16°C），比活力86.95mU/mg；最高产量：3420 U/L（50h），比活力100.31mU/mg；基因：ORF 1542bp，编码513个氨基酸；GenBank登录号：KC859464
重组漆酶的纯化
在优化条件下表达 fmb-rL103 后，收集细胞并通过超声裂解。由于 fmb-rL103 具有热稳定性，采用加热（70°C，10 min）与硫酸铵沉淀（50–60%）相结合的方法进行纯化。如表 2 所示，先加热后硫酸铵沉淀（H/AS）方法比先硫酸铵沉淀后加热（AS/H）方法获得更高的比活力和回收率。粗酶液中含有大量杂蛋白，比活力为 100.31 mU/mg 蛋白。采用 H/AS 方法，酶被纯化 4.47 倍，最终回收率为 26.45%。以 ABTS 为底物，最终酶制剂的比活力估计为 448.63 mU/mg 蛋白，高于 fmb-L103 的 389.9 mU/mg。单独加热或单独硫酸铵沉淀均不能实现酶的纯化。采用镍柱纯化方法（Ni-NTA），酶被纯化 3.38 倍，最终回收率为 13.05%。以 ABTS 为底物，最终酶制剂的比活力估计为 338.79 mU/mg 蛋白。
经 H/AS 和 Ni-NTA 方法纯化后，通过 SDS-PAGE 在 70 kDa 处电泳出特异性条带（图 2）。作为一种亲和纯化方法，镍柱纯化可以纯化带有六个组氨酸标签的异源蛋白。柱材料成本较高，但可重复使用。然而，该方法难以应用于大规模工业生产。此外，六个组氨酸标签可能影响酶的性质。热处理可以去除许多杂蛋白，有助于后续的变性纯化。Koschorreck 等人将上清液在 70°C 加热 15 min……
【数据】H/AS纯化：纯化倍数4.47倍，回收率26.45%，比活力448.63mU/mg蛋白；AS/H法比活力较低；Ni-NTA纯化：纯化倍数3.38倍，回收率13.05%，比活力338.79mU/mg蛋白；SDS-PAGE条带：70kDa
温度和 pH 对酶活性和稳定性的影响
图 3 显示了温度对 fmb-rL103 活性和稳定性的影响。以 ABTS 为底物、pH 4.8 条件下测定：图 3(a) 为不同温度（30–90°C）下的漆酶活性；图 3(b) 为保温 0–10 h 后的残余活性。
图 4 显示了 pH 对 fmb-rL103 在 45°C 下活性和稳定性的影响。图 4(a)：ABTS 底物，pH 2.0–7.0；SGZ 底物，pH 7.0–9.0。图 4(b)：ABTS 底物，pH 3.0、7.0 和 8.0。
【数据】温度范围：30–90°C；pH范围：ABTS底物pH 2.0–7.0，SGZ底物pH 7.0–9.0；pH稳定性测试：pH 3.0/7.0/8.0
孔雀石绿降解
图 5 显示了 pH 和介体对 MG 脱色效率的影响。图 5(a)：37°C、24 h 条件；图 5(b)：84°C、6 h 条件。编号说明：1. MG + fmb-rL103；2. MG + ABTS + fmb-rL103；3. MG + 乙酰丁香酮 + fmb-rL103；4. MG + 丁香醛 + fmb-rL103。图 5(c) 显示了 fmb-rL103 对 MG 降解的动力学。
【数据】MG浓度：50mg/L；酶量：800mU/mL；介体浓度：0.1mM；条件：37°C 24h 或 84°C 6h；pH：4.0/5.0/6.0
讨论与解读
本研究从 B. vallismortis 菌株 fmb-103 中克隆了漆酶基因，并通过自诱导表达策略在重组大肠杆菌中实现了高效表达。通过控制自诱导工艺参数，重组漆酶产量得到显著提升。加热与硫酸铵沉淀相结合的纯化方法更适合工业化生产。fmb-rL103 具有较高的最适温度和良好的热稳定性，同时具备 pH 稳定性，尤其在酸性 pH 条件下表现优异。fmb-rL103 对 MG 的降解能力使其成为水产养殖废水中生物修复应用的候选酶。
编译者解读：该研究的核心价值在于系统优化了自诱导发酵的三项关键参数——Cu²⁺添加时机、降温时机和发酵时长，而非仅停留在基因克隆层面。这种工艺优化思路对合成生物学中酶制剂的规模化生产具有直接借鉴意义。值得注意的是，作者选择热稳定性芽孢杆菌来源的漆酶并在大肠杆菌中表达，巧妙规避了真菌漆酶热稳定性差和糖基化需求的瓶颈。H/AS 纯化法（加热+硫酸铵沉淀）替代镍柱亲和层析的策略也颇具工程思维——在保证纯化效果的同时大幅降低成本，更贴近工业应用场景。然而，该酶对 MG 的降解实验仍处于游离酶水平，未来若能与固定化技术或全细胞催化结合，其应用潜力或将进一步释放。原文未详述该酶对其他类型染料的降解谱，这可能是后续研究值得拓展的方向。
参考来源
Sun, J. (2017). Heterologous production of a temperature and pH-stable laccase from Bacillus vallismortis fmb-103 in Escherichia coli and its application. Process Biochemistry. DOI: 10.1016/j.procbio.2017.01.030
DOI: 10.1016/j.procbio.2017.01.030