来源：Light-induced adaptive laboratory evolution enhances bioactive aromatic amino acid-derived compound profile in a wine strain of Saccharomyces cerevisiae（Food Microbiology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
芳香氨基酸衍生化合物（AADCs）如酪醇、色醇、2-苯乙醇及褪黑素等吲哚类化合物，对葡萄酒品质与稳定性具有重要贡献。本研究以白光照射为选择压力，对一株葡萄酒酿酒酵母B28进行适应性实验室进化（ALE），经170代培养后获得进化菌株EVO。多组学分析显示，EVO菌株在基因组、转录组和代谢组层面发生显著改变，AADC产量大幅提升。该策略为食品工业提供了一种无需基因修饰的菌株改良新路径。
研究背景
发酵食品与饮料中的生物活性分子与微生物代谢密切相关，酵母是合成这些健康促进化合物的主要贡献者。芳香氨基酸衍生化合物（AADCs）——包括色醇（TOL）、2-苯乙醇（2PE）、酪醇，以及由色氨酸衍生的吲哚类化合物如褪黑素（Mel）、血清素和3-吲哚乙酸（3IAA）——对葡萄酒等发酵饮品的品质与稳定性具有重要影响。这些化合物所具备的抗氧化、抗菌、防腐及健康促进作用，在发酵产品中备受重视。获取能够提高终产品中这些化合物浓度的酵母菌株，对葡萄酒及其他食品工业具有重要意义。近期研究已通过构建不同酵母种间的联合体，在葡萄酒发酵中显著提升了生物活性色氨酸衍生化合物的含量。然而，通过非基因修饰手段改良酵母菌株、使其高效合成这些目标化合物，仍是该领域面临的挑战。
研究方法
2.1 酵母菌株与培养基
本研究所用酿酒酵母菌株B28于2019年分离自西班牙Bodegas Murviedro酒庄（雷克纳）发酵罐——“博巴尔”葡萄汁工业发酵末期，采用线粒体DNA方法进行基因分型。预培养使用YPD培养基，含酵母提取物10 g·L⁻¹、细菌学蛋白胨20 g·L⁻¹及葡萄糖20 g·L⁻¹。进化实验使用合成极限培养基（SMM），含7.5 g·L⁻¹葡萄糖、5 g·L⁻¹ (NH₄)₂SO₄、3 g·L⁻¹ KH₂PO₄、0.5 g·L⁻¹ MgSO₄、1 mL·L⁻¹维生素溶液、1 mL·L⁻¹微量元素溶液，pH用NaOH调至6。维生素溶液含2 g·L⁻¹肌醇、0.15 g·L⁻¹泛酸钙、0.025 g·L⁻¹盐酸硫胺素、0.2 g·L⁻¹烟酸、0.025 g·L⁻¹吡哆醇及0.3 mg·L⁻¹生物素。微量元素溶液含4 g·L⁻¹ MnSO₄·H₂O、4 g·L⁻¹ ZnSO₄·7H₂O、1 g·L⁻¹ CuSO₄·5H₂O、1 g·L⁻¹ KI、0.4 g·L⁻¹ CoCl₂·6H₂O、1 g·L⁻¹ H₃BO₃及1 g·L⁻¹ (NH₄)₆Mo₇O₂₄。96孔板生长测定使用SD培养基（20 g·L⁻¹葡萄糖、1.7 g·L⁻¹无氨基酸YNB（Difco）、5 g·L⁻¹ (NH₄)₂SO₄）、SC培养基（20 g·L⁻¹葡萄糖、1.7 g·L⁻¹无氨基酸YNB、5 g·L⁻¹ (NH₄)₂SO₄及2 g·L⁻¹ SC完全 dropout（Formedium））和YPG培养基（10 g·L⁻¹酵母提取物、20 g·L⁻¹蛋白胨、30 mL甘油）。进化菌株与对照菌株的发酵能力采用Riou等（1989）来源的合成葡萄汁（SM）进行评估，以模拟葡萄酒发酵。SM组成为：糖类（100 g·L⁻¹葡萄糖和100 g·L⁻¹果糖）、有机酸（柠檬酸、苹果酸、酒石酸）、矿物盐（0.75 g·L⁻¹ KH₂PO₄、0.5 g·L⁻¹ K₂SO₄、0.25 g·L⁻¹ MgSO₄·7H₂O、0.15 g·L⁻¹ CaCl₂·2H₂O、0.20 g·L⁻¹ NaCl和0.46 g·L⁻¹ NH₄Cl）、13.09 mL·L⁻¹氨基酸储备液（1.5 g·L⁻¹酪氨酸、13.4 g·L⁻¹色氨酸、2.5 g·L⁻¹异亮氨酸、3.4 g·L⁻¹天冬氨酸、9.2 g·L⁻¹谷氨酸、28.3 g·L⁻¹精氨酸、3.7 g·L⁻¹亮氨酸、5.8 g·L⁻¹苏氨酸、1.4 g·L⁻¹甘氨酸、38.4 g·L⁻¹谷氨酰胺、11.2 g·L⁻¹丙氨酸、3.4 g·L⁻¹缬氨酸、2.4 g·L⁻¹甲硫氨酸、2.9 g·L⁻¹苯丙氨酸、6 g·L⁻¹丝氨酸、2.6 g·L⁻¹组氨酸、1.3 g·L⁻¹赖氨酸、1.5 g·L⁻¹半胱氨酸、46.1 g·L⁻¹脯氨酸）、10 mL·L⁻¹维生素溶液和1 mL·L⁻¹微量元素溶液。pH用NaOH调至3.3。对照菌株（B28无光培养）及其光照进化版本（EVO）接种于80 mL SM中，在带有气锁阀的发酵瓶中培养，28°C、200 rpm轨道振荡，监测失重直至稳定。
【数据】菌株：B28（酿酒酵母）；培养基：YPD、SMM、SD、SC、YPG、SM；葡萄糖浓度：YPD 20 g·L⁻¹、SMM 7.5 g·L⁻¹、SM 100 g·L⁻¹；温度：28°C；转速：200 rpm；pH：SMM 6、SM 3.3
2.2 白光胁迫下的适应性实验室进化
B28菌株以白光为选择压力进行ALE。光源为覆盖400至700 nm PAR波段的白色LED灯。平行设置B28在无白光条件下的同等培养作为对照（“CONTROL”）。批次培养在28°C下进行，使用两个0.5 L反应器（MiniBio，Applikon Biotechnology），工作体积为0.4 L SMM培养基。培养温度通过连接Peltier低温恒温器的温度探头控制。搅拌器设定为300 rpm。两个生物反应器初始接种约2×10⁶ cells·mL⁻¹的B28菌株（来自YPD培养基中过夜生长的预培养物）。其中一个反应器用白色JARO LED灯（Brennenstuhl®，蒂宾根，德国）照明，初始辐照度为317 μmol·m⁻²·s⁻¹，灯距容器16 cm——该距离对酵母生长有明显抑制作用。对照反应器除光照刺激外条件相同。当培养物达到稳定期时，反应器去除约90%耗竭培养基并补充新鲜培养基。在每批开始和结束时记录600 nm光密度（OD₆₀₀），根据公式 g = (log(终OD) − log(初始OD)) / log(2) 估算世代数（g）。初始剂量（317 μmol·m⁻²·s⁻¹）的选择压力使受胁迫群体出现生长缺陷，生长速度低于未受胁迫群体。随着细胞因适应而缩短倍增时间，辐照度在不同批次间逐步提高，直至达到3377 μmol·m⁻²·s⁻¹（对应灯距容器4 cm），同时仍允许细胞生长。约170代后结束进化实验。收集两个反应器中的细胞，涂板后每个反应器挑取3个独立菌落进行培养和甘油保藏。每个反应器选1个菌落进行全基因组测序。转录组和代谢组分析使用每个反应器的3个独立菌落，分别代表进化群体和对照群体的独立衍生株。
【数据】光强范围：317→3377 μmol·m⁻²·s⁻¹；光源距离：16 cm→4 cm；世代数：约170代；接种量：2×10⁶ cells·mL⁻¹；工作体积：0.4 L；温度：28°C；转速：300 rpm；培养基更换：去除约90%耗竭培养基
2.3 生长曲线分析
所有生长曲线均来自96孔微量滴定板培养。每孔加入250 μL不同培养基和条件，初始OD₆₀₀为0.1，由过夜预培养物接种。通过记录OD₆₀₀增加值监测生长曲线。微量滴定板在SPECTROstar Nano®酶标仪（BGM Labtech，奥芬堡，德国）中培养，温度分别为28°C、20°C或12°C，500 rpm双轨道振荡。每30分钟测量各孔OD₆₀₀，直至生长达到稳定期。各菌株在不同培养基/条件下的生长参数通过将OD₆₀₀测量值对时间直接拟合至Zwietering等（1990）提出的Gompertz方程计算，表达式为：y = ln(ODt/OD0)，其中OD0为初始OD，ODt为时间t时的OD；D = ln(OD∞/OD0)为OD值（OD∞为渐近最大值），μmax为最大比生长速率（h⁻¹），λ为迟滞期。使用R软件（v4.1.3）将生长数据拟合至Gompertz方程并推断生长参数。曲线下面积（AUC）——代表三个主要生长参数：迟滞期、μmax和最大群体量（产量）——使用Origin Pro 2019计算。
【数据】培养基体积：250 μL/孔；初始OD₆₀₀：0.1；培养温度：28°C/20°C/12°C；振荡：500 rpm双轨道；测量间隔：30 min；拟合模型：Gompertz方程（Zwietering等，1990）
2.4 流式细胞术测定胞内活性氧（ROS）
在丰富YPD培养基中过夜生长后，按Ballester-Tomás等（2015）所述方法测定新鲜接种酵母细胞的胞内ROS水平。简要步骤：CONTROL和EVO菌株的培养细胞离心后重悬于无菌PBS中至OD₆₀₀ = 0.25。然后从2.5 mg·mL⁻¹乙醇储备液中加入二氢罗丹明123（DHR 123，Sigma），终浓度为5 μg·mL⁻¹细胞培养物。细胞在黑暗中于28°C孵育90分钟。随后收集细胞、洗涤、重悬于PBS中，使用流式细胞仪MACSQuant® Analyzer（Miltenyi Biotec，马德里，西班牙）进行分析。使用阴性对照（未经DHR 123处理的细胞）和阳性对照（用4 mmol·L⁻¹ H₂O₂处理60分钟并经DHR 123染色的细胞）调整设置。数据表示为显示DHR 123阳性染色的细胞百分比，每次运行测量10000个细胞。
【数据】DHR 123浓度：5 μg·mL⁻¹；储备液浓度：2.5 mg·mL⁻¹（乙醇）；孵育：28°C、90 min、黑暗；阳性对照：4 mmol·L⁻¹ H₂O₂、60 min；测量细胞数：10000个/次；OD₆₀₀：0.25
2.5 基因组DNA提取
酵母基因组DNA从1-5 mL正常YPD培养物中按Querol等（1992）所述方法提取。简要步骤：将预培养物中的细胞沉淀，用无菌水洗涤两次，重悬于0.5 mL缓冲液1（0.9 mol·L⁻¹山梨醇、0.1 mol·L⁻¹ EDTA pH 7.5）中，加入30 μL Zimolyase（amsbio），温和混匀后于37°C孵育30 min。原生质球以15000 × g离心3 min，重悬于缓冲液……（原文后续内容未在节选中提供）
【数据】缓冲液1：0.9 mol·L⁻¹山梨醇、0.1 mol·L⁻¹ EDTA pH 7.5；Zimolyase：30 μL；孵育：37°C、30 min；离心：15000 × g、3 min
研究结果
3.1 光照诱导胁迫下的进化
由于该葡萄酒菌株的来源及其在酿酒过程中曾经历完整工业发酵而未被完全取代的事实，预期其对恶劣环境和氧化胁迫具有较强抗性。但值得注意的是，即使在初始辐照度317 μmol·m⁻²·s⁻¹下，B28的生长也受到严重影响。因此，辐射最初以17小时间隔施加，使细胞能在黑暗中部分恢复并最终达到稳定期。经过170代后，EVO菌株能够在比初始水平高10倍的辐照度下生长。相比之下，CONTROL菌株在无光条件下培养了相同世代数，却完全无法在这些光照条件下生长。这表明EVO菌株因其与CONTROL菌株的遗传差异，能够适应白光照射的强选择压力。作为实验进程的追踪，记录了每批发生的世代数和每批接受的辐射剂量（图1）。该选择压力所产生的巨大效应凸显了其作为严重胁迫因子的潜力。在进化实验期间，随着胁迫条件下的生长逐渐接近平行运行于未照射反应器中的非胁迫对照，辐照度逐步增加至最高3377 μmol·m⁻²·s⁻¹。如ALE早期阶段所观察到的，承受约70 mol·m⁻²光子的细胞在一批中倍增3至5次，而在最终阶段细胞倍增4至5次，但承受约290 mol·m⁻²的累积辐射（图1）。
【数据】初始辐照度：317 μmol·m⁻²·s⁻¹；最终辐照度：3377 μmol·m⁻²·s⁻¹（10倍）；世代数：170代；累积辐射：早期约70 mol·m⁻²、最终约290 mol·m⁻²；倍增次数：早期3-5次、最终4-5次
3.2 ALE产生的表型特征
ALE过程中获得的明显白光抗性使EVO菌株能够在亲本B28或CONTROL菌株无法生长的辐射条件下生长。本研究旨在进一步探索表型差异特征，特别是与EVO菌株相比CONTROL菌株的代谢谱相关的特征，以及影响生长参数、氧化胁迫抗性和发酵性能的其他特征。已知光照诱导的胁迫会产生胞内ROS增加，影响生长以及参与氧化胁迫应答的基因表达（Bodvard等，2017；Robertson等，2013）。为评估氧化胁迫下的生长性能，CONTROL和EVO菌株在96孔板中于不同培养基和条件下培养。当菌株使用与定向进化批次相同的培养基和温度生长时，EVO菌株表现与CONTROL菌株相似，但存在显著延迟，如生长曲线所示（图2A），并间接反映在曲线下面积（AUC）参数中（图2C）。与预期相反，当细胞用3 mM过氧化氢增加氧化胁迫时，未观察到EVO相比CONTROL的生长改善（图2B）。事实上，EVO菌株对H₂O₂表现出更高的敏感性，与对照菌株相比生长延迟非常明显。
为部分界定EVO菌株生长较慢的原因，使用流式细胞仪通过测定非胁迫培养物中DHR123阳性细胞的丰度来测量胞内ROS水平。令人惊讶的是，在相同无胁迫条件下，EVO菌株表现出显著高于CONTROL的DHR123阳性细胞比例（图2D）。这些默认胞内ROS水平的差异可以解释EVO菌株生长较慢的现象——进化细胞正在应对对照细胞所没有的基础氧化胁迫，而当培养基中受到更多氧化胁迫挑战时情况会加剧。这些结果似乎与进化实验后预期应产生氧化胁迫适应不一致——尽管白光对亲本菌株是严重的生长抑制胁迫，且已知其具有产生ROS的作用，进化菌株似乎并未对氧化胁迫更具抗性，反而更敏感。
需要指出的是，这种较慢的生长在其他生长测定中也一致出现，即不同培养基如SD、SC和YPG，以及不同温度如28°C、20°C和12°C（数据未显示）。尽管如此，在不同胁迫下的进一步生长测试可能有助于确定EVO菌株在生长性能方面除光照下表现出的适应性之外的潜在优势。
通过测试EVO菌株在合成葡萄汁（SM）上的发酵能力，评估了其用于葡萄酒发酵的潜在用途。虽然SM不能完全复制天然葡萄汁中的化学复杂性和微生物互作，但它提供了高度受控和可重复的环境来评估菌株的内在发酵能力（Viana等，2014），气锁阀的使用允许CO₂释放同时阻止氧气进入，模拟了葡萄酒发酵中典型的半厌氧条件。尽管EVO菌株比CONTROL菌株更慢地完成发酵（图S2），它仍能完全消耗可用糖分并到达发酵终点。这表明其发酵能力保持胜任，为未来葡萄酒生产应用开辟了可能性。
除光照诱导ALE产生的上述效应外，在光照胁迫条件下于SMM中生长的EVO菌株培养物还观察到有趣的视觉特征。这些差异包括在光照胁迫下生长时细胞呈现可见的棕色色素沉着，以及液体培养中初期的细胞聚集（图S3）。这两种表型特征仅在光照诱导胁迫生长后出现，且色素沉着似乎被细胞保留。无细胞的SMM平行照射后未观察到颜色变化，保持透明。
【数据】H₂O₂浓度：3 mM；培养温度：28°C/20°C/12°C；培养基：SD、SC、YPG、SMM；发酵底物：SM（100 g·L⁻¹葡萄糖+100 g·L⁻¹果糖）
3.3 代谢组学分析
鉴于EVO菌株相比CONTROL菌株在生长性能、细胞聚集、色素沉着和氧化还原状态方面呈现的明显表型特征，对两种菌株进行了代谢组学分析，同时分析胞外和胞内组分。两种菌株均在黑暗中生长，另外EVO菌株还在白光下生长。该实验设计产生三个不同的样品组：CONTROL、EVO和EVO在白光胁迫下生长（以下称“LIGHT”），同时分析上清液和胞内提取物。使用反相UPLC-ESI(+/-)-QqTOF-MS/MS进行非靶向代谢组分析，同时额外进行吲哚类化合物的靶向UPLC-MSMS分析以获得更好的代谢组覆盖度。
胞外基质分析的初始数据预处理共鉴定出3958个特征。在三组样品之间进行提取化合物和片段的配对比较，CONTROL与EVO之间的比较显示比其他任何比较都多的差异代谢物，产生1009个差异特征，其中934个为该比较所独有（图3）。这些结果表明EVO菌株通过ALE过程被深度修饰，导致进化菌株默认状态下代谢状态改变，表现为独特的代谢组。尽管EVO和CONTROL菌株在各种培养基中的生长差异不太显著，但每个菌株……
【数据】鉴定特征总数：3958个；CONTROL vs EVO差异特征：1009个；独有差异特征：934个
3.4 芳香氨基酸代谢通路分析
（原文节选在3.3后中断。根据图表清单中的图5图注，此部分涉及芳香氨基酸代谢通路中相关代谢物的变化分析。）
【数据】原文未详述
3.5 基因组与转录组分析
（根据图表清单，此部分涉及SNP分布分析和差异表达基因的功能富集分析。）
【数据】原文未详述
讨论与解读
获得能够在葡萄酒或其他发酵饮品中提高生物活性化合物含量的新酵母菌株具有重要价值。近期葡萄酒中血清素、褪黑素等AADC或其衍生物的发现及其归因于酵母代谢，推动了寻找有效方法以提升酵母增加这些有趣化合物含量的能力。酵母中一些最受关注的化合物如羟基酪醇、褪黑素或血清素的生物合成途径仍属未知，采用非基因修饰方法增加了选择刺激物以推动酵母代谢朝向其合成的难度。
本研究以白光照射这一新型选择压力对葡萄酒酵母进行ALE实验，通过光氧化产生胁迫。已有报道表明可见光通过抑制呼吸和产生活性氧来改变酵母代谢节律，从而上调氧化胁迫应答（Robertson等，2013）。经过170代，定向进化菌株能够在比亲本菌株生长受抑制剂量高10倍的PAR辐射剂量下有效生长，揭示了对该胁迫的明确适应。与预期相反，对光氧化的适应似乎并未提高菌株在H₂O₂挑战下的氧化胁迫适应性。然而，代谢组学分析揭示了EVO菌株芳香氨基酸衍生化合物产量的显著提升，这为利用非基因修饰策略改良食品工业酵母菌株提供了新的可能性。
编译者解读
该研究以白光照射作为非基因修饰的进化压力，巧妙地将光氧化胁迫与酵母吲哚类抗氧化产物的合成联系起来——光胁迫诱导ROS，而ROS刺激非酶促抗氧化应答，恰与芳香氨基酸衍生化合物的生物合成交汇。方法学上，逐步提升辐照度的ALE策略有效筛选出高耐受性菌株，多组学联用（基因组、转录组、代谢组）为解析进化机制提供了完整视角。值得注意的是，EVO菌株虽对光胁迫适应良好，却对H₂O₂更敏感，提示光适应与通用氧化胁迫适应之间存在路径差异。该策略的价值在于其非转基因属性——对法规敏感的食品工业而言，ALE获得的菌株更易获得应用许可。局限在于进化菌株生长偏慢可能影响工业化效率，后续可探索进化条件优化或与发酵工艺参数协同调控。
参考来源
Bisquert, R. Light-induced adaptive laboratory evolution enhances bioactive aromatic amino acid-derived compound profile in a wine strain of Saccharomyces cerevisiae. Food Microbiology, 2026. DOI: 10.1016/j.fm.2026.105295
DOI: 10.1016/j.fm.2026.105295