来源：Elucidating molecular mechanism of PA1136 family transcriptional regulator in bacterial cellulose biosynthesis by Novacetimonas cocois WE7 through multi-omics approaches（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
细菌纤维素（BC）因其高纯度、高结晶度和优异机械性能而备受关注，但工业规模生产中产量限制与结构调控难题仍待解决。本研究以分离自变质椰奶的新菌株Novacetimonas cocois WE7为对象，揭示了PA1136家族转录调控因子在不同pH条件下对BC生物合成的动态调控作用。通过基因过表达与CRISPRi沉默菌株的构建，结合转录组学与代谢组学分析，阐明了PA1136介导的多层级调控网络，为工程化高产BC菌株提供了新靶点。
研究背景
细菌纤维素是由微生物发酵合成的纳米级葡聚糖聚合物，凭借高结晶度、高纯度、出色的保水能力和机械强度，在伤口愈合支架、食品增稠剂及生物传感器基底等领域具有广阔应用前景。然而，工业规模BC生产长期受限于产量不足和结构控制困难，促使研究者深入探究纤维素合成基因的调控网络。Novacetimonas cocois WE7（原Komagataeibacter cocois WE7）是从变质椰奶中分离的新型菌株，其BC合成调控机制尚不清楚。在细菌环境适应研究中，双组分系统（TCSs）通过组氨酸激酶与响应调节子之间的磷酸化级联介导信号转导。结构表征揭示，PA1136家族调控蛋白表现出非典型TCS特征：含N端跨膜结构域（TM，残基1–19）、C端LuxR型螺旋-转角-螺旋（HTH）DNA结合域（残基170–235）及中央结构域。本研究旨在系统解析PA1136在酸性胁迫下调控BC生物合成的分子机制。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
Novacetimonas cocois WE7T（CGMCC 1.15338T = JCM31140T），此前自变质椰奶中分离，在静态Hestrin-Schramm（HS）培养基（pH 4.5）、30°C条件下保藏。克隆宿主Escherichia coli DH5α在Lysogeny Broth（LB）培养基中、37°C条件下培养，需要时添加100 μg/mL氯霉素（生工生物，中国）。固体培养基添加15 g/L细菌琼脂（生工生物，中国）。本研究所用全部微生物菌株与重组质粒列于表1，并附相应基因型/表型描述。
【数据】培养基：HS（pH 4.5）；温度：30°C；氯霉素浓度：100 μg/mL；琼脂：15 g/L
2.2 不同pH条件下*N. cocois* WE7中*pa1136*表达定量
种子培养物（2%接种量，v/v）转接至50 mL经HCl/NaOH溶液调节至pH 3.0–4.5的HS液体培养基中。培养物在30°C下静态培养5天。通过离心（10,000×g，10 min，4°C）收集菌体细胞，所得沉淀重悬于无RNase离心管（1.5 mL容量）中。使用细菌RNA提取试剂盒（Takara，北京）提取总RNA。cDNA合成使用HiScript® III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（Vazyme，中国）。定量PCR（qPCR）检测在LightCycler® 480 II系统（Roche，瑞士）上进行，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，中国），以rpoA作为内参基因（引物序列见表2）。热循环条件为：95°C 30 s（初始变性）；40个循环的95°C 10 s、60°C 30 s、72°C 15 s（扩增）；随后进行熔解曲线分析（60°C–95°C，升温速率0.15°C/s）。
【数据】接种量：2%（v/v）；pH范围：3.0–4.5；培养时间：5天；温度：30°C；离心：10,000×g，10 min，4°C；qPCR循环：95°C 30s；40×（95°C 10s，60°C 30s，72°C 15s）；熔解曲线：60–95°C，0.15°C/s
2.3 重组菌株构建与发酵性能分析
#### 2.3.1 质粒构建与转化
将N. cocois WE7基因组数据上传至Cas-Designer平台（http://www.rgenome.net/cas-designer）进行靶向pa1136基因的CRISPR RNA（crRNA）设计。使用平台算法对潜在crRNA结合特异性和脱靶效应进行计算预测。pa1136基因片段克隆至J23110-pSEVA331Bb载体，其相应crRNA序列克隆至J23110-pSEVA331Bb-J23104-pdcas9载体。质粒合成与组装由Genewiz（苏州，中国）完成。重组质粒通过电穿孔法导入N. cocois WE7，使用GenePulser Xcell系统（SCIENTZ-2CS，新芝），优化参数为2 kV、25 μF、200 Ω。
【数据】电转化参数：2 kV，25 μF，200 Ω；载体：J23110-pSEVA331Bb、J23110-pSEVA331Bb-J23104-pdcas9
#### 2.3.2 qPCR验证pa1136表达水平
经菌落PCR验证的重组菌株接种至HS培养基（pH 4.5），30°C静态培养48 h制备种子培养物。种子接种物（2% v/v）转接至50 mL新鲜HS培养基（pH 4.5），30°C静态培养5天。离心收集细胞（10,000×g，10 min，4°C）。总RNA提取、逆转录和qPCR操作按2.2节所述进行。
【数据】培养时间：48 h（种子）/5天（发酵）；接种量：2%（v/v）；pH：4.5；温度：30°C
#### 2.3.3 不同pH条件下BC产量测定
将菌株从冷冻甘油保藏管划线至HS固体培养基，30°C静态培养48 h。随后挑取单菌落接种至5 mL HS液体培养基，30°C静态培养至600 nm光密度（OD600）达0.1，制备种子培养物。种子培养物（2% v/v）接种至50 mL pH分别调至3.0、3.5、4.0或4.5的HS培养基中，30°C静态培养10天。收获BC膜，浸入0.1 mol/L NaOH溶液中、25°C处理24 h以裂解残余细胞，随后依次用0.1 mol/L冰醋酸和蒸馏水（pH 7.0）冲洗至中性。纯化后的BC在60°C下干燥至恒重，以重量法量化生物量。
【数据】pH梯度：3.0/3.5/4.0/4.5；培养时间：10天；NaOH浓度：0.1 mol/L；处理时间：24 h；温度：25°C（NaOH处理）/60°C（干燥）；接种量：2%（v/v）
#### 2.3.4 BC结构表征
BC膜经冷冻干燥后，使用Hitachi MC1000离子溅射仪喷金（厚度10 nm），在SU8010冷场发射扫描电子显微镜（SEM）（日立，日本）下以5.0 kV加速电压成像。每样品不少于100次纤维直径测量，使用Image J v.1.8.0（美国国立卫生研究院）分析。BC结晶度使用D8 ADVANCE衍射仪（Bruker，德国）分析，Cu-Kα辐射（λ = 1.5406 Å），40 kV、40 mA。扫描范围2θ = 10°–80°（扫描速率：2°/min，步长：0.02°）。结晶度指数（CrI）使用Origin 2019b v.9.6.0.212（OriginLab Corporation，美国）通过Segal方法计算：CrI (%) = (A全部峰 − A无定形)/A无定形 × 100%，其中A全部峰为所有峰面积，A无定形为无定形峰面积。
【数据】喷金厚度：10 nm；SEM加速电压：5.0 kV；XRD辐射：Cu-Kα（λ=1.5406 Å）；扫描范围：2θ=10°–80°；扫描速率：2°/min；步长：0.02°
#### 2.3.5 统计分析
定量数据以平均值±标准差（mean ± SD）表示。统计分析使用IBM SPSS Statistics v.22.0（IBM Corporation，美国）。Shapiro-Wilk检验用于确定正态性（p值 = 0.05）。统计比较包括：（i）两个独立组，采用非配对双尾t检验（若方差不齐则按Brown-Forsythe检验进行Welch校正）；（ii）单因素多组比较，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）及Tukey's HSD事后检验；（iii）双因素多组比较，采用双因素方差分析（two-way ANOVA）及Tukey's HSD检验。显著性阈值：p < 0.05（图中字母标记：小写字母表示组内比较，大写字母表示组间比较）。
【数据】显著性水平：p < 0.05；正态性检验：Shapiro-Wilk（p = 0.05）
2.4 转录组测序与分析
#### 2.4.1 RNA提取与文库构建
种子培养物按2%（v/v）接种量转接至含50 mL pH 4.5 HS液体培养基的250 mL锥形瓶中，30°C静态培养5天。培养液转移至锥底离心管，室温下14,000×g离心5 min。完全去除上清后，细胞沉淀重悬于1.5 mL无菌冻存管中，液氮速冻30 min，−80°C保存2天。RNA纯化、逆转录、文库构建与测序由上海美吉生物技术有限公司（上海，中国）完成。总RNA使用TRIzol® Reagent法提取，链特异性文库使用TruSeqTM Stranded Total RNA Library Prep Kit制备。测序在NovaSeqXPlus平台上进行。
【数据】接种量：2%（v/v）；培养基体积：50 mL（250 mL锥形瓶）；pH：4.5；培养时间：5天；离心：14,000×g，5 min，室温；液氮速冻：30 min；−80°C保存：2天
#### 2.4.2 生物信息学分析
数据质量控制与比对：使用Trimmomatic（v0.39）对原始测序读段进行质量过滤，滑动窗口4 bp，最小平均质量分数Q20。长度短于50 bp的读段被丢弃。高质量读段使用Hisat2（v2.2.1）比对至N. cocois WE7参考基因组，比对效率> 85%的样本保留用于下游分析。主成分分析（PCA）：原始数据经z-score标准化（零均值单位方差标准化）和Pareto缩放预处理。通过正交变换，原始变量被降维为一组线性无关的综合变量，即主成分（PCs）。各PC按其在原始数据矩阵中的方差贡献率排序：第一主成分（PC1）捕获最大方差，后续各主成分（PC2、PC3等）贡献率依次递减。PCA建模后，使用得分图可视化样本分布模式和组间分离趋势。随后应用相似性分析（ANOSIM）（显著性水平α = 0.05）统计评估预设组间的总体差异。差异基因鉴定与功能注释：使用DESeq2鉴定差异表达基因（DEGs），阈值设为|log2(倍数变化)| > 1且FDR校正后p值< 0.05（Benjamini-Hochberg校正）。
【数据】过滤参数：滑动窗口4 bp，Q20；读段最小长度：50 bp；比对效率阈值：>85%；DEGs阈值：|log2FC|>1，FDR<0.05
研究结果
3.1 pH梯度下*N. cocois* WE7中*pa1136*的表达谱分析
建立pH梯度模型（3.0–4.5）研究pa1136的酸胁迫响应。在极端酸性条件（pH 3.0）下，pa1136表达显著下降至基线水平的45%（0.45 ± 0.05；p < 0.05），提示启动子构象变化或关键调控因子失活导致转录抑制，与经典酸耐受系统（如rpoS、gad）中记载的失活机制相似（图1a）。随pH升高，检测到pa1136的剂量依赖性激活：pH 3.5时记录到1.7倍（p < 0.05）上调（1.73 ± 0.23），pH 4.0时记录到2.1倍（p < 0.01）上调（2.09 ± 0.14），与Salmonella PhoP/PhoQ双组分系统等pH敏感调控元件的行为一致。值得注意的是，在pH 4.5时表达恢复至基线水平（1.0 ± 0.12），形成统计学显著的"峰值响应"曲线（p < 0.05）。这种非线性调控被解释为多层分子开关机制的证据，可能由铁摄取调控因子Fur等pH响应元件介导，通过抑制-激活-重置循环实现动态适应。
【数据】pH 3.0表达量：0.45 ± 0.05（基线45%，p<0.05）；pH 3.5表达量：1.73 ± 0.23（1.7倍，p<0.05）；pH 4.0表达量：2.09 ± 0.14（2.1倍，p<0.01）；pH 4.5表达量：1.0 ± 0.12
3.2 重组菌株的构建与发酵性能
#### 3.2.1 重组菌株的构建
通过分子克隆构建PA1136工程菌株。pa1136编码序列与J23110-pSEVA331Bb载体使用BamHI/NcoI双酶切（图S1a），纯化后用OK Clon DNA连接试剂盒Ⅱ连接，生成J23110-pSEVA331Bb_PA1136。热激转化至Escherichia coli DH5α后，通过菌落PCR筛选阳性克隆（引物pSEVA331Bb-BD-F/R），并经Sanger测序验证（Genewiz）。对于CRISPR干扰（CRISPRi），靶向pa1136（+247位点）的crRNA使用NotI克隆至J23110-pSEVA331Bb-J23104-pdcas9骨架（图S1b）。重组质粒J23110-pSEVA331Bb-J23104-pdcas9_PA1136(+247)经菌落PCR（引物pSEVA331Bb-dcas-F/R）和测序确认。两种质粒均通过电穿孔导入N. cocois WE7，获得工程菌株PA1136_bd（过表达）和PA1136_as（CRISPRi）（图S1c和S1d）。
【数据】限制性内切酶：BamHI/NcoI（过表达）、NotI（CRISPRi）；靶向位点：+247
#### 3.2.2 重组菌株中pa1136表达验证
RT-qPCR分析确认遗传操作成功：与WE7p空载体对照相比，PA1136_bd中检测到1.42 ± 0.15倍上调（p < 0.05）；与dCas9对照相比，PA1136_as中检测到0.58 ± 0.08倍抑制（p < 0.05）（图1b）。这些结果验证了工程菌株的功能有效性，可用于后续研究。
【数据】PA1136_bd表达量：1.42 ± 0.15倍（p<0.05）；PA1136_as表达量：0.58 ± 0.08倍（p<0.05）
#### 3.2.3 不同pH条件下的BC合成能力
通过静态发酵实验（10天）研究pH梯度（3.0–4.5）与PA1136基因工程对BC生物合成的联合效应。所有菌株均表现出pH与BC产量之间的显著正相关，pH 4.5较pH 3.0最大增幅达328%（p < 0.05）（图1c）。值得注意的是，空载体对照菌株WE7p与dcas在相同pH条件下BC产量无统计学显著差异（p > 0.05），确认载体干扰可忽略。pa1136的遗传操作呈现明确的剂量-效应关系：在最优pH（4.5）下，PA1136_bd的BC产量达1.9倍于WE7p的水平（p < 0.05）。相反，沉默菌株PA1136_as产量严重降低（0.99 ± 0.13 g/L），仅为dcas产量的48%（p < 0.05）。pa1136表达强度与BC生物合成效率之间的直接正比关系被确立，从分子水平验证了其在BC代谢网络中的关键调控作用。此外，环境因素（pH）与遗传因素（pa1136）之间的协同交互作用被识别。PA1136_bd菌株表现出放大的pH敏感性，提示可能通过调节质子驱动的跨膜转运系统增强前体摄取。这项工作为合成生物学驱动的工业BC生产优化提供了可操作的见解。
【数据】最大增幅：328%（pH 4.5 vs pH 3.0）；PA1136_bd产量：WE7p的1.9倍（p<0.05）；PA1136_as产量：0.99 ± 0.13 g/L（dcas的48%，p<0.05）
#### 3.2.4 BC微观结构与结晶特征
SEM表征揭示了不同pH条件下基因修饰菌株与对照菌株之间纤维直径的显著差异（图1d和图2）。在pH 3.0–4.5范围内，pa1136过表达菌株（PA1136_bd）的纤维直径显著大于对照菌株WE7p（p < 0.05），且该差异幅度随pH升高而减小。pH 3.0时，PA1136_bd纤维直径（34.29 ± 4.95 nm）较WE7p（21.65 ± 4.76 nm）增加58.2%；而pH 4.5时差异缩小至13.9%（25.14 ± 6.01 nm vs. 22.06 ± 3.80 nm），表明PA1136过表达对纤维增厚的调控具有pH依赖性。值得注意的是，pH 3.0时PA1136_bd的直径变异性更高，推测与极端酸性条件下分子链刚性和局部结构紊乱相关。相比之下，pa1136沉默菌株（PA1136_as）在所有pH水平下的纤维直径均显著大于去乙酰化对照菌株dcas（p < 0.01）。例如，pH 4.0时PA1136_as直径（31.11 ± 7.52 nm）较dcas（21.54 ± 3.71 nm）增加44.3%，表明基因沉默增强了纤维形态的环境稳定性。
X射线衍射（XRD）分析进一步阐明了基因操作的结构影响（图3）。PA1136_as（52%–59%）与对照菌株dcas（53%–59%）之间的结晶度无统计学差异（p > 0.05）。然而，PA1136_bd的结晶度（70%–73%）显著高于WE7p（56%–64%，p < 0.01），在pH 4.0时尤为突出。这些结果表明pa1136过表达协同增强纤维增厚和结晶度，可能通过促进β-1,4-糖苷键的有序排列实现。
【数据】pH 3.0纤维直径：PA1136_bd 34.29±4.95nm vs WE7p 21.65±4.76nm（+58.2%）；pH 4.5纤维直径：PA1136_bd 25.14±6.01nm vs WE7p 22.06±3.80nm（+13.9%）；pH 4.0纤维直径：PA1136_as 31.11±7.52nm vs dcas 21.54±3.71nm（+44.3%）；结晶度：PA1136_bd 70%–73% vs WE7p 56%–64%（p<0.01）；PA1136_as 52%–59% vs dcas 53%–59%（p>0.05）
3.3 菌株转录组学分析
#### 3.3.1 全局转录组测序分析
经严格质量控制，所有测序数据集的Q20和Q30碱基百分比分别超过96.88%和92.69%，碱基错误率保持在0.014%以下。下游分析数据质量得到确认。转录组测序共鉴定到3257个表达基因，包括3090个注释基因、58个新转录本和109个小RNA（sRNAs）。经跨数据库功能注释，97.6%（3094/3170）的基因获得至少一项功能注释。具体而言，99.18%的基因通过非冗余蛋白数据库（NR）获得注释，68.55%在Swiss-Prot中获得生化功能注释，81.17%通过Pfam分析发现含有保守结构域。代谢注释特征如下：（i）同源蛋白簇（COG）分类将81.36%的基因归入23个功能类别，其中"翻译后修饰"（J类，15.2%）占主导；（ii）KEGG通路映射覆盖55.52%的基因，涉及42条通路，以碳水化合物代谢为主；（iii）GO术语注释37.22%的基因，"催化活性"（53.14%）为最主要的分子功能。进一步表征了专门功能元件：通过CAZy数据库检测到76个碳水化合物活性酶（CAZymes），包括36个糖基转移酶和24个糖苷水解酶；225个抗生素抗性基因……
【数据】Q20：>96.88%；Q30：>92.69%；碱基错误率：<0.014%；表达基因总数：3257（注释基因3090，新转录本58，sRNA 109）；功能注释率：97.6%（3094/3170）；NR注释：99.18%；Swiss-Prot：68.55%；Pfam：81.17%；COG分类：81.36%（23类）；KEGG：55.52%（42通路）；GO：37.22%；CAZymes：76个（GT 36个，GH 24个）
讨论与解读
PA1136家族自诱导物结合转录调控因子与Streptomyces lohii Orf1具有结构同源性，两者均属于仅含保守HTH基序的LuxR家族调控因子。LuxR家族蛋白在不同微生物中表现出多样的结构和功能机制，能够感知环境信号并调控下游代谢。例如，Pseudomonas chlororaphis中的LuxR solo蛋白PcsR2响应小麦根系分泌物并上调相邻操纵子，从而调节碳利用和次级代谢物合成；Tei16通过Tei16-Teii15相互作用调控Actinoplanes teichomyceticus中替考拉宁的生物合成；在Komagataeibacter xylinus中，LuxR基因被观察到促进嘌呤/嘧啶合成同时抑制氨基酸和脂质代谢以增强BC产量。本研究系统解析了酸胁迫下pa1136的动态调控机制及其对N. cocois WE7中BC生物合成的多层控制网络。通过整合pH梯度建模、基因工程、转录组学和代谢组学，阐明了pa1136在环境适应和代谢调控中的核心作用。
编译者解读
本研究巧妙运用"环境梯度+遗传操作+多组学"三位一体的策略，将pH作为可量化输入信号，通过过表达与CRISPRi双向干预，清晰确立了PA1136调控BC合成的因果链条——这在合成生物学中属于典型的"扰动-响应"解析范式。值得注意的是，该研究揭示了PA1136不仅直接调控BC合成基因，还通过RND外排泵、氧化应激调控因子和膜重塑基因等形成层级网络，提示单基因改造在工业菌株中可能产生远超预期的全局效应。从应用角度，pH 4.0处2.1倍的表达峰值为发酵工艺的pH动态调控提供了精确窗口；而过表达菌株在纤维直径和结晶度上的协同提升，对需要特定材料性能的BC应用场景具有直接价值。局限在于，研究仍以摇瓶静态培养为主，工业发酵罐中的氧传递与剪切力对PA1136调控网络的影响尚待验证。未来若能将此调控模块与产物回收工艺耦合设计，有望实现从基因到材料的全链条优化。
参考来源
Zheng Y. Elucidating molecular mechanism of PA1136 family transcriptional regulator in bacterial cellulose biosynthesis by Novacetimonas cocois WE7 through multi-omics approaches. Food Bioscience, 2025. DOI: 10.1016/j.fbio.2025.107226
DOI: 10.1016/j.fbio.2025.107226