来源：De novo biosynthesis of the polymethoxylated flavones eupatilin and jaceosidin in Saccharomyces cerevisiae（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
多甲氧基黄酮（PMFs）异泽兰黄素（EUP）和蓟黄素（JAC）源自艾草，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化及胃黏膜保护等多种药理活性，却是"植物含量低、化学合成难"的典型代表。本研究在酿酒酵母中采用"先骨架、后修饰"的模块化策略，首次实现了EUP和JAC的从头生物合成。通过酶筛选、前体通量优化、基因拷贝数调控及NADPH/SAM辅因子工程，最终在5-L生物反应器中将EUP和JAC的平均峰值产量分别提升至70.5 mg/L和63.3 mg/L。
研究背景
多甲氧基黄酮（PMFs）是黄酮类化合物中药理学价值突出的一个亚类。EUP和JAC在蒿属及其他菊科植物中含量丰富，已被广泛报道具有抗肿瘤、抗炎和抗氧化活性。此外，由于其对胃黏膜完整性的保护作用，这两种化合物被用作Stillen片剂的关键活性成分。然而，EUP和JAC的可规模化生产面临挑战——植物提取受限于天然丰度低及品种间和环境条件间的显著差异，而化学合成则因黄酮骨架上需要进行多位点区域选择性甲氧基化，导致合成路线冗长、工艺经济性不佳。微生物生物合成因此成为可控且可持续生产这些化合物的有前景的替代方案。酿酒酵母凭借其完善的蛋白表达与代谢工程体系，尤其适合作为该类植物来源化合物的生产底盘。
研究方法
2.1 化学标准品与试剂
除非另有说明，所有化学标准品，包括对香豆酸（PC）、柚皮素（NAR）、芹菜素（API）、木犀草素（LUT）、蓟黄素（JAC）和异泽兰黄素（EUP），均购自成都瑞芬思生物科技有限公司。分子生物学试剂购自认证商业供应商，包括Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶、FastPure凝胶DNA提取试剂盒和HiScript III第一链cDNA合成试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；TIANprep Rapid Mini质粒试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）；Cycle-Pure试剂盒和凝胶提取试剂盒（Omega，美国）；以及EASYspin植物RNA快速提取试剂盒（艾德莱生物科技有限公司，中国）。所有其他分析级化学品（纯度≥99%）购自上海生工生物工程股份有限公司。6-羟基木犀草素（6-OH LUT）标准品根据先前报道的方法（Jia等，2021）通过化学合成制备，其结构通过质谱（MS）和核磁共振（NMR）分析并与已发表数据（Gao和Kawabata，2004）比对后确认。
【数据】标准品来源：成都瑞芬思；试剂纯度：≥99%；6-OH LUT制备方式：化学合成；结构确认：MS+NMR
2.2 DNA克隆
本研究所用的引导RNA（gRNA）质粒按先前描述的方法（Reider等，2017）构建。完整核苷酸序列从美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库获取，对应登录号列于补充表S2。用于CRISPR-Cas9介导的基因组编辑的每个表达盒由上游同源臂（约1000 nt）、启动子、目标基因、终止子和下游同源臂（约1000 nt）组成。DNA组装采用融合PCR方法。具体而言，首先使用引物通过PCR扩增含有重叠序列的初级DNA片段。将所得PCR产物纯化后，在不添加引物的条件下进行第二轮PCR以生成全长融合基因。随后使用外部引物通过最后一轮PCR扩增这些融合基因，所得融合产物用于酵母转化。
【数据】同源臂长度：约1000 nt；组装方法：融合PCR（三轮）；表达盒结构：同源臂-启动子-基因-终止子-同源臂
2.3 利用CRISPR-Cas9系统进行基因整合
酿酒酵母中的基因整合按照先前描述的方法（Levi和Arava，2020）使用CRISPR-Cas9系统进行。所有工程菌株由生工生物工程（上海）股份有限公司构建并通过Sanger测序验证。供体DNA片段在转化前使用DNA Extraction Mini Kit（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）构建并纯化。基因片段和供体DNA使用醋酸锂转化法（Gietz和Schiestl，2007）导入酵母细胞。
【数据】转化方法：醋酸锂法；菌株验证：Sanger测序
2.4 菌株构建
所有目标基因均针对酿酒酵母表达进行密码子优化，并由GENEWIZ（苏州）合成。本研究所构建的酵母菌株列于补充表S3。首先，通过PCR从合成基因或酵母基因组扩增DNA片段，然后使用Gibson组装（Gibson等，2009）进行拼接。经测序验证的重组DNA盒通过同源重组（Gietz和Schiestl，2007）整合到酵母基因组中。遗传工程策略的示意概览见图S1。转化子菌落在SD琼脂平板上筛选并通过菌落PCR验证。阳性菌落随后在酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基中培养。本研究所用引物列于补充表S4。
【数据】密码子优化：是；合成商：GENEWIZ；整合方式：同源重组；筛选：SD平板+菌落PCR
2.5 培养基与24深孔板培养条件
酿酒酵母菌株常规维持在含20 g/L葡萄糖、10 g/L酵母提取物和20 g/L蛋白胨的YPD培养基上。对于高通量小规模通路筛选和底物补加实验，重组酵母菌株在24深孔板中培养。具体操作如下：先将菌株接种到2 mL YPD培养基中，于30°C、220 rpm振荡培养过夜。随后将种子培养物以初始OD600为0.2转入24深孔板中的酵母提取物-蛋白胨-半乳糖（YPG）培养基。YPG培养基由10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨和20 g/L半乳糖组成。24深孔板培养物在30°C、800 rpm条件下培养。对于底物补加实验，按指定浓度加入底物。发酵结束后，培养物用乙酸乙酯萃取三次，所得萃取液通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）或高效液相色谱（HPLC）分析。该24深孔板培养系统用于小体积、高通量通路筛选和补料实验。500-mL摇瓶和5-L生物反应器中的补料分批发酵分别在第2.7节和第2.8节中描述。除非另有说明，所有实验均使用三个独立的生物学重复。
【数据】YPD配方：20 g/L葡萄糖+10 g/L酵母提取物+20 g/L蛋白胨；YPG配方：10 g/L酵母提取物+20 g/L蛋白胨+20 g/L半乳糖；培养条件：30°C、220 rpm（过夜）、800 rpm（深孔板）；初始OD600：0.2；萃取：乙酸乙酯×3次
2.6 LC-MS/HPLC分析
在构建EUP和JAC全合成通路过程中，LC-MS主要用于产物的定性分析。制备的样品使用配备Waters Acquity Poroshell 120 EC-C18色谱柱（3 mm × 100 mm）的Agilent Technologies 6410 Triple Quad LC/MS仪器进行分析。流动相A为含0.01%乙酸铵的水，流动相B为乙腈。流速设为0.3 mL/min，柱温维持在30°C。质谱条件如下：鞘气流量30 Arb；辅助气流量8 Arb；喷雾电压3.2 kV；离子传输管温度320°C，以氮气为载气。在全扫描模式下，使用电喷雾电离（ESI）源、负离子模式。质荷比（m/z）采集范围为50-1200 m/z。采用单点外标法对NAR、API、LUT、6-OH LUT、JAC和EUP进行定性分析。
在为提高产量而优化EUP和JAC合成过程中，主要使用HPLC对产物进行定量分析。产物使用Agilent 1290 Infinity II-6470A仪器进行HPLC分析，配备Inertsil ODS-3（5 μm，4.6 × 250 mm，GL Science）色谱柱，通过紫外单波长扫描检测。色谱分离采用梯度洗脱法：流动相A为含0.05%甲酸的乙腈，流动相B为含0.05%甲酸的水，恒定流速为1.0 mL/min。梯度程序如下：0.00 min时A/B = 25/75；至5.00 min线性变化至A/B = 40/60；至15.00 min进一步线性变化至A/B = 70/30；至16.00 min返回至A/B = 25/75；最后维持A/B = 25/75至20.00 min运行结束。对于中间产物分析，API、LUT、6-OH LUT、JAC和EUP使用由真实标准品生成的校准曲线通过HPLC定量。用于定量的6-OH LUT标准品按第2.1节所述通过化学合成制备。
【数据】LC-MS条件：流速0.3 mL/min，柱温30°C，喷雾电压3.2 kV，离子传输管温度320°C，m/z范围50-1200，负离子模式；HPLC条件：流速1.0 mL/min，梯度洗脱（25/75→40/60→70/30→25/75，20 min）
2.7 500 mL摇瓶补料分批发酵
将单菌落接种到含3 mL YPD培养基的试管中，于30°C、220 rpm培养过夜作为种子培养物。随后按1%的体积比转入含200 mL YPD培养基的500 mL摇瓶中，于30°C、220 rpm连续培养120 h。在发酵进行到12 h和24 h时，向培养物中补加2%（w/v）葡萄糖，此后每24 h再补加2%（w/v）葡萄糖。发酵开始后，每12 h取样测定产物浓度。
【数据】种子培养：3 mL YPD，30°C，220 rpm，过夜；发酵培养：200 mL YPD于500 mL摇瓶，30°C，220 rpm，120 h；补糖策略：12 h和24 h各补2%（w/v）葡萄糖，此后每24 h补2%；取样间隔：每12 h
2.8 5-L生物反应器补料分批发酵
将菌株EU49的单菌落接种到含25 mL YPD培养基的250-mL摇瓶中，于30°C、220 rpm培养过夜作为一级种子培养物。随后将一级种子培养物按1%（v/v）的比例转入500-mL摇瓶中……
（原文此处截断，后续步骤原文未详述）
【数据】一级种子：25 mL YPD于250-mL摇瓶，30°C，220 rpm，过夜；接种量：1%（v/v）
研究结果
3.1 酿酒酵母中EUP和JAC从头生产通路的构建
以EUP和JAC的结构为引导，我们基于组合生物合成策略设计了该通路，采用"先骨架、后修饰"的框架（图1）。NAR是参与EUP和JAC生物合成的关键前体。因此，我们首先工程化了一个能够高效稳定生产NAR的微生物底盘。基于先前报道的异源通路，选择包含FjTAL、Pc4CL、SmCHS2和MsCHI的酶组合，以实现菌株EU2中从酪氨酸到NAR的完整从头转化（图2a）。为验证EU2的功能，向培养物中补加外源L-酪氨酸，并使用LC-MS分析产物。在EU2的提取物中，检测到保留时间约为12.5 min的色谱峰，对应的质谱信号（m/z 271）与NAR标准品一致（图2a），证实EU2中已成功建立从头NAR生物合成通路。
随后，我们聚焦于通过通路修饰将该关键前体（NAR）高效转化为下游产物。在设计通路中，FNS、F3′H、F6H和OMTs介导四个主要的后修饰步骤，分别催化C2-C3双键形成、3′-羟基化、6-羟基化和3′/4′/6-O-甲基化。为实现稳健的通路构建，最初筛选了文献中报道的多个候选后修饰酶，并通过直接底物补加实验在酿酒酵母中进行了系统表征。由于NAR的C2-C3脱饱和可由可溶性FNS I或膜结合FNS II酶催化，因此将代表性的FNS I候选酶PaFNSI和PcFNSI与SbFNSII-1一起纳入酶筛选流程进行评估。为在相同的下游背景下评估这些FNS候选酶，每个FNS酶均与AtF3′H在相同培养条件下共表达。在此，LUT积累量作为NAR-to-LUT转化效率的读数。
表达SbFNSII-1的菌株显示出最高的LUT积累量（68.01 mg/L），其产量超过PaFNSI（23.32 mg/L）和PcFNSI（35.63 mg/L）菌株（图S2）。这些结果表明FNS的性能既依赖酶来源也依赖底盘背景，支持选择SbFNSII-1用于后续在该酵母系统中的PMF通路组装。基于这些结果，将SbFNSII-1（黄芩来源）和AtF3′H（拟南芥来源）引入EU2以生成EU3，实现了从NAR生物合成LUT（m/z 285；图2a）。随后引入SbF6H得到EU4，将LUT转化为6-OH LUT（m/z 301；图2a）。
考虑到EUP和JAC在3′、6和/或4′位含有甲氧基，FOMTs对于完成修饰模块至关重要。因此，选择了四个先前报道可催化位点特异性黄酮甲基化的候选FOMT（GmOMT2、MpalOMT2、ObFOMT4和PaF4′OMT）。尽管MpalOMT2已被报道在多个位点表现出广泛的区域选择性，但其对6-OH LUT的活性尚不清楚。在这些实验中，以LUT为底物，6-OH LUT通过SbF6H催化在胞内生成。每个FOMT在含F6H的菌株中单独表达，并在发酵过程中添加LUT以评估胞内甲基化活性。LC-MS分析显示，MpalOMT2产生了两个m/z 315的甲基化衍生物（P1和P2）。这些单-O-甲基化产物是通过在C3′-OH或C4′-OH位点甲基化生成的（图2b和c）。此外，还检测到m/z 329的产物（P5），对应于二-O-甲基化衍生物（图2b和c）。PaF4′OMT和ObFOMT4主要产生单甲基化产物（P3和P4；m/z 315），而GmOMT2在测试条件下未检测到活性（图2b）。因此，选择MpalOMT2和ObFOMT4进行通路重建，因为它们共同提供了覆盖EUP和JAC生物合成所需C3′/C4′和C6位点的互补性O-甲基化活性。
将MpalOMT2和ObFOMT4引入EU4生成菌株EU11。在该菌株中，LC-MS显示JAC和EUP（JAC，m/z 329；EUP，m/z 343；图2d）的产量分别为4.5 mg/L和0.36 mg/L。由于MpalOMT2还产生了一个m/z 329的二甲基化异构体（3′,4′-O-二甲基化），其色谱行为可能与JAC（3′,6-O-二甲基化）相似，因此通过¹H NMR波谱进一步确认了JAC的结构（补充NMR数据1）。
随着从头生物合成通路的成功建立，我们接下来评估了发酵时间以确保产物定量的一致性。在72、84和96 h时测量EUP产量，观察到最高产量出现在72 h。随后84-96 h的下降可能反映了小体积培养条件下的后期限制因素，如营养耗竭、细胞活性降低、产物吸附/降解或进一步转化。因此，选择72 h作为后续实验的标准发酵时长（图S3）。
【数据】NAR产量验证：保留时间约12.5 min，m/z 271；LUT积累量：SbFNSII-1菌株68.01 mg/L、PaFNSI菌株23.32 mg/L、PcFNSI菌株35.63 mg/L；EU11产量：JAC 4.5 mg/L，EUP 0.36 mg/L；标准发酵时长：72 h
3.2 NAR合成通路的优化
为提高NAR产量，我们通过筛选4CL和CHS酶对来优化通路，同时增强前体供应并减少副产物形成。由于4CL和CHS模块的性能高度依赖酶来源，选择At4CL1和Pc4CL作为候选4CL，而选择SjCHS1、SmCHS2和PhCHS作为候选CHS。这些组合在CEN.PK2-1C和WAT11两种背景中进行了测试。菌株EU17-EU22在CEN.PK2-1C背景中构建，而菌株EU1-EU9和EU23-EU28在WAT11中构建（图3b）。最高产量在表达ATR1的WAT11中实现，其中Pc4CL和PhCHS的组合产生了27.8 mg/L的NAR（图3b）。因此选择该酶对用于后续通路工程。
此后，我们探索了底物通道化作为改善中间体利用的策略。受双功能NRPS-PKS合酶fnsA的启发，我们构建了由肽连接子连接的4CL-CHS融合蛋白，以促进对香豆酰-CoA的传递，从而减少副产物THDHC的形成并提高NAR产量。然而，PhCHS-GGGS-Pc4CL融合菌株产生的NAR远低于共表达非融合Pc4CL和PhCHS的菌株（图S4）。为确定该下降是否主要由连接子长度不足引起，我们进一步构建了含延伸连接子的融合变体。然而，该变体也未能恢复NAR产量，且效果仍不如非融合的Pc4CL/PhCHS构型（图S4）。这些结果表明，在测试的融合方向下，仅增加连接子长度不足以优化4CL-CHS融合策略。因此，保留非融合的Pc4CL/PhCHS构型用于后续NAR通路工程。
上游酶模块优化后，我们接下来聚焦于改善宿主代谢能力以支持更高的NAR产量。由于酵母中酪氨酸来源的黄酮生物合成通常受反馈调节和莽草酸通路通量减少的限制，在EU24中进行了逐步代谢工程以解除调控限制、增强酪氨酸供应并减少碳流向竞争通路的损失（图3c）。首先，GAL8……
（原文此处截断）
【数据】NAR最高产量：27.8 mg/L（WAT11+ATR1背景，Pc4CL+PhCHS组合）；融合蛋白策略：未提升产量；测试菌株：EU1-EU9、EU17-EU28
讨论与解读
EUP和JAC是代表性的PMFs，具有抗炎、抗氧化、胃保护和抗癌等活性。本研究使用"先骨架、后修饰"的工作流程，在酿酒酵母中建立了EUP/JAC的从头生物合成系统。与重建完整的天然植物通路不同，我们优先考虑功能性通路组装和模块级优化，从而能够在酵母中迭代识别和解决通路瓶颈。
通路建立后，我们专注于加强NAR供应——这是酵母黄酮生物合成中常见的限制因素。值得注意的是，4CL和CHS的直接融合即使延长了连接子长度也未能提高NAR产量。这表明两种酶的简单空间偶联是不够的，不利的融合几何构型、蛋白折叠受损或底物可及性受限可能抵消了底物通道化的潜在益处。因此，未来的优化可能需要更广泛的连接子长度和融合方向文库，以识别更有效的酶排列方式。重要的是，本研究的目标不是最大化NAR产量本身，而是建立从简单碳源到最终PMF产物的完整生物合成能力。
编译者解读
本研究最值得借鉴之处在于"先骨架、后修饰"的模块化设计逻辑——将复杂的P450与OMT修饰步骤拆解为可独立筛选和优化的功能模块，使通路构建从"一次组装"变为"逐段攻坚"。在5-L反应器中通过pH调控和分阶段补料策略将EUP产量从摇瓶水平提升至70.5 mg/L，体现了过程工程与菌株工程协同的必要性。值得注意的是，4CL-CHS融合蛋白策略的失败提示合成生物学中"空间邻近"假设并非普遍适用。未来若能将OMT的区域选择性进一步精细化，并强化SAM再生与P450还原伴侣的适配，PMFs的微生物合成效率仍有可观提升空间。
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102502