来源：Postharvest application of Bacillus subtilis L1-21 modulates the citrus microbiome and effectively controls Penicillium digitatum（Postharvest Biology and Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
化学杀菌剂的可持续替代方案是采后病害防控的研究热点。本研究从健康柑橘叶片中分离的内生枯草芽孢杆菌L1-21，在活体实验中显著降低了指状青霉引起的柑橘绿霉病。研究发现其兼具强效拮抗与果实微生物组调节双重功能——1×10⁸ CFU/mL浓度下7天防治效果达67.4%，同时显著改变了果实内外微生物群落的组成与功能预测。该研究为采后生物防治机制提供了微生物生态学视角。
研究背景
柑橘是全球经济价值最高的水果作物之一，在140多个国家广泛种植，主要生产国包括中国、巴西、美国、墨西哥和埃及等。2020年全球柑橘产量约1.58亿吨。由指状青霉引起的绿霉病是柑橘采后最主要的病害，在贮藏和运输期间导致严重经济损失。在中国，柑橘腐烂损失可高达30%，该病原菌造成全国90%以上的柑橘采后病害。病原菌通过风、冰雹、昆虫造成的伤口以及采收、运输和操作过程中的损伤侵入果实。近年来，化学农药的使用逐渐减少，生物防治策略因其环境友好性而受到广泛关注，成为该领域的研究热点。
研究方法
2.1 不同浓度枯草芽孢杆菌L1-21生物防治效果测定
L1-21菌株最初从健康柑橘叶片组织中分离，来源于实验室菌种保藏。将枯草芽孢杆菌L1-21在LB培养基中、160 g、37°C条件下培养2天。2天后，通过测定OD600调整至不同浓度（1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸和1×10⁹ CFU mL⁻¹）。此外，在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上培养病原菌后，制备指状青霉孢子悬浮液（1×10⁶ CFU mL⁻¹）。
供试柑橘品种为沙糖橘，购自中国云南省昆明市盘龙区当地市场，未经过采后打蜡或杀菌剂处理。柑橘果实以无菌实验室手套采摘，用柑橘专用聚氨酯（PU）膜逐个包裹，立即运回实验室进行生物防治效果测定。果实表面用2%（v/v）次氯酸钠消毒，无菌水冲洗三次，室温晾干。用无菌针头刺破柑橘果皮中央区域。每个果实赤道部位用无菌针头制作4个5 mm × 2 mm的伤口。
阴性对照（N-CK）：每个伤口接种10 μl无菌水。阳性对照（P-CK）：每个伤口接种10 μl浓度为1×10⁶ CFU mL⁻¹的指状青霉悬浮液。所有处理组果实（T）：先向每个伤口接种10 μl浓度为1×10⁶ CFU mL⁻¹的指状青霉悬浮液，4小时后，向同一伤口接种10 μl不同浓度（1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸和1×10⁹ CFU mL⁻¹）的枯草芽孢杆菌L1-21悬浮液。设置4小时间隔是为了让病原菌初步黏附和萌发，同时评估L1-21在早期感染阶段的干预能力，模拟采后病原菌污染后施用生防菌的实际场景。
晾干去除多余水分后，果实置于专用容器中，人工气氛条件下、5–10°C、90%相对湿度贮藏。每个处理采用完全随机设计，3次重复，每次重复由30个大小和成熟度一致的柑橘果实组成，作为独立生物学单元。每个果实单独刺伤、接种，并评估发病率和病情指数。
改良果实病害分级标准如下：0级：健康；1级：霉变面积≤20%；2级：霉变面积>20%且≤40%；3级：霉变面积>40%且≤60%；4级：霉变面积>60%且≤80%；5级：霉变面积>80%且≤100%。培养3–7天后，评估柑橘果实绿霉病症状发展情况，记录各处理发病果实数。
（1）病情指数 = ∑（发病果实数 × 病级数）/（果实总数 × 最高病级）× 100
（2）生物防治效果 =（对照病情指数 − 处理病情指数）/ 对照病情指数 × 100%
【数据】培养基：LB、PDA；温度：37°C（培养）、5–10°C（贮藏）；时间：2天（培养）、4小时（间隔）、3–7天（评估）；转速：160 g；浓度：1×10⁶–1×10⁹ CFU mL⁻¹（L1-21）、1×10⁶ CFU mL⁻¹（病原菌）；消毒：2%次氯酸钠；湿度：90%；伤口规格：5 mm × 2 mm，4个/果；重复：3次，30果/重复
2.2 菌株与果实采集
内生菌L1-21菌株在LB肉汤中、30°C、160 g温和振荡培养16小时。随后以10,000 g离心15分钟轻轻收集菌体，上清液经0.22 μm滤膜仔细过滤，制备无细胞滤液用于果实处理。
2024年6月，从中国云南省昆明市盘龙区当地市场精心挑选新鲜、成熟、大小均匀的沙糖橘果实。每个果实单独用柑橘专用聚氨酯（PU）膜包裹，无菌条件下迅速运回实验室。在实验室中处理果实，分别收集果皮和内部组织的附生和内生微生物群。
分离附生微生物：柑橘果实先于自来水下轻轻冲洗3分钟去除松散附着物，然后依次用2.5%次氯酸钠消毒2分钟、75%乙醇（v/v）消毒1分钟。无菌蒸馏水冲洗三次，在层流罩中室温晾干。果实随机分为两组，每组9个。对照组用柑橘PU膜包裹，室温（25°C）贮藏3天。处理组制备枯草芽孢杆菌L1-21菌悬液（1% v/v，调整至基于OD的浓度），果实浸泡于菌悬液中20分钟，晾干去除水分，PU膜包裹，相同条件下贮藏3天。
处理后，无菌条件下剥取对照组和L1-21处理组柑橘果皮，置于1升含0.02% Tween-80的生理盐水中。采用超声波从柑橘果皮上分离微生物。含附生微生物的果实表面在加热超声波清洗器中、200 W、50 Hz条件下超声处理5分钟。所得沉淀过滤后，5000 g离心10分钟。收集的沉淀含有附生微生物，分为两部分：一部分于−80°C、20%甘油中长期保存，用于分离各类附生生物；另一部分用于微生物表征和分类，通过F338/F806和ITS引物进行PCR扩增。
【数据】培养基：LB肉汤；温度：30°C（培养）、25°C（贮藏）；时间：16小时（培养）、3分钟（冲洗）、2分钟（次氯酸钠消毒）、1分钟（乙醇消毒）、20分钟（浸泡）、3天（贮藏）、5分钟（超声）；转速：160 g（振荡）、10,000 g（离心）、5000 g（离心）；浓度：2.5%次氯酸钠、75%乙醇、0.02% Tween-80、1% v/v菌悬液；功率：200 W；频率：50 Hz；滤膜：0.22 μm；保存：−80°C、20%甘油；引物：F338/F806、ITS
2.3 沙糖橘果皮内生微生物采集
为回收内生微生物，在层流罩（LFU）下用无菌手套无菌分离处理组和对照组果实的果皮。果皮组织分为子样本：一部分于−80°C甘油中保存长期保存，另一部分用于微生物培养和分离。通过研磨从处理组和对照组果实的果皮组织中提取内生微生物。
【数据】温度：−80°C（保存）；方法：研磨提取；样本：处理组与对照组果皮
2.4 附生菌与内生菌的分离、鉴定和培养
附生菌悬浮液（含内生菌）培养于营养琼脂（NA，33 g/L）和马铃薯葡萄糖琼脂（PDA，200 g/L）培养基上，添加葡萄糖（20 g/L）和琼脂（15 g/L），25°C培养。24和48小时后，根据形态和颜色从培养基上分离附生和内生微生物菌落，转接至新鲜培养基。细菌分离物采用Streck法纯化。真菌通过菌丝尖端切割法纯化，即从菌落边缘切取菌丝尖端转接至新鲜培养基。细菌分离物于20%甘油中长期保存，真菌样品保存于PDA斜面培养试管中。此阶段虽未鉴定分离物，但每个分离物均赋予唯一编号。
【数据】培养基：NA（33 g/L）、PDA（200 g/L）；添加物：葡萄糖（20 g/L）、琼脂（15 g/L）；温度：25°C；时间：24、48小时；保存：20%甘油、PDA斜面
2.5 分离菌株的培养组学及柑橘微生物区系结构组成与功能差异分析
基于观察到的微生物群落结构差异，按照先前描述的方法分离可培养微生物。采用培养组学方法从微生物区系变化最大的样品组中回收可培养微生物，包括真菌（含酵母）。真菌分离物在PDA培养基上获得，细菌分离物在NA培养基上按标准条件培养。采用测序扩增方法鉴定可培养微生物的主要类群，综合运用形态学分析与特异性片段扩增策略。对于细菌，16S rRNA基因扩增…（原文后续内容未详述）
【数据】培养基：PDA、NA；方法：培养组学、形态学分析、特异性片段扩增、16S rRNA基因测序
研究结果
3.1 不同浓度枯草芽孢杆菌L1-21菌株对指状青霉所致病害严重度和发病率的影响
浓度为1×10⁶孢子/mL的指状青霉在对照组中引起的绿霉病病情指数显著较高，3天后约为50%，7天后约为82%（图1A）。而经不同浓度（1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸和1×10⁹ CFU mL⁻¹）枯草芽孢杆菌L1-21处理的果实，3天后病情指数显著降低：1×10⁶ CFU mL⁻¹为2%，1×10⁷ CFU mL⁻¹为1.9%，1×10⁸ CFU mL⁻¹为2.8%，1×10⁹ CFU mL⁻¹为3.7%（p < 0.05）。相比之下，7天后的发病率：1×10⁶ CFU mL⁻¹为69.7%，1×10⁷ CFU mL⁻¹为47.5%，1×10⁸ CFU mL⁻¹为26.6%，1×10⁹ CFU mL⁻¹为48%（p < 0.05）。
所有处理中，3天后1×10⁷ CFU mL⁻¹浓度处理病情指数最低，降至1.9%以下；7天后1×10⁸ CFU mL⁻¹浓度处理最低，为26.6%。7天后1×10⁶ CFU mL⁻¹浓度处理发病率最高（图1A）。
类似地，评估了不同浓度（1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸和1×10⁹ CFU mL⁻¹）枯草芽孢杆菌L1-21的生物防治效果（图1B）。阳性对照（P_CK）病害严重度最高，3天后超过50.6%，7天后达82%，表明病原菌具有强侵袭定殖能力和组织腐烂程度。相比之下，所有处理组均表现出显著的生物防治效果（p < 0.05）。1×10⁸ CFU mL⁻¹浓度处理抑菌作用最强，生物防治效果超过67.4%。
目视观察（图1C）进一步证实了这些结果：阳性对照（P_CK）显示大量菌丝生长和腐烂迹象，而不同浓度枯草芽孢杆菌L1-21处理的果实腐烂迹象较少，部分处理果实保持部分完整。与此一致，目视观察（图1C）显示不同浓度枯草芽孢杆菌L1-21处理的果实在伤口部位真菌生长有限，而未处理感染果实则出现严重腐烂和产孢。
【数据】病原菌浓度：1×10⁶孢子/mL；病情指数（3天）：对照~50%、1×10⁶ CFU/mL为2%、1×10⁷ CFU/mL为1.9%、1×10⁸ CFU/mL为2.8%、1×10⁹ CFU/mL为3.7%；病情指数（7天）：对照~82%、1×10⁶ CFU/mL为69.7%、1×10⁷ CFU/mL为47.5%、1×10⁸ CFU/mL为26.6%、1×10⁹ CFU/mL为48%；防治效果：1×10⁸ CFU/mL时>67.4%；统计：p < 0.05
3.2 枯草芽孢杆菌L1-21对内生和附生微生物多样性的影响
在chao1和observed species指数中，内生菌L1-21处理组（Endo_TR1、2和3）的微生物群落较对照组（Endo_CR1、2和3）有所下降，但由于物种数不同，chao1和observed species的P值（p = 0.13）和Benjamini-Hochberg FDR校正q值（q = 0.152）显示处理组间物种丰富度无统计学显著差异（图2A）。
同样，在Shannon均匀度指数中，所有处理组（Endo_TR1、2和3）的内生微生物群落较对照组（Endo_CR1、2和3）下降，组间差异p值为（p = 0.095；q = 0.152），但差异不显著。虽然可能观察到一些变化（如End_CR2变异性大于其他组），但均无统计学意义。
在Simpson指数中，除Endo_TR1外，处理间物种分布相对均匀，但无显著差异，p值为（p = 0.12；q = 0.152），处理组间均匀度或优势度无显著差异。Faith's PD系统发育多样性指数（p = 0.46；q = 0.46）显示处理组间系统发育多样性无显著差异。内生微生物群落的Pielou均匀度指数（p = 0.069；q = 0.152）表明组间均匀度有变化，但差异不显著。Good's coverage指数中，所有处理组（Endo_TR1、2和3）的内生芽孢杆菌微生物群落较对照组（Endo_CR1、2和3）增加，p值为（p = 0.054；q = 0.152），表明处理间覆盖率差异接近显著但未达显著水平。
因此，所有α多样性指数在处理组间均无统计学显著差异（所有原始p > 0.05；所有BH校正q > 0.05）。虽然数据中存在可观察趋势（End_CR2在某些指数中显示较高多样性），但均无统计学意义。尽管α多样性比较基于每组30个果实样品，但未来更大样本量的研究仍可能检测到极小的效应量。
在箱线图中，所有对照组（Epi_CR1、2和3）的附生微生物群落α多样性指数在Chao1、observed species、Shannon、Simpson和Pielou均匀度方面均显著高于所有处理组（Epi_TR1、2和3）（p < 0.001；q = 0.017）（图2B）。相应的配对差异记录为：Chao1（p = 0.013）、observed species（p = 0.012）、Shannon（p = 0.0073；q = 0.017）、Simpson（p = 0.0065；q = 0.017）、Pielou均匀度（p = 0.0056；q = 0.017）。
相反，Faith's系统发育多样性（Faith_pd）方面，处理组（Epi_TR1、2和3）的附生微生物群落较对照组显著增加（p = 0.035；q = 0.041）。而Good's coverage方面，处理组与对照组之间无统计学显著差异（p = 0.077；校正q = 0.077），表明所有样品的测序深度覆盖率基本一致。Faith_pd增幅最高记录在Epi_TR1，而Good's coverage最高值出现在Epi_TR3。
【数据】内生α多样性：chao1（p = 0.13；q = 0.152）、Shannon（p = 0.095；q = 0.152）、Simpson（p = 0.12；q = 0.152）、Faith_pd（p = 0.46；q = 0.46）、Pielou（p = 0.069；q = 0.152）、Good's coverage（p = 0.054；q = 0.152）；附生α多样性：Chao1（p = 0.013）、observed species（p = 0.012）、Shannon（p = 0.0073；q = 0.017）、Simpson（p = 0.0065；q = 0.017）、Pielou（p = 0.0056；q = 0.017）、Faith_pd（p = 0.035；q = 0.041）、Good's coverage（p = 0.077）；组间比较：p < 0.001；样品量：30果/组
3.3 枯草芽孢杆菌处理影响微生物群落组成和多样性
图3A右侧的PCoA分析沿x轴捕获了57.4%的方差，沿y轴捕获了22.1%的方差。对照组和处理组之间观察到显著差异（p < 0.001）。可见清晰的聚类模式。End_TR1与其他组分离，尤其沿PCo1呈现明显趋势。End_CR2（深蓝色）和End_TR3（绿色）形成紧密聚类，表明微生物组成相似。处理组End_TR3（绿色）也与End_CR1和End_CR2可区分，但与处理组End_CR2非常接近。这些模式表明处理组和对照组之间微生物群落存在明显差异。
图3B中的PCoA显示了对照组和处理组间附生微生物群落的变化，处理组（Epi_TR1和2）间微生物群落多样性存在差异，但Epi_TR3与Epi_TR1关系最密切。对照组附生微生物群落与内生微生物群落关系非常紧密。所有对照组之间无显著差异。因此，虽然PCoA显示对照组和处理组间明显分离，但对照组处理与高剂量处理相比存在一定重叠，表明处理组和对照组的微生物群落相当不同。
图3C（右）径向图分析也显示了不同处理和对照组的具体数值，中心值为147，为各样本提供了共同基线。
【数据】PCoA解释度：x轴57.4%、y轴22.1%；统计：p < 0.001；径向图中心值：147
3.4 分类学组成分析
内生菌（A）和附生菌（B）的堆叠条形图突出了微生物群落的分类多样性和分类完整性。内生菌（C）和附生菌（D）的堆叠条形图显示了所有处理中不同细菌物种的相对丰度。分类学分析显示内生菌中Bacillinae占优势，附生菌中Proteobacteria占优势。
【数据】优势类群：内生菌—Bacillinae；附生菌—Proteobacteria
3.5 功能通路预测
内生微生物群落的功能通路预测表明，柑橘微生物组以生物合成、碳水化合物代谢和能量产生相关通路为主导。
附生微生物群落的功能通路预测同样表明，柑橘微生物组以生物合成、碳水化合物代谢和能量产生相关通路为主导。
内生菌（A）和附生菌（B）的代谢通路均显示显著差异（p < 0.001、0.05、0.01）。功能预测表明氨基酸、碳水化合物和脂质代谢以及能量产生通路发生变化，暗示内生菌L1-21存在时柑橘微生物组的代谢能力明显不同。
【数据】功能预测：生物合成、碳水化合物代谢、能量产生通路主导；代谢通路差异：p < 0.001、0.05、0.01
3.6 系统发育与网络分析
内生菌（A）和附生菌（B）中不同ASV（扩增子序列变异）的系统发育树显示处理组与对照组之间存在显著相对丰度差异（p < 0.001）。内生菌（C）和附生菌（D）微生物群落的网络图显示，施用L1-21后微生物互作增强。
【数据】ASV系统发育差异：p < 0.001；网络分析：L1-21施用后微生物互作增强
讨论与解读
植物表面（附生菌）和植物组织内部（内生菌）存在大量微生物群落。微生物定殖于果蔬组织，与宿主建立从互惠到中性或致病的多样化互作关系，形成高度特化的群落，对宿主的生长、发育和健康至关重要。一些病原菌入侵导致果蔬采后腐烂，造成重大损失。然而，阐明天然生态系统、病原菌、柑橘和酵母之间的潜在关系是一项重要且困难的挑战。因此，研究采后贮藏期间微生物群落内的复杂互作将增进对枯草芽孢杆菌L1-21生防机制的理解，这对采后生物管理的商业化应用至关重要。采后果实微生物组研究方法包括扩增子测序和宏基因组测序及相关技术，这些方法的出现促进了有益微生物处理后果蔬表面微生物群落变化的研究。
编译者解读
本研究将生防效果评估与微生物组分析有机结合，不仅验证了L1-21的防效，更揭示了其作为微生物组调控因子的双重角色。1×10⁸ CFU/mL为最佳应用浓度，67.4%的防治效果在采后病害防控中具有实用价值。值得注意的是，附生微生物多样性显著下降而内生Faith_pd显著上升的现象提示，L1-21可能通过重塑表面微生物群落来抑制病原菌，而非简单直接拮抗。但研究对L1-21在果实表面定殖动态的追踪不足，且功能预测仅基于16S rRNA数据推断，尚需宏转录组或代谢组学验证。未来可结合菌株标记追踪与多组学分析，深入解析其调控微生物群落的分子机制。
参考来源
Mawdod, P. A. (2027). Postharvest application of Bacillus subtilis L1-21 modulates the citrus microbiome and effectively controls Penicillium digitatum. Postharvest Biology and Technology. DOI: 10.1016/j.postharvbio.2026.114635
DOI: 10.1016/j.postharvbio.2026.114635