来源：Integrated production of levan and hyaluronic acid in Bacillus subtilis: Metabolic bottleneck analysis using enzyme constraint genome-scale modeling and process economics（Bioresource Technology Reports）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
左聚糖（levan）与透明质酸（HA）是化妆品与制药工业中需求快速增长的两类生物聚合物。本研究以枯草芽孢杆菌为细胞工厂，通过酶约束基因组规模代谢模型（ecGEM）与过程经济学分析（TEA），系统评估以蔗糖为底物联合生产两种聚合物的可行性与经济性。研究发现铵盐摄取是HA合成的主要瓶颈，将铵盐摄取通量从5提升至5.8 mmol gDW⁻¹ h⁻¹可使HA通量提高约8500倍；TEA显示单位生产成本约27.21美元/kg，投资回收期约4.61年，证实了联合生产策略的经济可行性。
研究背景
石油资源日益枯竭与环保压力持续增大，推动合成生物学方法生产天然产物成为研究热点。生物聚合物作为天然大分子，正从化妆品到生物医药等众多行业中取代传统产品。细菌、动物与植物中广泛存在的生物多糖，与蛋白质一样对生命过程至关重要，参与细胞黏附、细胞间互作及免疫系统分子识别。依据重复单体的组成，多糖可分为同多糖（单一重复单体）与杂多糖（两种以上单体）。2025年全球抗衰老化妆品市场规模已达770亿美元，预计2025至2034年间将以6.8%的年复合增长率增长，至2034年达到约1410亿美元。左聚糖与透明质酸在保湿、焕活等化妆品应用中性能相似，需求持续攀升。左聚糖以蔗糖为底物合成时，培养基中残留葡萄糖可被有效利用于合成性质与应用相似的共产物，因此左聚糖与HA的协同合成有望同时降低生产成本并满足市场需求。
研究方法
本研究在作者所在机构的整体研究伦理监督下开展。
2.1 代谢网络重构
代谢网络信息从KEGG数据库获取，以初始底物蔗糖为起点、终产物左聚糖与HA为终点。随后使用UniProt验证蛋白质的功能角色。构建了最小代谢网络以展示代谢物之间的相互联系，包括产物前体、酶及竞争性生物合成途径。
【数据】数据库：KEGG；验证工具：UniProt；底物：蔗糖；产物：左聚糖、HA
2.2 基因组规模代谢模型重构
采用已整合左聚糖生物合成途径的ec_iYO844_lvn模型，该模型基于ec_iYO844基础模型构建。枯草芽孢杆菌ecGEM模型ec_iYO844_lvn包含1011种代谢物、1270个反应和847个基因，适合整合左聚糖与HA联合生产。为异源生产HA，使用COBRA工具箱的"addReactions"函数向ec_iYO844_lvn模型添加反应。鉴定出1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸（DXP）途径中的缺口，并补充了缺失的N-乙酰氨基葡萄糖二磷酸反应。共添加四个新反应以将HA生产整合入枯草芽孢杆菌ec_iYO844_lvn模型（表1）。四个HA相关反应分别由透明质酸合酶（hasA）、UDP-葡萄糖6-脱氢酶（hasB/tuaD）、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（hasC/gtaB）和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶（hasD/glmU）催化，其化学计量、辅因子需求及动力学参数均参考已建立且经实验验证的乳酸乳球菌和谷氨酸棒杆菌基因组规模模型。Badri等人重构了包含类似HA途径的乳酸乳球菌GEM并进行了实验验证，同时鉴定了新的过表达靶点，证实了所建模反应的生理可行性。Cheng等人重构了包含类似反应的GEM，并提供HA滴度达28.7 g/L的实验数据，同时证明了工程化前体供给途径（hasB、hasC）及合酶步骤（hasA）的有效性。这些反应作为将HA反应整合入ec_iYO844_lvn模型的模板。按照其标准，HA聚合物被视为一个单体单元。整合左聚糖与HA反应的完整模型命名为"ec_iYO844_lvn_ha"。
【数据】模型名称：ec_iYO844_lvn_ha；代谢物数：1011；反应数：1270 + 4个新增反应；基因数：847；参考HA滴度：28.7 g/L
2.3 通量平衡分析
FBA通过预测代谢网络中生化反应的通量分布来考察基因组规模代谢模型。该方法可模拟细胞代谢，提供生长速率和底物利用等细胞表型信息。该功能通过求解满足质量平衡约束的线性规划问题实现。FBA在系统生物学和代谢工程中对于理解代谢通量和优化代谢途径至关重要。微分方程以矩阵形式表达，其中'S'代表化学计量矩阵，'v'代表通量矩阵。所有模拟均使用MATLAB 2019b中的COBRA工具箱进行。FBA使用重构模型ec_iYO844_lvn_ha执行。最大蔗糖摄取设定为100 mmol gDW⁻¹ h⁻¹。目标函数初始设定为生物量反应，后改为最大化产物通量。
【数据】软件：MATLAB 2019b + COBRA工具箱；蔗糖摄取上限：100 mmol gDW⁻¹ h⁻¹；目标函数：生物量→产物通量
2.4 简约通量平衡分析
pFBA通过最小化酶使用、营养摄取和总通量同时最大化生长来预测代谢通量分布。基于最大允许通量，pFBA方法鉴定每个基因对模型整体通量的贡献。在特定底物和生物量作为目标函数下，pFBA根据基因在细胞生长中的角色进行分类。分类基于基因组见解：（i）必需基因，（ii）显著pFBA最优基因，（iii）酶学效率较低基因（ELE），（iv）代谢效率较低基因（MLE），（v）pFBA无通量基因。对生长至关重要的代谢基因称为必需基因，缺乏这些基因时无生长发生，基因敲除分析中总通量为零。非必需基因中贡献最优生长速率和最小基因相关通量的称为"OptimaGenes"。在特定底物下不携带通量的反应称为"pFBAnoFluxRxn"，其相关基因称为"pFBAnofluxGenes"。
【数据】基因分类：必需基因、OptimaGenes、ELE、MLE、pFBA无通量基因
2.5 稳健性分析
稳健性分析评估代谢网络对特定反应通量的敏感性，即特定产物形成的最优通量水平与反应输入通量之间的关系，指示代谢网络相对于摄取酶通量水平的稳健性。本研究鉴定了产物形成反应相对于蔗糖摄取及其他代谢物摄取反应的敏感性。稳健性分析使用"robustnessAnalysis"函数执行。
【数据】分析函数：robustnessAnalysis
2.6 基因敲除分析
该技术广泛用于代谢工程和功能基因组学，以研究基因功能、鉴定代谢冗余并通过重定向代谢通量增强代谢物生产。模拟特定基因敲除通过限制反应携带任何通量实现，将上下界设定为0 mmol gDW⁻¹ h⁻¹即可阻断特定反应的通量，模拟敲除。非必需基因被鉴定为可通过单基因和双基因敲除安全敲除。双基因敲除方法提供具有替代功能的基因对信息。双基因删除使用"doubleGeneDeletion"函数执行。
【数据】敲除模拟：上下界设为0 mmol gDW⁻¹ h⁻¹；函数：doubleGeneDeletion
2.7 相对通量跨度分析
移除特定组分可能损害网络的适应性，潜在地增加通过选定反应的通量变异性。这一特性可用于设计最有效的生产菌株，因为通量在网络内被重定向。绝对通量范围被用作每个反应变异性的度量，数值通过相对通量跨度分析确定。
【数据】分析方法：相对通量跨度分析
2.8 Fluxer
使用Fluxer在线服务器（https://fluxer.umbc.edu/）鉴定从初始蔗糖底物到生物量生长目标函数的最短k路径长度。k值为100，表明参与产生最短途径的底物被确定，随后鉴定直接路径。
【数据】工具：Fluxer在线服务器；k值：100
2.9 过程经济学分析
左聚糖与HA（聚合物混合物）联合生产的技术经济模型使用SuperPro Designer v13.1®（Intelligen, Inc.）开发，针对每批次处理1700 kg聚合物混合物的假设工业设施。本研究将左聚糖与HA作为化妆品应用的聚合物混合物进行联合生产建模。聚合物混合物的产量取自FBA结果。模型工厂以批次/半连续模式运行，年运行时长为原文未详述。
【数据】工具：SuperPro Designer v13.1®；批次规模：1700 kg聚合物混合物/批；运行模式：批次/半连续
研究结果
3.1 代谢网络重构
HA生物合成的途径信息从KEGG数据库获取，将其与枯草芽孢杆菌中的前体UDP-α-D-葡萄糖醛酸和UDP-N-乙酰-α-D-氨基葡萄糖关联（图2）。代谢物、酶及其方向性通过酶催化信息转化为代谢网络。该代谢网络以蔗糖为唯一碳源，协同生产左聚糖和异源HA是可行的。左聚糖可直接从蔗糖合成，而HA利用残余葡萄糖间接生产。残余葡萄糖通过多条途径转化为前体UDP-α-D-葡萄糖醛酸和UDP-N-乙酰-α-D-氨基葡萄糖，最终由异源HAS蛋白催化形成HA。鉴定出三条主要细胞生物合成途径——肽聚糖、细胞壁多糖和磷壁酸生物合成途径——与HA生物合成竞争。这些途径竞争α-D-葡萄糖-1-磷酸和UDP-α-D-葡萄糖等中间代谢物，这些代谢物是HA途径形成UDP-α-D-葡萄糖醛酸和UDP-N-乙酰-α-D-氨基葡萄糖（HA的直接前体）的倒数第二个代谢物。总体而言，HA生产与细胞生物合成途径存在竞争。
【数据】底物：蔗糖（唯一碳源）；竞争途径：肽聚糖、细胞壁多糖、磷壁酸生物合成；竞争中间物：α-D-葡萄糖-1-磷酸、UDP-α-D-葡萄糖
3.2 通量平衡分析
以100 mmol蔗糖为碳源时，枯草芽孢杆菌生物量反应可达到的最大通量值为0.624 h⁻¹。左聚糖通量为95.69 mmol gDW⁻¹ h⁻¹。当以HA为目标函数时，观察到极低的通量9.37 × 10⁻⁵ mmol gDW⁻¹ h⁻¹。对贡献HA合成的代谢物通量分析显示，默认水平5 mmol gDW⁻¹ h⁻¹的铵盐摄取是HA通量的主要瓶颈（图2）。因此进行了稳健性分析以确定最佳铵盐摄取浓度。基于稳健性分析结果，将下限提高至5.8 mmol gDW⁻¹ h⁻¹。这使HA通量提升至0.80 mmol gDW⁻¹ h⁻¹。这可能是因为铵盐是首选氮源，尽管枯草芽孢杆菌可利用多种氮源。大多数有机氮分子可由铵盐生成，几乎所有摄取的氮源（如硝酸盐、亚硝酸盐和尿素）在用于生物合成途径前必须转化为铵盐。亚硝酸还原酶通过转运蛋白介导的膜通道将细胞内的亚硝酸盐和硝酸盐转化为铵盐。脲酶将尿素水解为铵盐。铵盐依据外部条件以两种形式存在：游离氨（NH₃）和铵离子（NH₄⁺）。在高的胞外铵离子浓度或碱性pH下，相当比例的铵盐以气态氨（NH₃）形式存在，可能扩散进入细胞。在低铵浓度或酸性pH下，铵离子（NH₄⁺）占主导地位，其转运由AmtB（原NrgA）促进。预测通量值通过利用各聚合物单元的分子量转化为聚合物克单位。转化后的克产量与文献报道的实验产量一并列于表3。文献中左聚糖和HA均由枯草芽孢杆菌菌株生产。野生型枯草芽孢杆菌MTCC441的左聚糖产量为0.48 g/g蔗糖。本研究中建模的枯草芽孢杆菌168菌株（ec_iYO844_lvn_ha）预测左聚糖产量为0.42 g/g蔗糖。Jin等人代谢工程改造的枯草芽孢杆菌E168T/pP43-DU-PBMS显示HA滴度为0.17 g/g蔗糖；本研究在联合生产期间预测了相似的HA产量0.10 g/g蔗糖。
【数据】最大生物量通量：0.624 h⁻¹；左聚糖通量：95.69 mmol gDW⁻¹ h⁻¹；HA通量（默认铵盐）：9.37 × 10⁻⁵ mmol gDW⁻¹ h⁻¹；NH₄⁺摄取下限：5.8 mmol gDW⁻¹ h⁻¹；HA通量（提升后）：0.80 mmol gDW⁻¹ h⁻¹；左聚糖产量预测：0.42 g/g蔗糖；文献左聚糖产量：0.48 g/g蔗糖（MTCC441）；文献HA滴度：0.17 g/g蔗糖；HA产量预测：0.10 g/g蔗糖
3.3 简约通量平衡分析
以蔗糖为唯一碳源的模型pFBA分析鉴定出203个必需基因。生物量和细胞发育不依赖非必需基因，这些基因贡献最优生长速率和最小基因相关通量，是敲除以优化细胞内增值产品生产的有效靶点。共鉴定出645个非必需基因。140个基因被鉴定为ELE，在相同预测生长速率下需要比相应替代途径更多的酶促步骤通量。25个MLE基因需要降低生长速率。枯草芽孢杆菌中165个基因表现出MLE和ELE特征；其中一些基因可能不携带任何通量，表明它们对系统内代谢活性的贡献有限。将目标改为HA同时维持生物量最大通量后，进一步鉴定出90个pFBA OptimaGenes。发现两个额外基因：编码UDP-葡萄糖-6-脱氢酶的tuaD和HAS为必需基因。这揭示了这些酶在HA生产中的整体性作用，表明模型与UDP-葡萄糖-6-脱氢酶和HAS对HA生产至关重要的实验证据一致。
【数据】必需基因：203个；非必需基因：645个；ELE基因：140个；MLE基因：25个；MLE+ELE基因：165个；OptimaGenes：90个；新增必需基因：tuaD、HAS
3.4 基因敲除分析
在有氧条件下以蔗糖为底物进行基因敲除分析。必需基因对生长和生物量生产至关重要，敲除后观察到零生长速率。其他基因形成合成致死对，即单独敲除其中一个基因不影响生长速率，但同时敲除一对基因中的两个则导致枯草芽孢杆菌致死。双基因敲除结果如补充图1所示，蓝色表示无生长，黄色表示完全生长。黄色代表接近1的值，表明双基因删除对生长无显著影响，提示这些基因可能为非必需或存在冗余代谢途径。双基因删除导致无生长以蓝色色调表示。敲除基因对生存或关键过程必不可少且无冗余。两轴上的蓝色线条代表同时删除抑制生长的基因。蓝色线条表示同时敲除时导致生物体致死的基因对。热图中持续蓝色线条代表的基因可能是必需的或参与关键途径，其与其他基因同时删除会终止生长。两轴上的蓝色交叉表示合成致死，即两个非必需基因同时失活时出现致死。敲除分析鉴定出643个非致死基因和95个致死基因对。这些基因用于相对通量跨度分析和OptFlux。枯草芽孢杆菌643个基因中，靶向这些基因进行敲除在特定条件下对生存并非关键，其消除预计可在不影响生物量生长的情况下增强HA生产。
【数据】敲除条件：有氧、蔗糖底物；非致死基因：643个；致死基因对：95对
3.5 枯草芽孢杆菌相对通量跨度
在该基因敲除分析中，鉴定了显著增加目标产物通量的反应，从而确定基因删除靶点并指示高效HA生产的潜在可行性。在特定基因敲除时，所有产物均观察到可变的通量值，其生物量前体的相对通量跨度分析中也有记录。在643个基因中，以下基因在单基因敲除相对通量跨度分析中具有较高的HA产物通量值。因此，这些基因可被敲除以增强HA通量跨度。鉴定出多个基因（原文后续内容未在节选范围内）。
【数据】分析对象：643个非致死基因；筛选标准：单基因敲除后HA通量高值
讨论与解读
HA与左聚糖可在枯草芽孢杆菌中利用蔗糖通过非重叠途径协同生产，且产量可观。两种产物利用不同的糖：左聚糖利用蔗糖的果糖基单元，HA利用剩余的葡萄糖。FBA模型预测左聚糖通量为95.69 mmol gDW⁻¹ h⁻¹/100 mmol gDW⁻¹ h⁻¹蔗糖，与实验产量0.48 g左聚糖/g蔗糖（对应91.25 mM/100 mM蔗糖）相关。氨被鉴定为HA合成中的主要瓶颈底物，在5 mmol gDW⁻¹ h⁻¹铵盐摄取下HA通量仅9.37 × 10⁻⁵ mmol gDW⁻¹ h⁻¹。将铵盐摄取通量提升至5.8 mmol gDW⁻¹ h⁻¹后HA通量增加至0.8001 mmol gDW⁻¹ h⁻¹。敲除分析鉴定出203个必需基因、643个非致死基因和95个致死基因对。模型预测UDP-葡萄糖-6-脱氢酶和HAS为HA生产必需基因，与实验数据一致，证实了模型的准确性。pdhD基因在生物量和HA通量跨度中表现出最大增幅。有趣的是，敲除氧化磷酸化途径中的ctaD基因可增加左聚糖和HA的通量跨度。TEA显示单位生产成本约27.21美元/kg，1700 kg聚合物混合物/批次工艺的投资回收期约4.61年。敏感性分析表明产品售价是影响盈利能力的最关键因素。
编译者解读
本研究将酶约束基因组规模代谢模型与过程经济学分析相结合，为双产物联合生产提供了从分子机制到工业放大的完整评估框架。方法上的亮点在于：通过通量瓶颈定位（铵盐摄取）指导培养基优化，以相对通量跨度筛选基因敲除靶点，再用TEA验证经济可行性，三层递进逻辑清晰。值得注意的是，模型预测的HA产量（0.10 g/g蔗糖）低于文献报道的工程菌水平（0.17 g/g蔗糖），说明联合生产在共享碳源时存在固有的产量权衡。未来若能将pdhD和ctaD敲除策略与铵盐供给优化在实验中协同验证，有望进一步逼近模型预测的理论上限。
参考来源
Immanuel, A. Integrated production of levan and hyaluronic acid in Bacillus subtilis: Metabolic bottleneck analysis using enzyme constraint genome-scale modeling and process economics. Bioresource Technology Reports, 2026. DOI: 10.1016/j.biteb.2026.102656
DOI: 10.1016/j.biteb.2026.102656