来源：Matrix matters: Context-driven metabolic shifts in Bacillus cereus and Bacillus subtilis（Food Microbiology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是食品工业中两类关键芽孢杆菌——前者是重要食源性病原菌，后者则与食品腐败及发酵相关。本研究将等温微量热法与靶向代谢组学相结合，系统比较了24株芽孢杆菌在BHI培养基、燕麦饮、牛奶、豌豆水解物及燕麦-豌豆复合基质中的代谢活性。结果发现，菌株的代谢策略高度依赖基质成分：复合基质激发最强碳水化合物代谢，而游离氨基酸释放则呈现物种与基质双重特异性。该研究为食品风险评估与产品设计提供了新视角。
研究背景
微生物污染是食品工业的核心难题。2023年联合国估算，消费者层面约有19%的食品被浪费，对经济、环境和公共健康造成重大影响。革兰氏阳性、可形成芽孢的兼性需氧菌——芽孢杆菌属（Bacillus spp.）在自然界广泛分布，常通过原料进入食品生产系统。其高度抗逆的芽孢使常规加热、酸处理和清洁措施难以彻底控制。蜡样芽孢杆菌是重要的食源性病原菌，可通过肠毒素引发腹泻，或因热稳定、酸稳定的呕吐毒素cereulide导致呕吐。2024年，仅欧盟和英国就报告了127起由蜡样芽孢杆菌毒素引起的食源性暴发，涉及3315例病例、49例住院和9例死亡。然而，不同食品基质如何影响这些菌株的代谢行为，此前缺乏系统研究。
研究方法
2.1 菌株选择
从毒性、遗传特征和来源多样性角度，选取了16株蜡样芽孢杆菌群菌株和8株枯草芽孢杆菌菌株。其中5株枯草芽孢杆菌分离自加纳和布基纳法索的传统发酵食品；2株蜡样芽孢杆菌分离自非洲发酵调味品。所有菌株保存于−80°C甘油管中，使用前划线于脑心浸液（BHI）琼脂平板，随后在BHI肉汤中培养。
【数据】菌株数：16株B. cereus群 + 8株B. subtilis；保存温度：−80°C；培养基：BHI
2.2 全基因组测序
本研究所用枯草芽孢杆菌全基因组序列此前已在Wiedenbein等人（2023）的研究中完成表征，蜡样芽孢杆菌全基因组序列则来自Skriver等人（2026）的工作。
【数据】全基因组来源：Wiedenbein et al. (2023) / Skriver et al. (2026)
2.3 系统发育树构建
采用最新细菌核心基因（UBCG）方法构建系统发育树，基于细菌所有分类层级中发现的92个核心基因的串联序列。使用FastTree生成最大似然系统发育树。系统发育树用分子进化遗传学分析版本11软件（MEGA 11）进行可视化。选择 Halobacillus halophilus DSM 2266（模式菌株）（GenBank: GCA_000284515.1）作为外群对树进行定根。
【数据】核心基因数：92个；建树方法：UBCG + FastTree最大似然法；可视化软件：MEGA 11；外群：H. halophilus DSM 2266
2.4 BHI培养基中蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的等温微量热评估
所有16株蜡样芽孢杆菌和8株枯草芽孢杆菌均在BHI肉汤（Merck）中培养。热量流动测定参照Beilharz等人（2023）的方案并稍作修改。菌株在BHI肉汤中过夜培养（30°C，200 rpm），然后用BHI肉汤稀释至600 nm光密度（OD600）为0.2。接种物以1%接种率与新鲜BHI培养基混合，终体积200 μL，对应初始浓度10⁶ CFU/mL。将接种混合物转移至48孔calPlate™（Symcel AB，瑞典）钛制样品瓶内的塑料内衬管（calWells™，Symcel AB，瑞典）中。使用扭矩扳手以40 cNm的力密封样品瓶，确保封闭系统以监测热交换。未接种的BHI培养基分装至16个参比瓶，每两个样品瓶对应一个参比瓶，以校正BHI本身对系统产热的影响。样品瓶预孵育60分钟以达到温度平衡。随后将板置于Calscreener（Symcel AB，瑞典）中，30°C孵育20小时。
【数据】培养温度：30°C；摇床转速：200 rpm；接种OD600：0.2；接种率：1%；终体积：200 μL；初始浓度：10⁶ CFU/mL；密封扭矩：40 cNm；参比瓶数：16个；预孵育：60 min；孵育温度：30°C；孵育时间：20 h
2.5 食品基质中蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的等温微量热评估
超高温处理（UHT）全脂牛奶（Geia Food A/S，捷克）和UHT燕麦饮（Naturli，丹麦）购自丹麦超市。燕麦-豌豆复合基质的制备：将5% w/w豌豆蛋白水解物（NUTRALYS® PEA F853M-EXP，Roquette，法国）加入市售燕麦饮中，121°C高压灭菌20分钟。豌豆基质的制备：将5% w/w豌豆蛋白水解物加入MilliQ水中，121°C高压灭菌20分钟。豌豆和燕麦-豌豆基质在接种前进行高压灭菌，以溶解豌豆水解物并消除豌豆分离物中存在的污染物。相比之下，UHT燕麦饮不再进一步高压灭菌，因为预实验发现高压灭菌会导致蜡样芽孢杆菌生长受抑。这些热处理的差异在解释代谢结果时已予以考虑。选取3株蜡样芽孢杆菌（Y48H10、SDA GR177、MC67）和3株枯草芽孢杆菌（PRO99、DSM10、DSM21393）在食品基质中培养。细胞在BHI肉汤中过夜培养（30°C，200 rpm），4500 g离心12分钟，用0.9% NaCl溶液洗涤两次。洗涤后的细胞调整至OD600为0.2，以1%接种率和200 μL总体积转移到不同食品基质中。与2.4节类似，将接种混合物转移至48孔calPlate钛制样品瓶内的塑料内衬管中，预孵育60分钟达到温度平衡。未接种的液体食品基质分装至16个参比瓶，每两个样品瓶对应一个参比瓶，以校正基质依赖的系统产热效应。随后将calPlate置于Calscreener中，30°C孵育24小时。
【数据】燕麦-豌豆基质：5% w/w豌豆蛋白水解物 + 燕麦饮，121°C灭菌20 min；豌豆基质：5% w/w豌豆蛋白水解物 + MilliQ水，121°C灭菌20 min；离心：4500 g，12 min；洗涤：0.9% NaCl两次；接种OD600：0.2；接种率：1%；总体积：200 μL；预孵育：60 min；孵育温度：30°C；孵育时间：24 h
2.6 用于代谢谱分析的选定菌株在燕麦、豌豆和燕麦-豌豆基质中的培养
从每个物种各选一株菌（蜡样芽孢杆菌Y48H10和枯草芽孢杆菌DSM21393）进行深入代谢谱分析。洗涤细胞按2.5节方法制备，然后接种至燕麦、豌豆和燕麦-豌豆基质中。使用Radiometer PHM250 pH计（Radiometer Analytical，丹麦）测量各食品基质的初始pH。设置两个生物学重复，每个生物学重复包含四个技术重复。生物学重复定义为从同一BHI平板划线得到的单个菌落，技术重复则来自同一生物学重复经两轮BHI肉汤预培养后的样品。采样时间点为最大微量热生长速率时（蜡样芽孢杆菌约8小时，枯草芽孢杆菌约11小时）和代谢终点（两者均为24小时）。采样后立即合并技术重复，获得约800 μL的最终体积。合并样品用于分析糖和有机酸（2.7节）、游离氨基酸（2.8节），蜡样芽孢杆菌样品另筛查cereulide（2.9节）。
【数据】采样时间点：B. cereus约8 h、B. subtilis约11 h（峰值），两者24 h（终点）；合并体积：约800 μL；生物学重复：2个；技术重复：4个
2.7 单糖和有机酸的定量
将合并后的食品样品技术重复（2.6节）在12000 g、4°C下离心15分钟，上清液经0.45 μm孔径PTFE膜过滤后直接进入HPLC样品瓶，−21°C保存至分析。使用配备示差折光检测器的Agilent 1260 Infinity II LC系统（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，美国）定量单糖和有机酸。流动相为水，流速0.5 mL/min。采用Cation H Bio-Rad Micro-Guard保护柱（30 × 4.6 mm）串联Aminex HPX-87H碳水化合物分析柱（300 × 7.8 mm）（Bio-Rad Laboratories, Inc.；Hercules，CA，美国），35°C等度分离有机酸和单糖。进样量10 μL，运行时间15分钟。色谱数据使用OpenLAB CDS LC Chemstation M8307AA采集、监测和处理。所有化合物通过共注射标准品进行鉴定。定量基于七种标准溶液构建的外标校准曲线——糖类（葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖和蔗糖）和有机酸（乳酸、乙酸和柠檬酸），浓度范围为0.05至10 g/L。
【数据】离心：12000 g，4°C，15 min；滤膜：PTFE 0.45 μm；保存：−21°C；流速：0.5 mL/min；柱温：35°C；进样量：10 μL；运行时间：15 min；标准曲线范围：0.05–10 g/L
2.8 游离氨基酸分析
样品（2.6节）冷冻干燥（Lyovapor L-200，Buchi）两天。每份冻干样品加入1 mL 0.1 M HCl，超声处理（Branson 2210，Emerson）5分钟。取200 μL超声后样品，加入200 μL冰浴冷却的12.5%三氯乙酸溶液。4°C孵育2小时后，10000 g离心20分钟。上清液用45 μL新鲜配制的1 M NaOH中和，然后与195 μL 50 μM氨基己酸（内标）混合。游离氨基酸使用HPLC定量，色谱条件（流动相、校准标准和仪器参数）参照Rehlund等人（2025）的描述。除半胱氨酸和脯氨酸外，所有蛋白源游离氨基酸均使用外标校准曲线定量。HPLC数据使用Chromeleon 7.2.7（Thermo Scientific，MA，美国）进行预处理。
【数据】冻干：2天；HCl：1 mL 0.1 M；超声：5 min；TCA：12.5%，200 μL，4°C孵育2 h；离心：10000 g，20 min；NaOH：45 μL 1 M；内标：195 μL 50 μM氨基己酸；未定量氨基酸：半胱氨酸、脯氨酸
2.9 Cereulide定量
（原文此节内容未完整提供，具体操作细节原文未详述。）
【数据】原文未详述
研究结果
3.1 分类学与系统发育
使用UBCG流程（Na et al.，2018）基于蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌菌株的全基因组序列构建了最大似然系统发育树（图2）。鉴于蜡样芽孢杆菌分类学近期的大量更新（Carroll et al.，2022），系统发育中的物种名称反映基于ANIm分析的最接近分类学匹配。这些最佳匹配命名贯穿结果部分使用，而表1同时列出了早期、先前接受的分类学名称。对于BC59和LWL3菌株（此前归类为蜡样芽孢杆菌），其ANIm值对 Bacillus wiedmannii 和 Bacillus pretiosus 均超过物种阈值（>96%）。然而，本研究采用 B. wiedmannii 作为分类学命名，与Mozhaitseva等人（2025）的报道一致——他们报告了这些物种间的基因组相似性并将其归入同一簇。此外，B. pretiosus 在现行细菌命名规则下仍是有效发表但未获正式承认的名称（Oren et al.，2023；Robas Mora et al.，2023），进一步支持使用 B. wiedmannii。共鉴定出五个不同的进化支（图2）：蜡样芽孢杆菌群菌株分为进化支A（B. paranthracis、B. pacificus 和 B. tropicus）、进化支B（B. wiedmannii/ B. pretiosus）和进化支C（B. mycoides）；枯草芽孢杆菌群分为进化支D（PRO31、PRO35、PRO64、PRO99）和进化支E（DSM13019、DSM21393、PRO115和DSM10）。简言之，本研究涵盖了多样的蜡样芽孢杆菌（包含五个不同的基因组亚种）和枯草芽孢杆菌分离株（两个不同的进化支），便于比较系统发育与微量热代谢活性分析之间的关联。
【数据】ANIm物种阈值：>96%；蜡样芽孢杆菌进化支：A、B、C；枯草芽孢杆菌进化支：D、E
3.2 蜡样芽孢杆菌在BHI和食品基质中的代谢活性
为研究受控条件下芽孢杆菌的代谢活性，监测了16株蜡样芽孢杆菌和8株枯草芽孢杆菌的代谢产热曲线。首先在BHI培养基中30°C培养20小时，直至代谢活性达到稳态平台期（图3B）。在20小时培养期间，蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的产热曲线呈现典型的S形模式（图3A）。枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的热流曲线均呈现一个主峰后跟一个肩峰（图3B）。为更好地理解代谢热曲线，将Gompertz模型的拟合参数——微量热延滞时间（h）、最大微量热生长速率（mJ·h⁻¹）和总产热量（mJ）——分别按芽孢杆菌组（cereus vs. subtilis）（图4A）和蜡样芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌群内的系统发育进化支（A、B vs. C；D vs. E）（图4B）作图。
枯草芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌组之间，所有参数均存在显著差异。枯草芽孢杆菌释放的总热量（2732 mJ ± 462）显著高于蜡样芽孢杆菌（1941 mJ ± 566）（p < 10⁻¹⁰）。枯草芽孢杆菌的最大代谢活性（378 mJ·h⁻¹ ± 140）高于蜡样芽孢杆菌（240 mJ·h⁻¹ ± 106）（p < 10⁻⁵）。此外，枯草芽孢杆菌的延滞时间（7.9 h ± 1.0）长于蜡样芽孢杆菌（4.3 h ± 0.8）（p < 10⁻¹⁶）。
在蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌组内部也观察到代谢活性差异。蜡样芽孢杆菌各进化支之间，进化支C的 B. mycoides 菌株产生的总热量（971 mJ ± 292）显著低于进化支A的 B. paranthracis、B. pacificus 和 B. tropicus 菌株（2119 mJ ± 464，p < 10⁻⁵）以及进化支B的 B. wiedmannii 菌株（1839 mJ ± 212，p = 0.01）。此外，最大微量热生长速率在进化支A与B之间（p < 10⁻⁵）以及进化支A与C之间（p < 10⁻⁵）存在显著差异。枯草芽孢杆菌各进化支之间，进化支D菌株的延滞时间（8.6 h ± 0.8）长于进化支E（7.2 h ± 0.7）（p < 10⁻⁵）。
除BHI外，3株蜡样芽孢杆菌（Y48H10、SDA GR177、MC67）和3株枯草芽孢杆菌（PRO99、DSM10、DSM21393）还在牛奶（pH 6.5）、燕麦（pH 7.1）、豌豆（pH 6.9）和燕麦-豌豆（pH 5.8）中30°C培养，监测24小时内的代谢热活性。随后从微量热数据推导Gompertz参数（表2）。枯草芽孢杆菌在食品基质中的微量热延滞时间更为一致，在牛奶中的延滞时间（12.4 h ± 2.7）长于蜡样芽孢杆菌（7.35 h ± 0.5）。最大微量热生长速率随底物显著变化，燕麦-豌豆复合基质高于燕麦（p = 0.002，EMM）、豌豆（p = 0.01，EMM）和牛奶（p < 10⁻⁴，EMM）。在所有食品基质中，24小时后枯草芽孢杆菌产生的代谢热均高于蜡样芽孢杆菌（p = 0.02，EMM），与BHI培养基中20小时的观察结果一致。比较BHI与食品基质中的芽孢杆菌代谢，BHI中的微量热延滞时间显著低于燕麦（p = 0.02，EMM），而其他基质之间无显著差异。
【数据】BHI总产热：B. subtilis 2732 ± 462 mJ vs B. cereus 1941 ± 566 mJ（p < 10⁻¹⁰）；最大代谢活性：B. subtilis 378 ± 140 mJ·h⁻¹ vs B. cereus 240 ± 106 mJ·h⁻¹（p < 10⁻⁵）；延滞时间：B. subtilis 7.9 ± 1.0 h vs B. cereus 4.3 ± 0.8 h（p < 10⁻¹⁶）；进化支C总产热：971 ± 292 mJ vs 进化支A 2119 ± 464 mJ（p < 10⁻⁵）vs 进化支B 1839 ± 212 mJ（p = 0.01）；进化支D延滞时间：8.6 ± 0.8 h vs 进化支E 7.2 ± 0.7 h（p < 10⁻⁵）；牛奶pH 6.5、燕麦pH 7.1、豌豆pH 6.9、燕麦-豌豆pH 5.8；牛奶延滞时间：B. subtilis 12.4 ± 2.7 h vs B. cereus 7.35 ± 0.5 h；燕麦-豌豆最大生长速率 vs 燕麦 p = 0.002、vs 豌豆 p = 0.01、vs 牛奶 p < 10⁻⁴（EMM）
3.3 芽孢杆菌在燕麦、豌豆和燕麦-豌豆基质中生长的代谢谱分析
为评估基质组成如何影响芽孢杆菌代谢活性，特别关注燕麦-豌豆复合基质中观察到的增强代谢峰，进行了靶向代谢组学分析。选取一株枯草芽孢杆菌（DSM21393）和一株产呕吐毒素的蜡样芽孢杆菌（Y48H10）在食品基质中培养，并在两个时间点采样：最大代谢活性时（即最大热流时，蜡样芽孢杆菌8小时，枯草芽孢杆菌11小时）和最小代谢活性时（两者均为24小时）。定量所有样品中的糖、有机酸和游离氨基酸。
为解读靶向代谢组学分析（单糖、有机酸和游离氨基酸）产生的多因素数据，采用主成分分析（PCA）可视化枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌在植物基基质中24小时内的代谢物合成与消耗趋势。PCA显示基质组成是样品分离的主要驱动因素（图5）。PC1（41%方差）与游离氨基酸、半乳糖和果糖相关。相比之下，PC2（25%方差）将豌豆基质与燕麦和燕麦-豌豆分开，反映较低的糖水平（蔗糖、葡萄糖）和较高的柠檬酸含量。
为深入了解驱动PCA分离的因素，分析了糖、有机酸和游离氨基酸的时间变化。基质组成强烈影响糖和有机酸谱。HPLC-RID定量的总糖含量在未接种的燕麦（49.4 ± 1.8 g/L）和燕麦-豌豆（52.6 ± 3.6 g/L，p = 0.001，Tukey，图6A）基质中显著高于豌豆（0.74 ± 0.00 g/L，p = 0.001，Tukey，图6A）。芽孢杆菌发酵显著降低了燕麦-豌豆基质中的总糖量（p = 0.01，双因素ANOVA，EMM）。柠檬酸仅存在于豌豆基质中，在燕麦和燕麦-豌豆中均不存在（图6B），这促成了其在PCA中的独特分离（图5）。
枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的培养导致从峰值代谢（最大热流）到代谢终点的总有机酸增加（p = 10⁻⁵，三因素ANOVA）。燕麦-豌豆基质中有机酸增加最为显著，两个物种均大幅提高乳酸水平（p = 10⁻⁴，EMM，图6B）。相比之下，燕麦和豌豆中有机酸水平的变化较为温和（p > 0.05，EMM）。枯草芽孢杆菌在豌豆上生长期间，柠檬酸被消耗，乙酸被产生。24小时后蜡样芽孢杆菌产生的乙酸多于枯草芽孢杆菌（p = 10⁻⁴，EMM）。
所有未接种基质中均检出游离氨基酸，最高水平出现在（未高压灭菌的）燕麦饮中（图7）。蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌对游离氨基酸谱的影响因基质而异。最显著的效果出现在枯草芽孢杆菌在燕麦上生长和蜡样芽孢杆菌在豌豆上生长时。
【数据】总糖：燕麦 49.4 ± 1.8 g/L、燕麦-豌豆 52.6 ± 3.6 g/L、豌豆 0.74 ± 0.00 g/L（p = 0.001，Tukey）；发酵后燕麦-豌豆总糖降低 p = 0.01（双因素ANOVA）；有机酸增加 p = 10⁻⁵（三因素ANOVA）；乳酸增加 p = 10⁻⁴（EMM）；燕麦、豌豆有机酸变化 p > 0.05（EMM）；乙酸：B. cereus > B. subtilis，p = 10⁻⁴（EMM）
3.4 Cereulide定量结果
（原文此节内容未完整提供，具体数据原文未详述。摘要中提及：cereulide水平呈基质依赖性——燕麦中47.3 ± 1.7 ng/mL，燕麦-豌豆中3.0 ± 0.1 ng/mL，豌豆中未检出。）
【数据】Cereulide：燕麦 47.3 ± 1.7 ng/mL；燕麦-豌豆 3.0 ± 0.1 ng/mL；豌豆 未检出
讨论与解读
本研究通过分析代表不同来源、致病潜力和遗传背景的24株芽孢杆菌，揭示了蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的代谢产热特征。致病潜力——反映在产生肠毒素和/或呕吐毒素的能力上——与系统发育聚类部分吻合，提示遗传谱系与毒素能力之间存在关联。所有产呕吐毒素菌株在ANIm分析中最接近 B. paranthracis，但产呕吐毒素的耐冷菌株 B. mycoides M67除外。产肠毒素菌株在蜡样芽孢杆菌的三个进化支中均有分布，无法通过系统发育或微量热代谢谱加以区分。蜡样芽孢杆菌群内的菌株分类反映了近期的分类学修订：B. wiedmannii 于2016年被提出为新种，B. paranthracis、B. pacificus 和 B. tropicus 于2017年被提出，B. weihenstephanensis 于2018年并入 B. mycoides。尽管蜡样芽孢杆菌群仍需正式的物种级分类框架，全基因组系统发育已支持推断进化支依赖的代谢行为。在BHI中30°C培养时，所有Gompertz参数均显示进化支特异的生长动态。枯草芽孢杆菌的模型估计总产热输出（2745 mJ）高于观测值（2473 mJ），表明其代谢活性在20小时终点之后仍在持续。
编译者解读
本研究将等温微量热法与靶向代谢组学联用，在方法学上颇具巧思——微量热法提供高时间分辨率的代谢活性监测，代谢组学则补充化学层面的机理信息，两者互补使"何时活跃"与"如何代谢"得以关联。特别值得注意的是燕麦-豌豆复合基质中碳水化合物代谢的协同增强效应，这对植物基食品的配方设计具有直接参考价值。cereulide产量的基质依赖性（燕麦中高达47.3 ng/mL而豌豆中未检出）提示，食品基质选择可能直接影响毒素风险水平，这一发现对风险评估具有实际意义。局限在于本研究仅对两株菌进行了深度代谢谱分析，菌株间代谢策略的多样性可能被低估；此外，豌豆基质中cereulide未检出是否与营养限制或特定抑制物有关，值得进一步探索。
参考来源
Skriver, E. V. (2026). Matrix matters: Context-driven metabolic shifts in Bacillus cereus and Bacillus subtilis. Food Microbiology, 2026. DOI: 10.1016/j.fm.2026.105066
DOI: 10.1016/j.fm.2026.105066