基于吖啶酮-肽杂合体的抗菌与抗叶酸药物理性设计

来源：Rational design, synthesis, and evaluation of acridone–peptide based antimicrobial and Antifolate agents against methicilin-resistant Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis and dihydrofolate reductase（Bioorganic & Medicinal Chemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）等耐药菌感染已成为全球公共卫生重大威胁。本研究以二氢叶酸还原酶（DHFR）为靶点，理性设计并合成了一系列吖啶酮-肽杂合体抗菌剂。该类化合物通过膜破坏与胞内DHFR抑制的双重机制发挥抗菌活性，其中化合物7表现最优（DHFR IC₅₀ 0.11 μM），对MRSA和枯草芽孢杆菌均显示良好抑菌效果（MIC 125 μg/mL），且溶血选择性指数超过10倍。研究系统评估了化合物的溶解度、血浆及肝微粒体稳定性、溶血毒性及ADME性质，并通过分子对接、动力学模拟和酶动力学实验揭示了其竞争性抑制模式。

研究背景

抗菌药物耐药性（AMR）因传统抗生素的过度与不当使用而成为全球性医疗威胁。细菌通过生物膜形成、膜通透性降低、靶位点改变及酶解药物等多种途径发展耐药性。2019年AMR导致127万人死亡，预计到2050年将达1000万；经济层面年损失高达46亿美元。金黄色葡萄球菌可引起心内膜炎、肺炎、败血症等多种致命疾病，而MRSA已对β-内酰胺类、四环素类、氟喹诺酮类和大环内酯类抗生素获得显著耐药性。

二氢叶酸还原酶（DHFR，EC 1.5.1.3）是DNA复制中的关键酶，以NADPH为辅因子，在叶酸途径中将二氢叶酸转化为四氢叶酸。DHFR抑制是治疗癌症和微生物感染的公认策略。Bactrim（甲氧苄啶与磺胺甲噁唑联用）是首个获批准的DHFR抑制剂。

研究方法

5.1 一般说明

所有试剂、溶剂和基础设备均购自知名厂商，包括Spectrochem、Sigma Aldrich、loba-chemie等。本工作所用肽类化合物（5、6、9、10、15、16、18–21、24）已在作者前期报道中完成合成与表征。反应通过硅胶（GF-254）薄层色谱（TLC）监测。粗产物经柱色谱分离纯化，根据需要使用60–120目或100–200目硅胶。¹H和¹³C NMR表征以氘代试剂DMSO‑d₆和CDCl₃溶解样品，使用Jeol 400 MHz和Bruker 500 MHz仪器记录。NMR数据分别通过Jeol Delta 5.2.1和Bruker TopSpin 4.1.1软件处理。化学位移（δ）和偶合常数（J）分别以ppm和赫兹（Hz）表示。¹³C/DEPT-135数据用于区分CH₃、CH（正信号）和CH₂（负信号）。HRMS数据在Bruker micrOTOF QII质谱仪上以正、负离子模式记录。化合物7和26的纯度经HPLC评估：取20 μL氯仿样品溶液注入C18色谱柱（4.6 × 150 mm，5 μm），以MeOH:H₂O（55:45）二元梯度流动相在25 °C、流速1.0 mL/min条件下洗脱，紫外检测波长400 nm。生物学研究的荧光和紫外数据在BIOTEK Synergy H1 Hybrid Reader上记录。

【数据】NMR仪器：Jeol 400 MHz / Bruker 500 MHz；HRMS：Bruker micrOTOF QII；HPLC进样量：20 μL；色谱柱：C18（4.6 × 150 mm，5 μm）；流动相：MeOH:H₂O=55:45；流速：1.0 mL/min；温度：25 °C；检测波长：400 nm

5.2 通用操作程序

5.2.1 通用程序A（胺基保护）

取0.01 mol L-氨基酸溶于二氧六环:水（2:1）混合溶剂中，加入0.01 mol 1 N NaOH水溶液，搅拌至澄清溶液。随后加入0.01 mol叔丁基焦碳酸酯（Boc₂O）。反应约2小时，TLC监测至反应完成。蒸除溶剂后，剩余水相用HCl酸化至pH 2。产物用乙酸乙酯萃取，有机层经无水硫酸钠干燥，蒸发后得N-Boc-AA-OH产物。

【数据】氨基酸用量：0.01 mol；NaOH：0.01 mol（1 N）；Boc₂O：0.01 mol；溶剂：二氧六环:水=2:1；反应时间：2 h；酸化pH：2

5.2.2 通用程序B（肽与吖啶酮偶联）

将0.005 mol化合物3溶于干燥DMF中。向反应混合物中加入无水三乙胺（0.006 mol），搅拌5分钟后加入偶联试剂氯甲酸乙酯。反应混合物搅拌过夜，随后蒸除溶剂。产物用乙酸乙酯萃取，依次用5%碳酸钠水溶液和柠檬酸溶液洗涤。乙酸乙酯层经无水硫酸钠干燥后蒸发。以乙酸乙酯:己烷为流动相进行柱色谱纯化。

【数据】化合物3用量：0.005 mol；三乙胺：0.006 mol；偶联试剂：氯甲酸乙酯；反应时间：过夜；洗涤：5% Na₂CO₃水溶液、柠檬酸溶液；纯化：柱色谱（乙酸乙酯:己烷）

5.2.3 通用程序C（N-Boc-AA-AA甲酯水解）

将N-Boc-AA-AA甲酯（0.01 mol）溶于丙酮:水（3:2）中，加入1 N LiOH，室温反应。TLC监测反应完成后，减压低温蒸除丙酮。水相用1 N HCl酸化，产物用乙酸乙酯萃取。有机层经无水硫酸钠干燥并蒸发，得到含游离羧基的氨基酸产物。

【数据】底物：0.01 mol；水解剂：1 N LiOH；溶剂：丙酮:水=3:2；温度：室温；酸化：1 N HCl

5.2.4 通用程序D（Boc基团脱除）

将N-Boc-AA-AA溶于二氯甲烷（DCM）中，加入三氟乙酸（10当量）。反应完成后蒸除DCM，残余TFA用乙醚洗涤除去，得到游离胺基化合物。

【数据】脱保护试剂：TFA（10当量）；溶剂：DCM；洗涤：乙醚

5.2.5 通用程序E（点击化学反应）

将化合物4（3.61 mmol）和氨基酸叠氮化物溶于15 mL t-BuOH:H₂O（9:1）中；CuSO₄·5H₂O（0.72 mmol）和抗坏血酸钠（0.29 mmol）溶于2 mL水后作为催化剂加入。TLC监测反应至原料完全消失，混合物用水稀释，有机层用乙酸乙酯萃取。有机层经Na₂SO₄干燥后蒸发，得吖啶酮-唑-氨基酸产物。以己烷和乙酸乙酯为洗脱剂进行柱色谱纯化，获得纯的唑类衍生物。

【数据】化合物4：3.61 mmol；溶剂：t-BuOH:H₂O=9:1（15 mL）；CuSO₄·5H₂O：0.72 mmol；抗坏血酸钠：0.29 mmol；催化剂水溶液：2 mL；纯化：柱色谱（己烷/乙酸乙酯）

5.3 实验数据

9-氧代-9,10-二氢吖啶-4-羧酸（3）

将2-氯苯甲酸（10 mmol）和邻氨基苯甲酸（10 mmol）溶于异戊醇（10 mL）中，加入铜粉CuO（25 mg）和K₂CO₃（1.5 mg），160 °C加热36小时。真空蒸除溶剂，产物用热水洗涤提取。所得溶液用浓HCl酸化产生沉淀。沉淀干燥过夜后溶于浓H₂SO₄，使中间体环化。将所得酸性溶液逐滴加入冷水中，产物沉淀析出。以氯仿:甲醇（99:1）为洗脱剂进行柱色谱分离，得到纯的吖啶酮酸。黄色固体；产率70%，熔点>300 °C；HRMS（microTOF-QII, MS, ESI）：C₁₄H₉NO₃（M-H⁺）计算值238.0498，实测值238.0206。

【数据】2-氯苯甲酸：10 mmol；邻氨基苯甲酸：10 mmol；异戊醇：10 mL；CuO：25 mg；K₂CO₃：1.5 mg；温度：160 °C；时间：36 h；产率：70%；熔点：>300 °C

丙-2-炔-1-基 9-氧代-9,10-二氢吖啶-4-羧酸酯（4）

将化合物3（4.18 mmol）溶于干燥DMF（30 mL）中，加入碳酸钾（4.18 mmol）、催化量KI和炔丙基溴（8.36 mmol）。TLC监测反应，完成后用乙酸乙酯萃取。有机层经Na₂SO₄干燥并蒸发得产物。黄色固体；产率84%。HRMS（microTOF-QII, MS, ESI）：C₁₇H₁₁NO₃（M+H⁺）计算值278.0811，实测值278.0758。

【数据】化合物3：4.18 mmol；K₂CO₃：4.18 mmol；炔丙基溴：8.36 mmol；DMF：30 mL；产率：84%

甲基（9-氧代-9,10-二氢吖啶-4-羰基）-L-丝氨酰-L-脯氨酸酯（7）

化合物7由化合物6经程序B制得。黄色固体；产率60%，熔点177 °C，[α]D²⁵ = −50°（0.3, MeOH）；¹H NMR（400 MHz, CDCl₃, 25 °C, TMS）δ: 1.94–2.02（m, 3H, CH₂Pro），2.25–2.94（m, 1H, CH₂Pro），3.72（s, 3H, CH₃），3.77–3.95（m, 3H, CH₂Pro），4.05–4.09（m, 1H, CH₂Ser），4.57–4.60（m, 1H, CHPro），5.05–5.10（m, 1H, CHSer），7.09（t, J = 7.6 Hz, 1H, ArH），7.24（d, J = 8.4 Hz, 1H, ArH），7.55（t, J = 7.1 Hz, 1H, ArH），7.70（d, J = 7.5 Hz, 1H, ArH），7.88（d, J = 6.9 Hz, 1H, ArH），8.29（d, J = 7.84 Hz, 1H, ArH），8.45（d, J = 7.8 Hz, 1H, ArH），11.98（s, 1H, NH）。¹³C NMR（101 MHz, CDCl₃）δ: 25.12（−ve, CH₂），28.98（−ve, CH₂），47.52（−ve, CH₂），52.90（+ve, CH₃），55.56（+ve, CH），59.33（+ve, CH），63.45（−ve, CH₂），117.53（ArCH），119.00（+ve, ArCH），121.16（ArC），122.19（+ve, ArCH），122.38（ArC），126.91（+ve, ArCH），132.13（+ve, ArCH），132.33（+ve, ArCH），133.93（+ve, ArCH），140.17（ArC），140.89（ArC），147.03（ArC），168.25（C=O），169.57（C=O），172.95（C=O），178.01（C=O）。HRMS（microTOF-QII, MS, ESI）：C₂₃H₂₃N₃O₆ [M+H⁺] 计算值438.1659，实测值438.2088。

【数据】产率：60%；熔点：177 °C；[α]D²⁵ = −50°（0.3, MeOH）；HRMS计算值438.1659，实测值438.2088

甲基 N²,N⁶-双（9-氧代-9,10-二氢吖啶-4-羰基）-L-赖氨酰-L-脯氨酸酯（11）

化合物11由化合物10经程序B制得。黄色固体；产率42%，熔点163 °C；[α]D²⁵ = −23°（0.3, MeOH）；¹H NMR（400 MHz, CDCl₃, 25 °C, TMS）δ: 1.64–1.77（m, 3H, CH₂Lys），1.86–2.12（m, 6H, 3CH₂Lys + 3CH₂Pro），2.17–2.28（m, 1H, CH₂Pro），3.43–3.60（m, 2H, CH₂Lys），3.64（s, 3H, CH₃），3.79–3.85（m, 1H, CH₂Lys），4.01–4.07（m, 1H, CH₂Lys），4.47–4.55（m, 1H, CHPro），4.93–5.00（m, 1H, CHLys），6.65（t, 1H, J = 7.85 Hz, NH），6.79（t, 1H, J = 7.85 Hz, NH），7.06（t, 1H, J = 7.52 Hz, ArH），7.11–7.15（m, 2H, ArH），7.33–7.42（m, 2H, ArH），7.50（t, J = 7.67 Hz, 1H, ArH），7.72（t, J = 7.37 Hz, 4H, ArH），8.14–8.16（m, 1H, ArH），8.20–8.27（m, 3H, ArH），11.87（s, 1H, NH），11.99（s, 1H, NH）。¹³C NMR（101 MHz, CDCl₃）δ: 22.17（−ve, CH₂），25.20（−ve, CH₂），28.76（−ve, CH₂），29.04（−ve, CH₂），31.24（−ve, CH₂），39.44（−ve, CH₂），47.30（−ve, CH₂），51.48（+ve, CH），52.50（+ve, CH），59.18（+ve, CH），117.63（ArCH），117.73（ArCH），117.81（ArC），118.05（ArC），119.32（+ve, ArCH），119.61（+ve, ArCH），120.93（ArC），121.13（ArC），121.92（+ve, ArCH），122.00（+ve, ArCH），122.01（ArC），122.17（ArC），126.61（+ve, ArCH），126.78（+ve, ArCH），131.12（+ve, ArCH），131.33（后续数据原文未完整呈现）。

【数据】产率：42%；熔点：163 °C；[α]D²⁵ = −23°（0.3, MeOH）

研究结果

3.1 化合物合成

化合物3–26的合成路线如Scheme 1–6所示。吖啶酮-4-羧酸（3）通过邻氨基苯甲酸与邻氯苯甲酸之间的Ullmann型芳基化反应合成，进一步炔丙基化得到化合物4。N-Boc保护的L-丝氨酸以TEA为碱、氯甲酸乙酯为偶联试剂与L-脯氨酸甲酯偶联得到化合物5，脱保护后得含游离胺基的化合物6。化合物6与化合物3偶联得到化合物7（Scheme 2）。类似地，二肽9由Boc-赖氨酸8与L-脯氨酸酯偶联形成；化合物9脱保护得化合物10；化合物10与3偶联得到化合物11及副产物12（其中一个胺基带有乙基甲酸酯基团）。化合物11和12经NaOH碱性水解分别得到化合物13和14（Scheme 3）。化合物10与Boc-脯氨酸偶联得四肽15，进一步脱保护得化合物16；化合物16与3偶联得化合物17（Scheme 4）。同样地，三肽18和19分别由L-脯氨酸与Boc-谷氨酸和Boc-天冬氨酸偶联形成；化合物18和19经TFA处理脱保护得到化合物20和21，再与3偶联得化合物22和23（Scheme 5）。Boc-保护的天冬酰胺与脯氨酸酯偶联形成化合物24，脱除Boc基团后所得化合物25再与3偶联得到化合物26（Scheme 6）。对于化合物27和28的合成，缬氨酸和组氨酸的胺基首先用咪唑-1-磺酰叠氮盐酸盐作为重氮转移试剂转化为相应叠氮化物（Scheme 7）。重氮转移试剂通过叠氮化钠、硫酰氯和咪唑的一锅反应合成。化合物4分别与L-缬氨酸和L-组氨酸叠氮化物发生点击反应，得到化合物27和28。所有合成化合物均经NMR和HRMS表征。

【数据】化合物3合成：Ullmann反应（160 °C，36 h）；化合物7产率：60%；化合物11产率：42%；点击反应：CuSO₄·5H₂O/抗坏血酸钠催化

3.2 体外抗菌、酶抑制免疫分析和构效关系研究

对全部化合物进行了体外DHFR抑制活性评价。化合物7对DHFR表现出最高的抑制效力，IC₅₀为0.11 μM（图4），同时对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA，MIC 125 μg/mL）和枯草芽孢杆菌（MIC 125 μg/mL）具有满意的杀菌效果（表1）。这些结果得到化合物7与DHFR的Phe92和Ala7残基的有效相互作用以及更好的对接评分（−9.25 kcal/mol）的支持。此外，碘化丙啶（PI）摄取实验显示，细菌菌株与化合物7孵育后出现强烈的红色荧光，表明其具有膜破坏特性，支持双重作用机制。其他参数包括适当的亲脂性——合适的LogP值（1.52）和TPSA（128.80 Ų）也验证了化合物7的高生物活性。

化合物11–14包含吖啶酮偶联的脯氨酸和碱性氨基酸赖氨酸的二肽。化合物12与酶口袋中的Gln95和Gln94残基有效相互作用，最终产生良好的酶抑制活性（IC₅₀ 12.17 μM）和对枯草芽孢杆菌的抗菌活性（MIC 62.5 μg/mL），而化合物14无抗菌活性。化合物11中两个吖啶酮单元带来的更高芳香性提供了与非极性残基的连接以及与Asp27、Thr121和Gln95的氢键作用，最终使其对酶具有优异的抑制效力（IC₅₀ 0.48 μM），并在MIC 62.5 μg/mL下抑制枯草芽孢杆菌生长。水解产物化合物13对枯草芽孢杆菌获得良好活性，并有效抑制酶活性。在化合物17中，四肽长链似乎通过与Ala7、Ile14、Ser49、Ile50和Leu28残基的相互作用在酶中提供了良好适配的几何构型。这种优化的几何构型有助于吞噬和杀死枯草芽孢杆菌菌株（MIC 62.5 μg/mL），并产生良好的酶抑制效力。包含脯氨酸、酸性氨基酸谷氨酸和吖啶酮的化合物22对MRSA表现出最高的抗菌活性（MIC 37.5 μg/mL）。尽管其DHFR抑制效力相对较低，但其优异的抗菌活性归因于其膜破坏特性。类似地，化合物23也表现出优异的抑制效力和对枯草芽孢杆菌的抗菌活性。带有天冬酰胺游离酰胺基的化合物26对MRSA（MIC 250 μg/mL）和枯草芽孢杆菌（MIC 62.5 μg/mL）表现出优异的抗菌活性。这些结果得到良好的DHFR抑制（IC₅₀ 0.68 μM）和最佳亲脂性的支持。在化合物27和28中，唑环作为氨基酸和吖啶酮之间的连接体，在DHFR酶口袋内建立关键相互作用，从而抑制酶活性。化合物27与Ala7和Gly94结合，IC₅₀为0.71 μM。同样，化合物28的唑片段与Phe92相互作用，而吖啶酮部分与Ser49和Leu20结合，产生显著的酶活性抑制（IC₅₀ 7.30 μM）。

这些体外结果表明，吖啶酮的π芳香云以及与肽部分胺基和羰基的氢键相互作用在DHFR抑制中起关键作用，而亲脂性/亲水性平衡负责这些杂合体的膜破坏特性。这些发现支持涉及膜破坏和DHFR抑制的双重作用机制。推断酶口袋中的取向、亲脂性/亲水性平衡和取向几何构型决定了吖啶酮-肽杂合体的生物活性。化合物7和26是该系列中最有效的DHFR抑制剂，并表现出良好的ADME性质和低溶血活性。然而，化合物7和26未表现出典型的S形剂量-反应曲线，这凸显了酶抑制测定中仅使用五个浓度的局限性。未来研究将采用扩展的8–12点系列稀释方案，以提高剂量-反应分析和IC₅₀估算的准确性。此外，化合物26对两种细菌菌株均表现出显著的抗菌活性（MIC 62.5 μg/mL）。考虑到其均衡的生物学特性，选择这些化合物进行进一步的生物学评价。

【数据】化合物7 DHFR IC₅₀：0.11 μM；MRSA MIC：125 μg/mL；B. subtilis MIC：125 μg/mL；对接评分：−9.25 kcal/mol；LogP：1.52；TPSA：128.80 Ų；化合物12 IC₅₀：12.17 μM；B. subtilis MIC：62.5 μg/mL；化合物11 IC₅₀：0.48 μM；B. subtilis MIC：62.5 μg/mL；化合物17 B. subtilis MIC：62.5 μg/mL；化合物22 MRSA MIC：37.5 μg/mL；化合物26 IC₅₀：0.68 μM；MRSA MIC：250 μg/mL；B. subtilis MIC：62.5 μg/mL；化合物27 IC₅₀：0.71 μM；化合物28 IC₅₀：7.30 μM

3.3 溶血实验

为评估合成化合物的毒性特征，研究了其对人类红细胞（hRBCs）的作用并测定了HC₅₀——即50%红细胞裂解时的化合物浓度。抗菌药物的效力和对真核细胞的安全性以膜选择性指数（SI）为标志，即MIC值与HC₅₀的比值（HC₅₀/MIC）。大多数化合物的HC₅₀值大于1000 μg/mL，并具有良好的选择性指数。化合物7的HC₅₀为1443 μg/mL，SI为12。同样，化合物26的HC₅₀为1830 μg/mL，SI为30。化合物14对红细胞毒性最低，HC₅₀为2000 μg/mL，SI为32。

【数据】化合物7 HC₅₀：1443 μg/mL；SI：12；化合物26 HC₅₀：1830 μg/mL；SI：30；化合物14 HC₅₀：2000 μg/mL；SI：32

3.4 体外肝微粒体稳定性实验

肝脏是药物代谢中最受关注的器官，肝微粒体中的细胞色素P450（CYP）在辅因子NADPH的氧化还原维持环境中代谢大多数药物。为此，通过差速高转速超速离心从猪肝中提取微粒体，以牛血清白蛋白为标准估算CYP或蛋白质浓度。作用持续时间、口服生物利用度和合适给药方案等多种药代动力学参数强烈依赖于半衰期（t₁/₂）和固有清除率（CLint）。

【数据】微粒体来源：猪肝；提取方法：差速高转速超速离心；蛋白定量标准：牛血清白蛋白；关键参数：t₁/₂、CLint

讨论与解读

本研究设计并合成了一系列具有两亲性质的吖啶酮-肽类DHFR抑制剂作为抗菌剂。设计通过结合金黄色葡萄球菌DHFR口袋的分子对接得到验证。这些化合物通过涉及DHFR抑制和膜破坏的双重机制杀死MRSA和枯草芽孢杆菌。基于DHFR酶免疫分析试剂盒和抗菌测试结果，化合物7和26成为最有效的DHFR抑制剂和抗菌剂。进一步的结合和动力学研究也揭示了高效结合和竞争性抑制模式，且降低了催化效率。体外研究表明低溶血毒性和在血浆及肝微粒体中的高效稳定性。这些化合物还表现出抗生物膜活性，时间-杀菌动力学实验显示其杀菌作用模式。化合物7和26的荧光发射光谱显示强度增加，表明它们与细胞膜和核内大分子相互作用。荧光成像通过PI染色证实了细菌杀伤，而化合物7和26也能染色细菌细胞。分子建模、生理实验和微生物菌株研究的结果表明这些化合物作为抗菌剂具有显著效力，支持其未来应用的进一步研究。

编译者解读

该研究体现了合成生物学中"理性设计—表型筛选—机制验证"的完整闭环思维。吖啶酮-肽杂合体的设计巧妙之处在于将DHFR抑制与膜破坏两种机制整合于同一分子骨架，这为应对耐药性演化提供了双保险策略。从应用角度，化合物7以0.11 μM的IC₅₀和1443 μg/mL的HC₅₀展示了良好的治疗窗口，但其非典型剂量-反应曲线提示筛选浓度的设计仍有优化空间。未来若能将多靶点策略与体内药效验证结合，将更全面评估该类杂合体的临床转化潜力。

参考来源

Jaglan S. Rational design, synthesis, and evaluation of acridone–peptide based antimicrobial and Antifolate agents against methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis and dihydrofolate reductase. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2026. DOI: 10.1016/j.bmc.2026.118761

DOI: 10.1016/j.bmc.2026.118761