来源：Metabolic engineering strategies for producing decanoic acid and related oleochemicals: 1-decanol, 2-nonanone, and poly(3-hydroxydecanoate) in Escherichia coli（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
中链油脂化学品（C6-C12）在工业润滑剂、表面活性剂、聚合物添加剂等领域应用广泛，但其可持续微生物生产仍面临挑战。本研究以大肠杆菌为底盘，通过工程化改造中链特异性硫酯酶ClFatB3-tr-D10S（C10选择性约70%），结合基因组整合、β-氧化途径利用及补料分批发酵策略，实现了癸酸、1-癸醇、2-壬酮和聚-3-羟基癸酸酯（C10-PHA）等多种C10油脂化学品的克级水平生产，展示了可调、通用的中链油脂化学品微生物合成平台。
研究背景
油脂化学品来源于植物油、动物脂肪和石油化工原料，依据碳链长度、末端官能团及碳骨架结构修饰进行分类。凭借多样的化学性质，油脂化学品广泛应用于生物柴油、表面活性剂、聚合物添加剂、化妆品和制药等领域。全球植物油产量在过去十年增长29%，预计到2034年再增长14%，年产量将达2.35亿吨。中链油脂化学品（C6-C12脂肪酸及其衍生物）因其两亲性特征和独特热力学性质备受关注——中链脂肪酸的脂溶性和溶剂行为使其适用于工业润滑剂、聚合物添加剂和除草剂等农用化学品，而C8-C12脂肪醇的平衡极性使其成为表面活性剂、洗衣剂和个人护理产品配方中不可或缺的组分。然而，目前中链油脂化学品的微生物合成效率仍不理想，亟需开发高效的代谢工程策略。
研究方法
4.1 菌株、试剂、培养基与生长条件
本研究所用全部菌株汇总于表1。大肠杆菌MG1655菌株用于构建脂肪醇生产菌株SM21、YS26和YS31。大肠杆菌K12 MG1655 ΔfadRBAIJ菌株作为基础菌株，用于构建脂肪酸、甲基酮和PHA生产菌株。化学试剂购自Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）或Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。克隆用酶购自New England Biolabs（美国马萨诸塞州伊普斯威奇）。寡核苷酸购自Integrated DNA Technologies, Inc.（美国爱荷华州科拉尔维尔）。PCR凝胶提取和DNA纯化试剂盒购自Qiagen（荷兰芬洛）。
所有实验中，单菌落接种于5 mL LB培养基，加入相应抗生素（羧苄青霉素100 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL、氯霉素34 μg/mL），在37°C、200 rpm旋转摇床中过夜培养，随后接种次级实验培养物。必要时，实验培养物补充相应抗生素以维持质粒选择压力。
生产实验使用MOPS极限培养基（Neidhardt等，1974），含125 mM MOPS、不添加硫胺素，补充10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、2.5 mM泛酸钙、2.7 mM Na₂HPO₄、5 mM硫酸铵、30 mM氯化铵和20 g/L甘油（Kim等，2015）。用于测试fadB同源基因从外源癸酸生产2-壬酮的实验，使用5.5 mL培养基并作如下修改：1.39 mM Na₂HPO₄，不添加生物素、硫胺素或亚硒酸钠，添加0.5 mL十二烷覆盖层，补充0.5 g/L癸酸，同时加入羧苄青霉素、卡那霉素和氯霉素以维持携带fadM-fadD6、fadE和fadB同源基因的三个质粒。
所有摇瓶生产实验中，培养基以0.05起始OD600接种过夜培养物，30°C振荡培养至OD600约0.2，随后加入1 mM IPTG诱导，30°C振荡培养48小时。然后收集细胞用于脂肪酸、脂肪醇、甲基酮和/或PHA分析。
【数据】培养基：LB（过夜培养）/ MOPS极限培养基（生产实验）；抗生素：羧苄青霉素100 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL、氯霉素34 μg/mL；温度：37°C（过夜）/ 30°C（生产）；转速：200 rpm；起始OD600：0.05；诱导剂：1 mM IPTG；诱导时机：OD600约0.2；培养时间：48 h；碳源：20 g/L甘油；MOPS浓度：125 mM；胰蛋白胨：10 g/L；酵母提取物：5 g/L；泛酸钙：2.5 mM；Na₂HPO₄：2.7 mM（外源癸酸实验为1.39 mM）；硫酸铵：5 mM；氯化铵：30 mM；外源癸酸：0.5 g/L；十二烷覆盖层：0.5 mL
4.2 质粒与菌株构建
本研究所用全部质粒汇总于表1。各基因包括Cl fatB3-tr-D10S、fadB同源基因、Ma acr和phaJ2-Pp fadD-phaC2操纵子，通过含指定骨架序列的引物从携带相应基因的载体PCR扩增，采用Gibson Assembly组装PCR产物。所有构建体经DNA测序确认。所有克隆和质粒纯化在大肠杆菌DH5α菌株中进行。
所有基因组整合菌株按照此前描述的CRISPR-Cas9辅助同源重组方案构建（Hernández Lozada等，2018；Mehrer等，2018）。简要而言，Cas9引导切割大肠杆菌染色体基因位点序列，λ-Red重组方案（Li等，2015）用于将含异源基因、侧翼为大肠杆菌基因编码序列上下游各500 bp同源臂的dsDNA替换大肠杆菌基因。
【数据】整合方法：CRISPR-Cas9辅助λ-Red重组；同源臂长度：500 bp；组装方法：Gibson Assembly；克隆宿主：E. coli DH5α
4.3 补料分批生物反应器发酵
补料分批培养使用1-L Infors Multifors生物反应器。过夜培养的种子培养物以0.05初始OD600接种500 mL生产培养基（含20 g/L甘油，有或无50 mL十二烷覆盖层）。反应器操作条件如下：接种后温度控制在30°C，空气流量0.4 L/min，搅拌速率在250 rpm至1000 rpm之间变化以控制溶解氧在40%水平。pH用4 M硫酸和50% v/v氢氧化铵维持在7.0。当OD600达到0.2时，加入终浓度1 mM IPTG诱导细胞。诱导后24小时，向反应器补入20 mL 500 g/L（w/v）甘油（使反应器内甘油起始浓度恢复至20 g/L（w/v））。根据残余甘油浓度继续补料，直至发酵终止。在不同时间点记录脂肪酸、脂肪醇、甲基酮、PHA、甘油和光密度测量值。
【数据】反应器：1-L Infors Multifors；工作体积：500 mL；接种OD600：0.05；温度：30°C；空气流量：0.4 L/min；搅拌：250-1000 rpm（维持DO 40%）；pH：7.0（4 M H₂SO₄ / 50% v/v NH₄OH）；诱导剂：1 mM IPTG；诱导时机：OD600=0.2；补料：诱导后24 h补入20 mL 500 g/L甘油；初始甘油：20 g/L
4.4 脂肪酸和PHA提取
FAME分析中，将2.5 mL培养物转移至10 mL一次性玻璃离心管中，加入125 μL 5 mg/mL的C9和C13游离脂肪酸甲醇溶液作为内标，用于定量偶数碳链脂肪酸。提取和甲酯化步骤按此前描述的程序进行（Grisewood等，2017）。
PHA分析中，将35 mL培养物在8000 × g离心15分钟收集细胞，用25 mL冷去离子水洗涤，冷冻干燥过夜。生物量浓度以冻干细胞沉淀的CDW（细胞干重）确定。PHA提取和甲酯化基于此前描述方法的修改版进行（Braunegg等，1978）。将10 mg冻干细胞转移至10 mL一次性玻璃离心管中，加入2 mL氯仿和2 mL 3% H₂SO₄甲醇溶液（v/v）。加入200 μL 5 mg/mL壬酸甲醇溶液作为内标。混合物在硅油浴中100°C加热24小时，然后加入5 mL 100 mg/mL NaHCO₃水溶液淬灭。混合物剧烈涡旋，1000 × g离心10分钟。通过抽吸去除水层和细胞碎片，氯仿层用配备AOC-20i自动进样器和Restek 30 m、0.25 mm内径RTX-5色谱柱的Shimadzu GC-2010 GC-FID系统分析。GC温度程序如下：60°C保持1分钟，以10°C/min升温至230°C，保持10分钟。PHA含量以CDW百分比表示，通过定量相应的3-羟基脂肪酸甲酯确定。
【数据】FAME分析取样量：2.5 mL；内标：125 μL 5 mg/mL C9/C13游离脂肪酸；PHA分析取样量：35 mL；离心：8000 × g，15 min；冻干样品量：10 mg；消化液：2 mL氯仿 + 2 mL 3% H₂SO₄/甲醇（v/v）；内标：200 μL 5 mg/mL壬酸；消化条件：100°C，24 h；淬灭：5 mL 100 mg/mL NaHCO₃；离心：1000 × g，10 min；GC柱：Restek RTX-5（30 m × 0.25 mm）；GC程序：60°C 1 min → 10°C/min → 230°C 10 min
4.5 PHA纯化与核磁共振波谱分析
粗产物用二氯甲烷/甲醇（DCM/MeOH）作为洗脱剂进行硅胶色谱纯化。纯化后的材料在甲醇中沉淀进一步纯化，获得纯化的聚-3-羟基癸酸酯。¹H NMR、¹³C NMR和HSQC波谱由Bruker Avance 500 MHz波谱仪获得。氘代氯仿（≥99.8 atom %D，无水）作为NMR溶剂。NMR结果显示纯度达到>90%。
【数据】纯化方法：硅胶色谱（DCM/MeOH洗脱）+ 甲醇沉淀；NMR仪器：Bruker Avance 500 MHz；溶剂：氘代氯仿（≥99.8 atom %D）；纯度：>90%
4.6 脂肪醇和甲基酮提取
收集5 mL含10%有机相（十二烷）的培养物用于残余游离脂肪酸和脂肪醇/甲基酮分析。脂肪醇生产实验中，向样品中加入C9和C13游离脂肪酸及C9和C13脂肪醇组成的内标，终浓度150 mg/L。外标用含10%十二烷的5 mL培养基中的偶数碳链脂肪酸（C8-C14）和脂肪醇（C8-C14）配制，加入与样品相同浓度的内标。甲基酮生产实验中，使用2-十二烷酮作为内标，2-壬酮和2-十一烷酮作为外标。
加入内标后，所有样品和外标加入100 μL冰醋酸酸化，涡旋10秒。加入1 mL己烷，样品在1200 rpm涡旋4分钟，然后在3000 g离心10分钟分离相。取900 μL有机相移入GC进样瓶进行定量。有机相样品通过配备Agilent J&W DB-FATWAX Ultra Inert色谱柱（30 m × 0.25 mm，0.25 μm）的GC-MS定量，方法如下：120.0°C保持2:00，以5:00速率升温至140.0°C保持3:00，以20:00速率升温至250.0°C保持6:00。分流比20.0，氦气为载气。
【数据】取样量：5 mL（含10%有机相）；内标浓度：150 mg/L；酸化：100 μL冰醋酸；萃取：1 mL己烷，1200 rpm涡旋4 min，3000 g离心10 min；进样量：900 μL有机相；GC柱：Agilent J&W DB-FATWAX Ultra Inert（30 m × 0.25 mm，0.25 μm）；GC程序：120°C 2 min → 5°C/min → 140°C 3 min → 20°C/min → 250°C 6 min；分流比：20:1；载气：氦气
4.7 残余甘油分析
（原文节选在此处截断，具体步骤原文未详述）
【数据】原文未详述残余甘油分析方法。
研究结果
2.1 代谢工程生产癸酸
异源硫酯酶可与天然磷脂生物合成竞争酰基-ACP中间体，因此优化酶表达对于减轻潜在生长抑制、同时缓解酰基-ACP介导的脂肪酸生物合成反馈抑制至关重要（Lennen和Pfleger，2012；Lennen等，2010；Voelker和Davies，1994；Jiang和Cronan，1994）。为此，研究者将中链特异性硫酯酶Cl fatB3-tr-D10S（Banerjee等，2022）通过CRISPR/Cas9辅助λ-Red重组整合到大肠杆菌K-12 MG1655 ΔfadRBAIJ基因组的fadD和/或fadK位点，由IPTG诱导的PTrc启动子控制，获得单拷贝（YS16）和双拷贝（YS18）整合菌株。删除这些天然β-氧化基因有效防止游离脂肪酸的不期望降解，该策略已被广泛验证可提高脂肪酸产量（Fang等，2021）。
将脂肪酸产量与携带质粒编码Cl fatB3-tr-D10S（PTrc启动子）的菌株进行比较。菌株用1 mM IPTG诱导。质粒系统以及一或两个拷贝硫酯酶整合菌株在脂肪酸滴度方面未显示显著差异（图1A和B），但YS18在生物学重复间表现出更高的一致性。为评估可扩展性，研究者以20 g/L初始甘油浓度的生产培养基对YS18进行补料分批培养（见方法部分）。补入两次后续批次进料以恢复至20 g/L起始甘油水平（图1D）。培养75小时后，YS18产生1.8 g/L总中链脂肪酸，其中癸酸占最终滴度的1.3 g/L（约72%）（图1C）。高浓度中链脂肪酸（如癸酸）已知通过破坏膜完整性和扰乱细胞稳态对大肠杆菌产生毒性（Lennen等，2023）。使用有机覆盖层可将产物从水相中分配出去，通常有利于减轻中链脂肪酸细胞毒性，从而提高细胞活力和产物产量。由于癸酸生产菌株培养期间未检测到显著生长缺陷，本研究未使用有机覆盖层。尽管如此，纳入类似的在线萃取方法可能代表未来研究和放大中进一步提高癸酸滴度的有前景策略。
【数据】整合位点：fadD和/或fadK；启动子：PTrc（IPTG诱导）；菌株：YS16（单拷贝）、YS18（双拷贝）；诱导剂：1 mM IPTG；培养时间：75 h；总中链脂肪酸：1.8 g/L；癸酸：1.3 g/L（约72%）；初始甘油：20 g/L；补料：两次批次进料恢复至20 g/L
2.2 调控途径基因表达实现1-癸醇高产
在癸酸生产平台基础上，研究者进一步开发菌株以利用积累的游离脂肪酸（FFA）库合成1-癸醇。该转化通过共表达结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）酰基-CoA合成酶（Mt fadD6）——将中链脂肪酸重新活化为相应的脂肪酰-CoA——以及海杆菌（Marinobacter aquaeolei VT8）酰基-CoA还原酶（Ma acr）——通过醛中间体催化后续还原为醇（Willis等，2011）（图2A）实现。两拷贝Cl fatB3-tr-D10S（此前确定的最优拷贝数）和一拷贝Mt fadD6整合到大肠杆菌K12 MG1655菌株的fadE和fadIJ位点，获得β-氧化被破坏（即ΔfadEIJ）的菌株SM21。该菌株中内源大肠杆菌fadD保持活性，提供辅助酰基-CoA合成酶活性。
为考察Ma acr拷贝数对途径通量的影响，将一拷贝和两拷贝Ma acr分别整合到SM21染色体上替换ldhA和araBADC基因，获得YS26和YS31。由于染色体表达已知受基因组整合位点影响，这些菌株用于评估基因剂量和位点依赖性表达变化对产物形成的综合效应。随后将所得菌株的癸酸和1-癸醇产量与质粒系统进行比较，以评估潜在途径瓶颈。低拷贝pBBR1载体代表酶表达的代谢上限，一般认为对细胞生长具有可耐受负担，同时提供3-5个额外基因拷贝（Lennen等，2010）。为实现精确转录控制，所有异源基因由正交PTrc启动子调控。培养物在约一次倍增后以1 mM IPTG最大程度诱导，以在将代谢资源转向蛋白表达和油脂化学品合成之前允许初始生物量积累。
YS26（一拷贝ACR整合）产生的脂肪醇滴度与质粒ACR表达相当（P = 0.9712，单因素方差分析与Tukey事后HSD检验；图2B）。然而，再整合一拷贝Ma acr使1-癸醇滴度相对YS26进一步提高140%（P = 0.0231，单因素方差分析与Tukey事后HSD检验），有效超过质粒配置（图2B）。这些结果表明，染色体整合观察到的性能提升可能源于基因剂量和整合位点效应的组合，二者共同促成更有利的代谢平衡，并减少与质粒系统相关的代谢负担或潜在稳态扰动。
鉴于YS26和YS31中观察到大量残余游离脂肪酸（FFA），研究者试图优化MtFadD6表达以增强通向1-癸醇的途径通量。与其在扩大酰基-CoA库中的作用一致，MtFadD6过表达使YS26中残余FFA下降65%（P < 0.0001，单因素方差分析与Tukey事后HSD检验），YS31中下降约70%（P < 0.0001，单因素方差分析与Tukey事后HSD检验）。有趣的是，在YS31背景下，这种改善的活化伴随总脂肪醇滴度的非显著下降（P = 0.2662，单因素方差分析与Tukey事后HSD检验）（图2B）。由于ClFatB3是对酰基-CoA底物活性可忽略的质体酰基-ACP硫酯酶（Voelker，1996；Nam等，2019），该观察可能反映与FFA的ATP依赖性再活化及/或质粒维持相关的能量成本，而非硫酯酶与MtFadD6之间的无效循环。由于总醇滴度下降不显著，FFA库的大量清除促使研究者选择携带pACYC-Mt fadD6的YS31进行补料分批培养。95小时后，培养物达到OD600 31.1（图S1），总脂肪醇滴度约2.25 g/L，残余FFA极低（<0.1 g/L）。该平台最终实现1-癸醇滴度0.947 ± 0.022 g/L（图2C）。
【数据】菌株：SM21（ΔfadEIJ）、YS26（一拷贝Ma acr）、YS31（两拷贝Ma acr）；整合位点：fadE、fadIJ、ldhA、araBADC；诱导剂：1 mM IPTG；YS26 vs 质粒ACR：P = 0.9712；YS31 vs YS26：1-癸醇滴度提升140%，P = 0.0231；MtFadD6过表达后YS26残余FFA下降：65%（P < 0.0001）；YS31残余FFA下降：约70%（P < 0.0001）；YS31总醇滴度变化：P = 0.2662（非显著）；补料分批：95 h，OD600 31.1，总脂肪醇约2.25 g/L，残余FFA <0.1 g/L，1-癸醇0.947 ± 0.022 g/L
2.3 生物勘探fadB同源基因从癸酸生产2-壬酮
为从癸酸合成2-壬酮，研究者利用以Providencia sneebia的β-酮酰基-CoA硫酯酶（PsFadM）为核心的甲基酮生产平台。该酶对中链（C8-C12）β-酮酰基-CoA中间体具有高活性，此前已与C8特异性硫酯酶CupTE组合应用于2-庚酮合成（Hernández Lozada等，2018；Yan等，2020）。本研究通过在外源供给癸酸的E. coli ΔfadRBAIJ中表达Ps fadM、Mt fadD6、来自藤黄微球菌（Micrococcus luteus）的酰基-CoA氧化酶Mlu_11700（Mlu fadE）和pACYC-‘fadB’，靶向生产2-壬酮（图3A，深灰色）。Mlu_11700（Mlu fadE）替代膜蛋白Ec fadE使用，因为此前研究发现其为可溶性酶，对酰基-CoA转化为2-烯酰-CoA具有更高活性和特异性（Goh等，2012；Yan等，2020）。此前研究观察到fadAB复合物常通过不同的链长偏好决定产物谱（Mehrer等，2018；Yan等，2020）。脂肪酸丰富环境中的生物可能拥有比EcFadBA更高效的酶。
（原文节选在此处截断，后续结果内容原文未完整呈现）
【数据】外源癸酸供给；表达基因：Ps fadM、Mt fadD6、Mlu fadE、pACYC-‘fadB’；宿主：E. coli ΔfadRBAIJ；目标产物：2-壬酮
2.4 从内源癸酸补料分批合成2-壬酮
（原文节选在此处截断，后续结果内容原文未完整呈现。图4显示，在批次摇瓶培养中筛选fadB同源基因，YS18（两拷贝Cl fatB3）携带pTrc99a-Mt fadD6-Ps fadM和pBTRCK-Mlu fadE以及不同pACYC-‘fadB’候选（Se fadB、Pp fadB、Vf fadB等），并进行了补料分批合成2-壬酮实验。）
【数据】原文未完整呈现，具体数值未详述
2.5 工程化大肠杆菌生产聚-3-羟基癸酸酯（C10-PHA）
（原文节选在此处截断，后续结果内容原文未完整呈现。图5显示，PHA生物合成途径示意图，以及癸酸生产菌株有或无PHA基因的摇瓶培养比较，包括YS18、YS18-pPHA（质粒携带PHA基因）和YS2系列菌株。）
【数据】原文未完整呈现，具体数值未详述
讨论与解读
本研究旨在通过代谢工程和发酵优化策略，在大肠杆菌K12 MG1655中最大化中链脂肪酸（特别是癸酸）及其衍生物的产量。利用工程化中链特异性硫酯酶ClFatB3-tr-D10S（C10链长特异性>70%），以甘油为底物实现了克/升级别的癸酸及其衍生物油脂化学品（1-癸醇、2-壬酮、聚-3-羟基癸酸酯）的生产。虽然质粒表达提供了便捷高效的基因过表达手段，但本研究目标是生成适合工业过程的稳定菌株。为优化从癸酸中间体到脂肪醇生产的碳通量，研究者系统调控了关键途径基因的表达——具体而言，调节Cl fatB3-tr-D10S和Ma acr的拷贝数与表达水平，同时过表达fadD以促进游离脂肪酸向相应酰基-CoA衍生物的高效活化。研究发现，各两拷贝Cl fatB3-tr-D10S和Ma acr的基因组整合在前体生成和下游转化之间提供了最佳平衡，在残余游离脂肪酸积累最小化的同时实现高1-癸醇滴度。为提高2-壬酮产量，研究者策略性地利用β-氧化途径，使用关键基因fadE和fadB同源基因实现碳链缩短与官能团转化。
编译者解读
该研究展示了合成生物学中"平台化"设计思维的典型范例——通过一个核心酶（ClFatB3-tr-D10S）建立C10前体库，再以模块化方式组合不同下游途径酶，实现多种高值油脂化学品的分岔合成。基因组整合策略替代质粒表达的选择，体现了工业菌株开发中对遗传稳定性和代谢负担的考量，而补料分批发酵数据（癸酸1.8 g/L、1-癸醇约2.25 g/L）验证了该策略的实用潜力。值得关注的是，β-氧化途径的"逆向利用"——将分解代谢途径改造为合成工具——为其他中链产物的生产提供了可推广的范式。不足之处在于部分结果段落原文未完整呈现，发酵参数细节和PHA产量数据尚待补充。
参考来源
Mishra, S. (2026). Metabolic engineering strategies for producing decanoic acid and related oleochemicals: 1-decanol, 2-nonanone, and poly(3-hydroxydecanoate) in Escherichia coli. Metabolic Engineering. DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102495
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102495