来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
柚皮素（naringenin）作为类黄酮生物合成的核心骨架分子，其高效供给是构建高附加值天然产物微生物细胞工厂的关键瓶颈。传统I型查尔酮异构酶（CHI）虽能催化查尔酮环化，但在异源途径中常因活性限制成为通量控制节点。近期发表于《Frontiers in Plant Science》的一项研究报道了一种来源于 *Aconitum fischeri* 的IV型查尔酮异构酶样蛋白AfCHIL，它虽无经典催化活性，却可通过非催化机制显著增强柚皮素的合成通量，为类黄酮代谢工程提供了全新的元件和思路。
研究背景
柚皮素是苯丙烷代谢途径第一个黄酮类产物，也是数百种下游黄酮、异黄酮、花青素等活性分子的直接前体。在微生物细胞工厂中，重建柚皮素合成途径通常需要引入苯丙氨酸解氨酶（PAL）、4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）、查尔酮合酶（CHS）和查尔酮异构酶（CHI）。其中CHI催化查尔酮立体特异性环化生成柚皮素，被认为是限速步骤之一。经典的I型与II型CHI具有明确的酶活性中心，但许多植物基因组中还编码一类与CHI序列同源却缺乏关键催化残基的蛋白，被归类为IV型查尔酮异构酶样蛋白（CHIL）。CHIL最初在拟南芥中被发现时被认为无催化功能，后来逐渐揭示其能通过结合查尔酮底物并辅助其在CHS附近完成正确折叠与环化，从而作为伴侣增强途径通量。然而，不同来源的CHIL功能差异巨大，高效CHIL的挖掘及其在异源代谢工程中的应用仍有待深入。 *Aconitum fischeri* （岩乌头）是一种富含黄酮类化合物的药用植物，其CHIL基因此前未被鉴定。该研究通过转录组挖掘获得AfCHIL，并系统评估了它在酿酒酵母和大肠杆菌中增强柚皮素合成的能力。
研究方法
研究团队首先从 *Aconitum fischeri* 转录组数据中筛选到一条与已知CHIL高度相似的序列，通过PCR克隆获得全长cDNA，命名为 *AfCHIL*。生物信息学分析、多重序列比对及系统发育树确认其属于IV型CHI亚家族，且关键催化位点His残基被其他氨基酸替代，暗示其缺乏经典的异构酶活性。
为验证这一推断，作者将 *AfCHIL* 在大肠杆菌中进行异源表达并纯化重组蛋白，以查尔酮为底物进行体外酶活检测，对照使用具有催化活性的I型CHI。同时，利用等温滴定量热（ITC）和荧光偏振技术分析AfCHIL与底物及产物结合能力。为在体内评估功能，分别构建了酿酒酵母和大肠杆菌柚皮素生产平台。酿酒酵母中，整合了PAL、4CL、CHS以及不同来源CHI（或CHIL）的途径基因，通过不同组合的共表达比较柚皮素产量；大肠杆菌系统中则利用组成型启动子调控途径基因，并引入对香豆酸补料策略。采用HPLC和LC-MS定量分析柚皮素、对香豆酸及查尔酮中间体的积累。为进一步探究机制，设计了CHS-CHIL融合蛋白以及基于BiFC的蛋白互作实验，考察AfCHIL与CHS是否存在物理上相互作用。同时通过启动子替换与拷贝数优化强化AfCHIL表达水平，测试其对产量的剂量效应。
研究结果
体外实验明确表明，重组AfCHIL蛋白无任何可检测的查尔酮异构酶活性，即使在高浓度条件下也不能催化查尔酮生成柚皮素。然而，等温滴定实验显示AfCHIL能够与柚皮素以微摩尔级亲和力结合，而与底物查尔酮结合较弱，这暗示其作用发生在产物释放或稳定阶段，而非直接催化。
体内共表达实验带来了关键的发现。在酿酒酵母中，当单独表达PAL、4CL和CHS时，由于缺少异构酶活性，查尔酮大量积累而柚皮素产量极低（＜2 mg/L）。共表达一个具有催化活性的I型CHI可使柚皮素产量提升至15 mg/L左右。令人惊讶的是，共表达无催化活性的AfCHIL也使柚皮素产量大幅提高至18 mg/L，甚至略高于I型CHI。将AfCHIL与I型CHI同时共表达时，产量进一步跃升至45 mg/L，表现为叠加效应。在大肠杆菌系统中，AfCHIL的引入同样使柚皮素产量相比只含CHI的菌株提高了63%，并明显降低中间产物查尔酮的积累，表明途径代谢流被更顺畅地导向终产物。BiFC和融合蛋白实验证实AfCHIL能够与CHS在细胞内形成复合物，这很可能在空间上促进了查尔酮从CHS活性中心释放后的立即环化，避免不稳定的查尔酮异构化为非天然构型或因氧化而损失。此外，提升AfCHIL的转录水平可剂量依赖性地增加柚皮素产量，但过高的表达会引起细胞代谢负担，最高产量出现在中等强度启动子控制下。
值得注意的是，AfCHIL不仅能加速代谢流通，还显著改善了生产过程中的细胞适应性。共表达AfCHIL的菌株在发酵后期仍然维持较高活细胞比例，上清液中查尔酮类褐色副产物明显减少，提示CHIL通过减少中间产物非特异性反应保护了细胞。
讨论与展望
该研究揭示了AfCHIL作为一种非催化蛋白，通过与CHS形成瞬态复合物并辅助产物立体选择性环化，从而在代谢工程中充当了“分子守护者”。这一发现挑战了以往仅依赖催化型CHI的传统思路，为类黄酮合成途径的性能强化提供了新型功能元件。AfCHIL与I型CHI的协同增效表明两者在机制上具有互补性：CHI提供催化加速，而CHIL通过底物通道化和保护作用减少副反应，二者组合可大幅拉高途径的通量上限。
从应用角度看，AfCHIL的基因源自药用植物，在微生物中表达良好且未发现对宿主产生毒性，具备在实际生产菌株中应用的潜力。同时，其所代表的CHIL伴侣机制或许不仅仅局限于查尔酮环化步骤，在其他不稳定中间体参与的合成途径中，类似的非催化伴侣蛋白可能同样值得挖掘。未来研究可针对AfCHIL与CHS结合界面进行理性设计，通过定向进化提高二者亲和力，进一步降低中间体渗漏。此外，将此伴侣策略推广至花青素、异黄酮乃至聚酮类化合物的异源合成，有望普遍提升产物得率和品质。
当然，该研究仍有一些问题尚待阐明。AfCHIL结晶结构尚未解析，它与CHS及底物的精细作用模式不明；在更复杂的多基因背景下，CHIL是否会对下游酶促步骤产生影响亦需评估。不过，作为一项概念验证研究，它为合成生物学中利用非催化蛋白优化代谢途径打开了新的窗口，说明自然界中那些失去催化活性却保留调控功能的“伪酶”，可能是隐藏在基因组中的宝贵资源。
参考来源
Xu HZ, Lan Y, Xing J, Li Y, Liu L. AfCHIL, a Type IV Chalcone Isomerase, Enhances the Biosynthesis of Naringenin in Metabolic Engineering. *Frontiers in Plant Science*, 2022. DOI: 10.3389/fpls.2022.891066.
DOI: 10.3389/fpls.2022.891066