来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
真菌来源的双吲哚醌类天然产物Terrequinone A凭借独特的双吲哚核心和醌式结构，展现出显著抗肿瘤活性，却受困于自然宿主生长缓慢、产量极低。王丽娟等研究者在《Biotechnology for Biofuels and Bioproducts》发表的研究中，另辟蹊径，以大肠杆菌为底盘，通过模块化代谢工程和关键酶定向改造，首次实现从简单碳源L-色氨酸和异戊二烯醇从头合成Terrequinone A，摇瓶产量达数十毫克每升，为吲哚醌类药物的绿色制造点亮了“细胞工厂”新路径。
研究背景
天然产物是创新药物的重要源泉，其中由真菌曲霉属（*Aspergillus*）产生的Terrequinone A属于双吲哚苯醌类化合物，因其能有效抑制多种癌细胞增殖、诱导凋亡而备受关注。然而，这一明星分子的天然生物合成途径冗长，涉及非核糖体肽合成酶和多个后修饰步骤，且原始宿主遗传操作困难、发酵周期长，导致获取量极低，严重制约了其药物开发进程。
合成生物学的兴起为突破天然产物的产量瓶颈提供了全新范式。利用遗传背景清晰、生长快速、便于大规模培养的工业微生物如大肠杆菌进行异源生产，已成为结构复杂天然产物高效供给的主流策略。此前，已有多个吲哚类衍生物在微生物中成功合成，但具有对称双吲哚醌骨架的Terrequinone A，其生物合成需要两个吲哚单元与一条异戊烯基链进行氧化偶联和环化，反应精细且底物选择性高，在异源宿主中重构完整途径挑战巨大。
该研究的核心突破在于：理性设计了一条在大肠杆菌中导向Terrequinone A的人工合成途径，采用“即插即用”的模块化策略，将途径划分为L-色氨酸供应模块、异戊烯基前体（DMAPP）模块与双吲哚醌核心组装模块，并通过限速酶挖掘、蛋白工程改造和发酵过程优化，一举打通了从可再生原料到终端产物的高效合成路线。
研究方法
研究团队搭建了一条总长跨越多个酶促反应的异源途径。整条路线可分为上游色氨酸骨架强化、中游异戊烯醇利用和下游双吲哚醌组装三大功能模块，在技术上采取了“基因挖掘-模块优化-发酵耦合”的递进策略。
首先，以色氨酸为吲哚供体，为了让碳流更多流向产物，作者通过敲除色氨酸阻遏蛋白TrpR并过表达抗反馈抑制的色氨酸合成酶基因，构建了L-色氨酸高产底盘，使胞内色氨酸库显著扩充。同时，为提供醌环上关键的异戊烯基侧链，引入了来源于链霉菌的异戊二烯醇磷酸化激酶（IPK）途径，使大肠杆菌能够利用外源廉价异戊二烯醇（prenol）高效生成二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP），避免使用昂贵的异戊烯醇焦磷酸异构件，并大幅拉高异戊烯基前体供应。
核心组装模块的构建是难点所在。Terrequinone A的母核由两分子L-色氨酸和一分子DMAPP经缩合、氧化脱羧和二聚化等步骤形成。研究首先从曲霉基因组中挖掘到负责该骨架合成的关键酶——非核糖体肽合成酶TdiA及其搭档硫酯酶TdiB，它们催化色氨酸与DMAPP形成中间体didemethylasterriquinone D。进而，通过细胞色素P450单加氧酶TdiD进行环氧化和氧化重排，最终生成Terrequinone A。作者将*tdiA*、*tdiB*与*tdiD*三个基因经密码子优化后，构建了多顺反子表达载体，并在大肠杆菌中进行功能性共表达。
由于P450酶在细菌中往往表达量低、可溶性差且电子传递需求高，团队特地筛选了多个来源的P450还原酶伴侣，最终选定与TdiD匹配最佳的还原酶CPR进行融合表达，并将融合蛋白N端锚定至膜上以提高催化效率。针对限速步骤，采用易错PCR和饱和突变对TdiA底物通道进行定向进化，获得了特异性提高的突变体。最后，通过正交启动子调节三个模块的表达强度和时序，利用高密度发酵，在5 L发酵罐中系统优化了葡萄糖、异戊二烯醇流加策略，实现了Terrequinone A的高效积累。
研究结果
经上述系统工程化改造后，大肠杆菌摇瓶发酵液中成功检测出特征性蓝色产物，其紫外可见光谱和质谱确认与Terrequinone A标准品完全一致，证实异源合成路线全面贯通。
模块优化数据显示，增强色氨酸供应后，胞内色氨酸浓度提升约6倍，Terrequinone A产量相应提高了3.2倍。在DMAPP前体供给端，引入IPK途径并以异戊二烯醇为底物后，前体浓度比传统的MVA途径提升2.5倍，同时生产成本降低约40%，显示出显著的工业适应性。
核心模块中，组合表达TdiA、TdiB和TdiD-还原酶融合蛋白的菌株摇瓶产量达到38.5 mg/L，对照无还原酶融合的菌株产量不足4 mg/L，证明电子传递链的优化对P450功能至关重要。定向进化筛选到的TdiA突变体（A216V/L387M）使催化效率*K*~cat~/*K*~m~较野生型提高了2.8倍，将整条途径的瓶颈削弱，Terrequinone A滴度进一步提高至56.2 mg/L。通过正交启动子精细调节三模块表达比例后，中间体代谢积累减少70%，产物得率提升至每克色氨酸0.21 g。
在最终的5升发酵罐分批补料培养中，通过控制溶氧和分阶段补加异戊二烯醇，Terrequinone A最高产量达到253 mg/L，比初始菌株提升超过200倍，为目前文献报道的微生物异源合成Terrequinone A的最高水平。同时，产物的细胞外分泌比例高达85%，大大简化了后续分离纯化流程。此外，研究还发现工程菌能够将部分中间代谢流引导至其他双吲哚类似物，通过改变补醇速率实现了产物谱的定向调控，展现出极大的结构多样性拓展潜力。
讨论与展望
本研究首次在模式原核生物大肠杆菌中实现复杂双吲哚醌Terrequinone A的从头合成，不仅突破了天然宿主产量瓶颈，更构建了一套普适性极强的吲哚醌类化合物微生物合成平台。模块化的设计理念使得途径的各部分可独立优化、自由组合，为其他吲哚衍生物如asterriquinones及didemethylasterriquinone D的高效生产提供了直接参照。
值得注意的是，电子传递链工程和异戊二烯醇利用策略的引入，显著降低了生产成本，并解决了P450酶在细菌中活性低的老大难问题，对含有异戊烯基的天然产物生物合成具有示范意义。此外，胞外高比例积累的特性，使下游分离成本大幅降低，更贴近工业化需求。
然而，当前的253 mg/L产率距离商业化发酵生产（通常>10 g/L）尚有差距，未来可从以下几方面继续突破：一是通过基因组尺度代谢模型指导，系统剪除竞争旁路并平衡还原力与能量供给；二是对TdiA等多结构域酶进行更高通量的进化和理性设计，提升底物亲和力与催化周转数；三是探索与结晶、吸附或两相发酵相结合的原位产物分离技术，解除产物抑制并拉动反应平衡。综上所述，该工作为复杂吲哚醌类抗肿瘤先导物的绿色、可持续供给开辟了全新方向，将有力推动Terrequinone A及同类物的药物开发进程。
参考来源
Wang L, Deng Y, Peng R, et al. Metabolic engineering for the biosynthesis of bis-indolylquinone terrequinone A in *Escherichia coli* from L-tryptophan and prenol. *Biotechnology for Biofuels and Bioproducts*, 2023. DOI: 10.1186/s13068-023-02284-5
DOI: 10.1186/s13068-023-02284-5