来源：Enhanced levansucrase expression in Bacillus subtilis via regulatory element optimization for high-yield lactosucrose production from sucrose and lactose（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
乳蔗糖是一种具有益生元特性的功能性三糖，在食品与营养保健品行业应用广泛。本研究在枯草芽孢杆菌中系统筛选了六种果聚糖蔗糖酶，确定来源于Brenneria goodwinii的BgLS为最优酶源，并通过5′非翻译区、N端编码序列及启动子的多层级工程化改造，逐级提升酶表达水平。最终工程菌株发酵酶活达到190.7 U/mL，以200 g/L乳糖和300 g/L蔗糖为底物时乳蔗糖转化率达46.5%，为功能性低聚糖的微生物合成提供了高效平台。
研究背景
乳蔗糖是由半乳糖、葡萄糖和果糖构成的特征性三糖。作为一种功能性不可消化低聚糖，它具有显著的生理益处，已被商业化应用于食品和营养保健品领域。在多种益生元低聚糖中，乳蔗糖表现出优越的益生元活性，能显著促进有益菌增殖和短链脂肪酸产生。大量研究表明，乳蔗糖具有抗炎、免疫调节、促进钙吸收、降低血糖、减少肠道脂质吸收、抗过敏和抗抑郁等多种潜在功效。此外，它还可作为蔗糖替代品或膳食纤维应用于烘焙食品、饼干、面包和酸奶等食品体系中。乳蔗糖可由三种酶催化乳糖和蔗糖生物合成：果聚糖蔗糖酶（EC 2.4.1.10）、β-呋喃果糖苷酶（EC 3.2.1.26）和β-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.23）。其中果聚糖蔗糖酶和β-呋喃果糖苷酶以蔗糖为供体催化转果糖基反应生成乳蔗糖。
图1显示六种重组菌株的SDS-PAGE分析及体积酶活测定结果。EaLS在胞内和胞外均有检出，胞内略多；BgLS、LmLS和LrLS1主要保留在胞内，上清中仅检出痕量；BsLS主要分泌至胞外；LrLS2在胞内外表达水平均很低。可溶性分析表明，EaLS、LmLS和LrLS1主要存在于不溶性组分中，提示形成大量聚集体或包涵体；而BgLS和BsLS在细胞破碎后主要存在于可溶性组分中，说明它们在枯草芽孢杆菌中折叠良好、溶解性优异。六株重组菌的发酵体积酶活分别为：EaLS-BS 39.8 U/mL、BgLS-BS 43.1 U/mL、BsLS-BS 28.2 U/mL、LmLS-BS 1.4 U/mL、LrLS1-BS 1.3 U/mL、LrLS2-BS 5.3 U/mL。BgLS-BS兼具最高全细胞酶活与良好的可溶性胞内表达，是最具优化潜力的候选酶。
【数据】体积酶活：EaLS-BS 39.8 U/mL；BgLS-BS 43.1 U/mL；BsLS-BS 28.2 U/mL；LmLS-BS 1.4 U/mL；LrLS1-BS 1.3 U/mL；LrLS2-BS 5.3 U/mL
研究方法
试剂、质粒与菌株
本研究使用的所有化学品均为分析纯，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。分子克隆试剂购自宝日医生物技术（北京）有限公司。大肠杆菌JM109用于常规质粒扩增。本研究所涉及的果聚糖蔗糖酶基因来源于前期研究并保存于实验室。这些基因被亚克隆至枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭载体pP43NMK中，受组成型P43启动子控制。枯草芽孢杆菌WG601被选为表达宿主。所有用于质粒构建的引物（列于补充表S1）由金唯智（苏州）合成并经序列验证。
【数据】菌株：E. coli JM109、B. subtilis WG601；载体：pP43NMK；启动子：P43；引物合成：Azenta GENEWIZ
摇瓶培养
将验证正确的重组质粒分别通过化学转化法导入枯草芽孢杆菌WG601。挑取单个转化子菌落接种于5 mL LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中，添加卡那霉素（50 μg/mL），于37°C、200 rpm振荡培养12 h。随后，将1%（v/v）的预培养物转接至50 mL TB培养基中，该培养基含12 g/L胰蛋白胨、24 g/L酵母提取物、12.54 g/L K₂HPO₄、2.31 g/L KH₂PO₄和50 μg/mL卡那霉素。摇瓶培养在33°C、200 rpm条件下进行24 h。
【数据】LB培养基：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl；卡那霉素：50 μg/mL；预培养：37°C、200 rpm、12 h；TB培养基：12 g/L胰蛋白胨、24 g/L酵母提取物、12.54 g/L K₂HPO₄、2.31 g/L KH₂PO₄；转接量：1%（v/v）；培养条件：33°C、200 rpm、24 h
果聚糖蔗糖酶表达与可溶性的SDS-PAGE分析
发酵24 h后，取50 mL培养液于4°C、8,000 × g离心10 min收集菌体。为分析胞内蛋白表达，收集的菌体沉淀用Tris-HCl缓冲液（50 mM，pH 8.0）洗涤两次，然后用同一缓冲液重悬。细胞悬液与5× SDS上样缓冲液混合，于100°C加热5 min使蛋白变性。10,000 × g离心5 min后，取上清进行SDS-PAGE分析。为评估胞外蛋白表达，发酵上清经同样处理后直接进行电泳分析。对于胞内蛋白的可溶性评估，菌体沉淀用裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl、100 mM NaCl，pH 8.0）重悬，并经超声破碎。所得裂解液于4°C、8,000 × g离心10 min，分离可溶性组分与不溶性细胞碎片。两种组分均通过SDS-PAGE分析以确定表达蛋白的可溶性。电泳使用12%分离胶和5%浓缩胶。电泳结束后，蛋白条带用考马斯亮蓝R-250染色显色。
【数据】离心：8,000 × g、10 min、4°C；缓冲液：50 mM Tris-HCl（pH 8.0）；变性：100°C、5 min；裂解缓冲液：50 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、pH 8.0；凝胶：12%分离胶、5%浓缩胶；染色：考马斯亮蓝R-250
乳蔗糖合成用果聚糖蔗糖酶活性的测定
果聚糖蔗糖酶合成乳蔗糖的活性采用全细胞生物催化法评估。摇瓶培养结束后，发酵液离心收集菌体，每次反应使用相当于20 μL发酵液的菌体量。反应总体积为1 mL，含100 g/L蔗糖和100 g/L乳糖，配制于50 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.0）中。反应在50°C振荡水浴中进行5 min以确保充分混合。酶促反应通过将反应混合物煮沸10 min使酶完全失活而终止。终止后，反应混合物用超纯水稀释十倍，经0.22 μm滤膜过滤后进行检测。乳蔗糖浓度通过配备示差折光检测器的高效液相色谱测定。糖分离使用HILIC Asahipak NH2P-50 4E色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm；Shodex HPLC色谱柱）。柱温维持在35°C，乙腈与水（75:25，v/v）的混合物作为流动相，流速设定为0.8 mL/min。一个单位（U）的果聚糖蔗糖酶发酵体积酶活定义为在指定测定条件下，每分钟产生1 μmol乳蔗糖所需的发酵液量。
【数据】反应体系：100 g/L蔗糖、100 g/L乳糖、50 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.0）；反应条件：50°C、5 min；终止：煮沸10 min；稀释：10倍；过滤：0.22 μm；色谱柱：Asahipak NH2P-50 4E（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；柱温：35°C；流动相：乙腈/水=75:25（v/v）；流速：0.8 mL/min；酶活单位定义：1 U = 每分钟产生1 μmol乳蔗糖所需发酵液量
乳蔗糖生产最适条件的确定
为确定全细胞生物催化合成乳蔗糖的最适pH，在50°C下使用一系列覆盖pH 5.0–9.0范围的缓冲液体系进行酶促反应。采用的50 mM缓冲液如下：乙酸钠缓冲液（pH 5.0–6.5）、磷酸钠缓冲液（pH 5.5–7.0）、HEPES缓冲液（pH 6.5–8.0）和Tris-HCl缓冲液（pH 7.0–9.0）。在每个pH条件下，使用与2.4节所述相同的反应组成和程序测定全细胞果聚糖蔗糖酶活性。为评估乳蔗糖生产的最适反应温度，在35至65°C范围内以5°C为间隔进行全细胞反应。所有温度试验均在50 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.0）中进行。观察到的最高酶活定义为100%相对活性，其他pH和温度条件下的活性以相对于该值的百分比表示。
【数据】pH范围：5.0–9.0；缓冲液：50 mM乙酸钠（pH 5.0–6.5）、磷酸钠（pH 5.5–7.0）、HEPES（pH 6.5–8.0）、Tris-HCl（pH 7.0–9.0）；温度范围：35–65°C，间隔5°C；最适温度测试缓冲液：50 mM磷酸钠（pH 6.0）
5′-UTR、NCS和启动子的选择
为增强枯草芽孢杆菌中果聚糖蔗糖酶的表达，系统应用了翻译水平和转录水平两种调控策略。对于翻译水平优化，采用一系列合成的5′非翻译区和N端编码序列来调节翻译起始效率。首先，使用十个合成的5′-UTR替换pP43NMK载体中BgLS编码区上游的天然5′-UTR序列（原始序列：GTGATAGCGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACAC），构建了重组质粒BgLS-1至BgLS-10。另外，设计了十一种不同的NCS来替换BgLS的天然N端10或15个氨基酸残基（取决于所用NCS的长度），生成重组质粒BgLS-11至BgLS-21。根据果聚糖蔗糖酶活性测定结果，选择三个最有效的5′-UTR和三个最有效的NCS进行组合优化。将这些选定元件系统组合，构建了另外九个重组质粒，命名为BgLS-22至BgLS-30。翻译水平优化完成后，进一步通过启动子工程探索转录水平调控。从枯草芽孢杆菌中选取了补充表S2中列出的十二个内源启动子，替换原有的组成型P43启动子，同时保留优化后的5′-UTR结构。该策略构建了重组质粒BgLS-31至BgLS-42。所有重组质粒分别转化至枯草芽孢杆菌WG601中进行果聚糖蔗糖酶表达。所得菌株在相同摇瓶条件下培养，酶表达水平通过酶活测定和SDS-PAGE分析评估，方法如前所述。重组菌株BgLS-BS的相对活性定义为100%。
【数据】天然5′-UTR序列：GTGATAGCGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACAC；5′-UTR数量：10个；NCS数量：11种（替换N端10或15个氨基酸）；组合优化：3×3=9个质粒（BgLS-22至BgLS-30）；启动子数量：12个内源启动子；质粒命名：BgLS-1至BgLS-42
乳蔗糖的全细胞合成
使用从摇瓶培养收获的重组菌株BgLS-BS38进行全细胞乳蔗糖合成优化。生物转化反应在50 mL工作体积、50°C振荡水浴中进行以确保充分混合。乳糖以200 g/L的固定浓度供给，蔗糖浓度从200到500 g/L变化以评估其对乳蔗糖生产的影响。评估了两个水平的全细胞生物催化剂装载量，反应混合物中的最终细胞密度分别调整至OD600值为1.5和3.0。在生物转化过程中，分别于0.5、1、2、3、4和5 h取出0.1 mL溶液并立即加热处理。
【数据】工作体积：50 mL；温度：50°C；乳糖浓度：200 g/L（固定）；蔗糖浓度：200–500 g/L；细胞装载量：OD600 = 1.5和3.0；取样时间点：0.5、1、2、3、4、5 h；取样量：0.1 mL
图2展示了发酵时间优化和全细胞催化条件优化的结果。酶活曲线显示，酶活在发酵早期快速上升，24 h达到最大值，此后逐渐下降。延长发酵时间导致的活性下降可能归因于长时间培养中的蛋白水解降解。因此，选择24 h作为后续实验的最佳收获时间点。pH优化实验在四种缓冲液体系中进行，覆盖pH 5.0–9.0范围，最高酶活出现在pH 6.0的磷酸盐缓冲液中。值得注意的是，该最适pH与纯化酶的一致，说明枯草芽孢杆菌的胞内环境并未显著改变BgLS催化的酸碱需求。温度优化实验在pH 6.0磷酸盐缓冲液中进行，测试了35至65°C的反应温度，BgLS-BS在50°C时表现出最大活性，显著高于纯化酶的40°C最适温度。此外，BgLS-BS在40–50°C范围内保留了超过80%的最大活性。全细胞催化中升高的最适温度可能归因于细胞环境的保护效应——分子伴侣、大分子拥挤效应和膜相关微环境可增强胞内酶的热稳定性。从实际应用角度看，较高的最适反应温度有利于提高底物溶解度、降低微生物污染风险并增强传质效率。
【数据】最适发酵时间：24 h；最适pH：6.0（磷酸盐缓冲液）；最适温度：50°C；40–50°C保留活性：>80%最大活性；纯化酶最适温度：40°C
研究结果
适合在枯草芽孢杆菌中异源表达并生产乳蔗糖的果聚糖蔗糖酶筛选
为鉴定适合在枯草芽孢杆菌中高效生产乳蔗糖的果聚糖蔗糖酶，将六种前期已表征的果聚糖蔗糖酶——分别来源于解淀粉欧文氏菌（EaLS）、Brenneria goodwinii（BgLS）、Brenneria sp. EniD 312（BsLS）、肠膜明串珠菌B-512 FMC（LmLS）、罗伊氏乳杆菌121（LrLS1）和罗伊氏乳杆菌LTH5448（LrLS2）——分别在枯草芽孢杆菌中表达。每种果聚糖蔗糖酶基因均克隆至穿梭载体pP43NMK并转化至枯草芽孢杆菌WG601，获得重组菌株EaLS-BS、BgLS-BS、BsLS-BS、LmLS-BS、LrLS1-BS和LrLS2-BS。摇瓶发酵24 h后，对菌体和培养上清进行SDS-PAGE分析以评估表达和分泌情况。
图3展示了5′-UTR工程化改造菌株的构建与表征结果。通过替换BgLS编码区上游的天然5′-UTR序列为十种合成5′-UTR，构建了重组质粒BgLS-1至BgLS-10。活性测定显示，不同5′-UTR对BgLS表达水平产生了显著影响，其中最优的5′-UTR使体积酶活大幅提升。SDS-PAGE分析进一步证实了酶蛋白表达量的增加与活性提升趋势一致。
【数据】5′-UTR数量：10个合成序列；相对活性以BgLS-BS为100%
通过5′-UTR工程增强BgLS表达
为进一步提高BgLS在枯草芽孢杆菌中的表达，研究了翻译水平调控策略——优化5′非翻译区。5′-UTR通过影响核糖体结合、mRNA二级结构以及核糖体对起始密码子的可及性来控制翻译起始效率，是细菌中蛋白表达水平的关键决定因素。基于前期报道的具有定量翻译强度的人工5′-UTR文库，选取了若干展现高翻译强度的合成5′-UTR。
图4展示了NCS优化菌株的构建与表征结果。通过设计十一种不同的NCS替换BgLS的天然N端10或15个氨基酸残基，构建了重组质粒BgLS-11至BgLS-21。酶活测定结果表明，NCS的替换同样显著影响了BgLS的表达水平，最优NCS进一步提升了体积酶活。SDS-PAGE分析验证了各菌株中酶蛋白表达量的差异。
【数据】NCS数量：11种；替换长度：N端10或15个氨基酸
5′-UTR与NCS的协同优化
基于单因素优化结果，选择三个最有效的5′-UTR和三个最有效的NCS进行组合优化，构建了九个重组质粒BgLS-22至BgLS-30。
图5展示了5′-UTR与NCS协同优化菌株的构建与表征结果。组合优化策略进一步提升了BgLS的表达水平，表明翻译起始效率和N端编码序列对蛋白表达具有协同调控作用。最优组合菌株的体积酶活显著高于单一优化菌株。SDS-PAGE分析显示酶蛋白条带强度与活性数据一致。
【数据】组合优化：3个5′-UTR × 3个NCS = 9个重组质粒（BgLS-22至BgLS-30）
通过启动子优化实现转录水平调控
翻译水平优化完成后，进一步通过启动子工程探索转录水平调控。选取了枯草芽孢杆菌的十二个内源启动子，替换原有的组成型P43启动子，同时保留优化后的5′-UTR结构，构建了重组质粒BgLS-31至BgLS-42。
图6展示了启动子优化菌株的构建与表征结果。不同内源启动子驱动下的BgLS表达水平存在显著差异，其中最优启动子组合使体积酶活进一步提升至190.7 U/mL。SDS-PAGE分析证实了各菌株中酶蛋白表达量的变化与活性数据一致。最终确定的最优工程菌株为BgLS-BS38。
【数据】启动子数量：12个内源启动子；最优菌株：BgLS-BS38；发酵酶活：190.7 U/mL
底物浓度和菌体量对乳蔗糖产率的影响
使用最优重组菌株BgLS-BS38进行全细胞乳蔗糖合成优化。乳糖固定浓度为200 g/L，蔗糖浓度从200到500 g/L变化，细胞装载量分别调整至OD600值为1.5和3.0。
图7展示了底物浓度和菌体量对乳蔗糖产率的影响。当细胞装载量为OD600=1.5时，不同蔗糖浓度下的乳蔗糖产率呈现特定变化趋势。当细胞装载量提高至OD600=3.0时，乳蔗糖产率进一步提升。在最优条件下，即200 g/L乳糖和300 g/L蔗糖、细胞装载量OD600=3.0时，乳蔗糖转化率达到46.5%。
【数据】乳糖：200 g/L（固定）；蔗糖：200–500 g/L；细胞装载量：OD600 = 1.5和3.0；最优转化率：46.5%（200 g/L乳糖 + 300 g/L蔗糖）
讨论与解读
本研究通过系统优化枯草芽孢杆菌中果聚糖蔗糖酶的表达，开发了乳蔗糖全细胞生产体系。在六种异源表达的果聚糖蔗糖酶中，BgLS因其高可溶性胞内表达和优越的全细胞催化活性被确定为最适酶源。通过5′-UTR和NCS工程实现翻译水平调控，显著提升了酶表达和活性。随后利用内源启动子进行转录水平优化，进一步提高了BgLS表达。最终工程菌株的发酵酶活达到190.7 U/mL，以200 g/L乳糖和300 g/L蔗糖为底物时乳蔗糖转化率达46.5%。该工作代表了枯草芽孢杆菌中果聚糖蔗糖酶表达的系统优化，为乳蔗糖全细胞生产提供了高效平台，所建立的整合调控策略为微生物宿主中功能性低聚糖的生产提供了通用框架。
编译者解读
本研究展现了多层级基因表达调控在合成生物学中的系统应用价值——从酶源筛选、翻译元件工程到转录元件替换，每一步都有明确的活性数据支撑决策。全细胞催化策略省去了酶纯化步骤，兼顾了酶稳定性与工艺经济性。值得注意的是，全细胞催化最适温度（50°C）高于纯化酶（40°C），提示细胞环境对酶的稳定化效应可被利用为工艺优势。未来若能将优化后的调控元件组合移植至更接近工业规模的发酵体系，并进一步探索高底物浓度下的产物抑制问题，该平台的产业化前景将更加可期。
参考来源
He, H. (2026). Enhanced levansucrase expression in Bacillus subtilis via regulatory element optimization for high-yield lactosucrose production from sucrose and lactose. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134954
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134954