枯草芽孢杆菌形态与膨润土胶体对石英砂中Eu(III)迁移的

来源：Bacillus subtilis morphology and bentonite colloids govern Eu(III) transport in quartz sand: Mechanisms and machine learning insights（Journal of Hazardous Materials）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

📎 相关工具：蛋白可溶性优化分析

导读

放射性核素在地下环境中的迁移行为受微生物活动深刻影响。本研究系统考察了枯草芽孢杆菌的细胞、孢子、胞外聚合物（EPS）及膨润土胶体（BC）对Eu(III)在石英砂饱和多孔介质中共迁移的影响。研究发现，失活细菌胶体虽表现出更高迁移性，却比活细胞更显著抑制Eu(III)迁移；中性pH/低离子强度条件下，细菌细胞和孢子使Eu(III)迁移效率提升63%。研究整合先进光谱技术与机器学习模型，揭示了微生物介导放射性核素迁移的复杂机制，为高放废物深地质处置安全评估提供了关键数据支撑。

研究背景

放射性核素向地下水、土壤和生态系统的迁移构成严重的环境与公共健康风险。高放废物深地质处置库（DGR）采用多重屏障系统隔离长寿命放射性核素，通常将核废料封装于金属容器中，周围以压实膨润土作为工程屏障，埋深500–1000米。膨润土中微生物多样性已被广泛研究，微生物活动可影响金属容器腐蚀，可能导致放射性核素释放，并影响镅（Am）等放射性核素的迁移行为。因此，理解微生物对放射性核素迁移和环境归趋的影响，对于准确评估处置库风险至关重要。放射性核素的环境迁移性受其与微生物、矿物胶体等复杂物理化学相互作用的显著调控。枯草芽孢杆菌作为典型的革兰氏阳性产孢菌，表现出强吸附能力，可固定放射性核素；而生物胶体则通过络合和 mobilization 作用增强核素迁移。本研究系统探讨细菌细胞、孢子、EPS和膨润土胶体对Eu(III)在石英砂中迁移的多因素耦合影响。

研究方法

2.1 生物胶体制备

枯草芽孢杆菌（CMCC 63501），一种代表性革兰氏阳性产孢细菌，在Luria Broth（LB）培养基中于37°C、180 rpm振荡培养36小时。枯草芽孢杆菌孢子形成在1/10浓度的LB培养基中诱导7天。培养后，通过离心（6347 × g）培养液6分钟收集黄色沉淀物。沉淀用超纯水洗涤并反复离心（3–5次）以去除残留培养基，获得细菌悬浮液。为灭活剩余细胞，细菌悬浮液在80°C水浴中保持10分钟。部分灭活后，细菌在LB培养基中于37°C培养36小时，结果显示枯草芽孢杆菌未能生长，存活率接近零。使用阳离子交换树脂（CER，Dowex Marathon C，20–50目，钠型）技术去除细菌细胞表面EPS。简言之，预先在去离子水中浸泡过夜的CER以2.5 g/g细菌质量的比例加入细胞悬浮液。混合悬浮液随后在4°C下以600 rpm搅拌2.5小时，静置3分钟使CER沉降分离。所得细胞悬浮液使用固定角转子在4°C下离心（8000 rpm，6347 × g）6分钟，然后重悬于去离子水中获得生物胶体。使用微板阅读器（HR802，深圳海创科技有限公司，中国）在600 nm波长处测定生物胶体浓度。

【数据】菌株：B. subtilis CMCC 63501；培养基：LB；温度：37°C；时间：36h（培养）/7天（孢子诱导）/10min（灭活）；转速：180rpm；离心：6347×g，6min；灭活温度：80°C；CER用量：2.5g/g细菌质量；搅拌：600rpm，2.5h，4°C；检测波长：600nm

2.2 表征分析

使用动态光散射仪器（Malvern Zeta-Sizer nano ZS，英国）测量生物胶体的尺寸和zeta电位。细胞疏水性采用微生物-碳氢化合物粘附（MATH）测试研究。将1mL正十二烷和4mL细菌的混合物涡旋2分钟，静置15分钟。使用微板阅读器测定水相中细菌浓度。细胞疏水性根据测定的光密度计算，所有MATH测量均进行三次重复。通过透射电子显微镜（TEM，FEI Tecnai G2 F30，美国）观察枯草芽孢杆菌的微观结构和形态。进一步采用X射线光电子能谱（XPS，Thermo Fisher Scientific）检测样品中碳相关基团的结合能和峰面积。测量使用Al-Kα辐射，高分辨率扫描（50 eV，0.1 eV步长）。数据使用Avantage 6.6.0软件分析。采用荧光激发-发射矩阵（EEM，Hitachi F-7000，日本）分析研究EPS的结构变化和官能团。

【数据】仪器：Zeta-Sizer nano ZS、TEM（FEI Tecnai G2 F30）、XPS（Thermo Fisher Scientific）、EEM（Hitachi F-7000）；MATH测试：1mL正十二烷+4mL细菌，涡旋2min，静置15min；XPS参数：Al-Kα辐射，50eV，0.1eV步长

2.3 柱实验

柱实验在环境温度下进行。Eu(III)储备液通过将精确称量的高纯度Eu₂O₃（99.99%）溶解于浓盐酸中制备。所有其他化学品均为分析纯，未经进一步纯化直接使用。清洗后的石英砂（99% SiO₂，天津科密欧化学试剂有限公司），粒径250–380 μm，湿法分层垂直填充入圆柱形玻璃柱（10 cm长，1.6 cm内径）。石英砂清洗方法参照课题组前期工作。色谱柱两端安装50 μm孔径不锈钢筛网以防止砂粒流失。填充柱最终孔隙度为0.44。孔隙体积（PV）仅指石英砂颗粒间的空隙，不包括颗粒内孔隙。所有柱实验中，PV保持恒定13.65 mL。柱参数详见Table S1。使用蠕动泵以0.61 mL·min⁻¹流速将去离子水向上注入填充柱，以尽量减少空气截留。随后注入10 PV的背景电解质溶液（NaCl），调节至目标pH和离子强度。采用非反应性示踪剂（5.0 mM NaNO₃）测定弥散系数，方法参照前期研究。对于生物胶体和Eu(III)的二元共迁移体系，约12 PV的生物胶体-Eu(III)悬浮液注入柱中，随后用若干PV的无胶体溶液（相同pH和离子强度）进行洗脱。柱实验条件见Table S2。流出液用自动部分收集器定期收集，获得Eu(III)和生物胶体的穿透曲线（BTCs）。混合细菌-Eu(III)流出液样品中的细菌浓度首先使用微板阅读器定量。迁移效率计算为Cₘₐₓ/C₀，其中Cₘₐₓ为BTCs中观察到的最大归一化浓度（C/C₀）。分析完成后，同批样品进行Eu(III)测定。为确保Eu(III)从细菌细胞上完全解吸，每个样品用0.2 mL 5.0 M HNO₃处理，水相中最终解吸浓度为0.5 M。平衡后，样品经膜过滤（0.22 μm孔径），随后使用电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）分析Eu(III)浓度。所有分析技术的检测限均低于样品测量范围，确保样品测量的灵敏度和准确性。每次迁移实验后，将石英柱中砂分为10段，获得滞留分布剖面。

【数据】Eu₂O₃纯度：99.99%；石英砂：99% SiO₂，250–380 μm；柱尺寸：10cm×1.6cm；筛网：50μm；孔隙度：0.44；PV：13.65mL；流速：0.61mL·min⁻¹；背景液：10PV NaCl；示踪剂：5.0mM NaNO₃；注入：12PV；HNO₃解吸：0.2mL 5.0M；滤膜：0.22μm；分段：10段

2.4 数据分析方法

采用经典胶体过滤理论（CFT）计算介质上胶体粘附量和沉积速率系数，计算相关参数列于Table S3。CFT计算所需枯草芽孢杆菌的尺寸和zeta电位值使用Zeta-Sizer nano ZS测量。STANMOD拟合的对流-弥散平衡模型参数根据NaNO₃ BTCs估算。Eu(III)和枯草芽孢杆菌的双位点模型拟合迁移参数见Table S4和Table S5。R²（R² > 0.9）结果表明双位点吸附模型与Eu(III)和枯草芽孢杆菌的BTCs拟合良好。计算和数学模型更多细节见课题组前期工作。

【数据】模型：CFT、双位点模型；拟合优度：R² > 0.9

2.5 机器学习建模

机器学习算法在处理多因素耦合效应方面表现出卓越能力，通过先进的数据处理机制利用综合数据集实现准确的定量预测。采用监督长短期记忆网络（SLSTM）——一种先进的深度学习模型——进行BTC模拟，其算法框架和结构细节见Section S1。SLSTM模型在经典长短期记忆（LSTM）架构基础上，将输入特征和上一步输出均纳入每个循环单元，从而增强学习输出相关时间模式的能力。这种监督记忆结构提高了模型捕获地球化学条件与放射性核素迁移行为之间复杂长程依赖关系的能力。预测模型纳入四个关键输入特征：pH、BC浓度、Eu(III)浓度和NaCl浓度，建立与BTCs及相关参数的可解释机器学习关联。模型接收包含环境变量和前一C/C₀值的拼接输入，共同整合到SLSTM单元的门控计算中。该设计使模型能够同时结合历史输入条件和先前输出的反馈来指导预测。

【数据】模型：SLSTM；输入特征：pH、BC浓度、Eu(III)浓度、NaCl浓度

研究结果

3.1 B. subtilis–Eu(III)二元体系的迁移动力学

细菌活性是控制饱和多孔介质中细菌与污染物共迁移的关键因素。图1展示了活性和非活性枯草芽孢杆菌在不同pH和离子强度下对B. subtilis–Eu(III)在饱和石英砂中共迁移的影响。

尽管BTCs在非平衡迁移条件下常出现拖尾或前伸现象，但本研究中的曲线表现出完美对称性且无拖尾，表明体系处于平衡状态。这一结果归因于所用石英砂的均质性，确保了均匀流动并消除了优先通道。在中性pH和低离子强度条件（1 mM NaCl，pH 6.0）下，枯草芽孢杆菌在多孔介质中表现出增强的迁移性，与单独Eu(III)的有限迁移形成对比。值得注意的是，共迁移体系中Eu(III)的归一化浓度（C/C₀）较其单独迁移显著增加，表明枯草芽孢杆菌胶体通过多孔基质大幅促进了Eu(III)迁移。在此条件下，Eu(III)与石英砂和细菌细胞均发生相互作用，与前期关于细菌胶体可作为污染物迁移有效载体的报道一致。有趣的是，图1a和图1c的对比分析显示活菌和死菌细胞的迁移行为几乎相同。zeta电位和尺寸测量（Table S2）进一步支持了这一相似性，表明两种细胞类型具有相当的胶体稳定性，因此无论细胞活性如何均促进Eu(III)迁移。

为阐明潜在机制，进行了先进光谱分析。7F2和7F1跃迁的荧光强度和峰比变化表明Eu(III)配位环境发生改变（Fig. S1）。此外，吸附的Eu(III)表现出延长的荧光寿命和更少的配位水分子（Table S6），指示内层络合作用。Eu 3d峰位于1135 eV的XPS分析进一步表明肽聚糖组分（如谷氨酸）中的羧基参与Eu(III)结合（Fig. S2），与Sporosarcina bentonitica的报道一致。综上，这些发现证明枯草芽孢杆菌通过形成稳定的内层络合物增强Eu(III)迁移，在中性pH和低离子强度条件下有效充当移动载体。

此外，实验结果揭示了不同pH条件下的不同迁移行为。在pH 6.0和1 mM NaCl浓度下，细菌活性对枯草芽孢杆菌和Eu(III)在石英砂体系中的单独及共迁移行为影响可忽略（图1a）。相比之下，在强酸性条件下观察到显著差异（图1b和图1d）。尽管灭活细菌胶体表现出比活菌更高的迁移性（图1d），但它们对Eu(III)迁移的抑制作用也显著更强（图1b）。这一明显悖论表明，细菌对Eu(III)的吸附并非仅受物理迁移行为控制，而是关键取决于代谢活性，而代谢活性受环境pH深刻调节（Fig. S3）。

几个相互关联的因素可以解释这些现象的潜在机制。在弱酸性环境中，死细胞因细胞壁和细胞膜的部分降解而表现出增强的结构稳定性。这种降解过程暴露了额外的官能团，特别是羧基和羟基，显著增强Eu(III)吸附能力。此外，灭活细胞的表面电荷特性促进了与Eu(III)的有利静电相互作用。相比之下，代谢活性细胞经历持续的表面电荷调节，导致Eu(III)吸附能力下降。这些差异行为因胶体稳定性的变化而进一步放大，如zeta电位测量所示（Table S2）。死细胞胶体保持优异的稳定性，聚集最小，保留了更多可用吸附位点。相反，活细菌细胞在不同环境条件下更易聚集，导致有效吸附位点减少。这些综合因素——结构稳定性、表面电荷特性和胶体行为——共同解释了活菌与灭活细菌体系中观察到的不同吸附容量和迁移行为。

近期研究已确定活细菌细胞可作为污染物迁移的有效载体，这一过程与其胶体稳定性密切相关。这一现象在B. subtilis–Eu(III)二元体系中尤为明显，其中Eu(III)同时与石英砂和细菌细胞相互作用。在较高NaCl浓度（30 mM）下，这些离子与Eu(III)竞争可用吸附位点。Na⁺对表面位点的饱和降低了Eu(III)吸附容量，从而促进其通过多孔介质迁移（图1e）。B. subtilis–Eu(III)共迁移体系中枯草芽孢杆菌的迁移效率（Cₘₐₓ/C₀）表现出显著的Eu(III)浓度依赖性，当Eu(III)浓度从1.0 × 10⁻⁵ M（图1a）增加到3.0 × 10⁻⁵ M（图1f）时，迁移效率从95.4%急剧下降至40.58%。

为阐明这些机制，我们监测了共迁移实验中流入液和流出液中颗粒尺寸和zeta电位（Fig. S4）。结果表明，B. subtilis–Eu(III)异质聚集显著改变了迁移行为，表现为细菌尺寸和表面性质的变化。实验数据显示一致趋势：Eu(III)浓度增加导致细菌颗粒尺寸和zeta电位增大（Table S2），流出液颗粒尺寸呈下降趋势（Fig. S4a）。Eu(III)滞留剖面中观察到的超指数分布模式（Fig. S4c）进一步支持聚集假说，表明细菌聚集降低了胶体稳定性并促进了柱入口处的优先滞留。

总之，B. subtilis–Eu(III)的迁移动力学受细菌迁移性、离子强度和pH依赖性表面相互作用的复杂相互作用控制，其中胶体稳定性起关键作用。在该体系中，Eu³⁺与电负性细菌胶体和石英砂相互作用，吸附主要由带负电结合位点上的静电竞争驱动。将pH降至3.5通过质子化表面位点和减少可用负电荷来降低吸附。相反，增加Eu³⁺浓度通过更大的离子可用性增强吸附。类似地，引入反应性粘土胶体通过表面相互作用进一步促进Eu³⁺吸收。

【数据】B. subtilis迁移效率：95.4%（Eu(III) 1.0×10⁻⁵M）→ 40.58%（Eu(III) 3.0×10⁻⁵M）；pH条件：6.0和3.5；NaCl浓度：1mM和30mM；Eu 3d峰：1135eV

3.2 细菌孢子对共迁移机制的影响

在地下含水层系统迁移过程中，细菌细胞可发生孢子形成，产生能抵抗极端物理和化学胁迫的高度抗性内生孢子。这些代谢休眠的孢子保持活力，直到检测到有利环境条件，此时它们通过复杂的细胞重编程启动萌发并恢复活跃的营养生长。图2展示了细菌孢子在不同pH和离子强度下对B. subtilis–Eu(III)共迁移的影响。

结果揭示了枯草芽孢杆菌细胞（图1c–1e）和孢子在变化溶液条件下介导的Eu(III)不同迁移行为。在低离子强度和中性pH环境中，两种B. subtili

【数据】原文未详述该段具体数值

3.3 EPS对共迁移行为的影响及XPS表征

图3展示了EPS对B. subtilis–Eu(III)共迁移行为的影响及XPS表征结果。

图4展示了不同Eu(III)浓度下EPS的EEM荧光光谱。

【数据】pH = 6.0；CNaCl = 1.0 mM

3.4 膨润土胶体对共迁移的影响

图5展示了膨润土胶体在不同pH和离子强度下对B. subtilis–Eu(III)共迁移的影响。

【数据】C B. Subtilis = 10 mg·L⁻¹；CBC = 25 mg·L⁻¹；CEu(III) = 1.0 × 10⁻⁵ M；Q = 0.61 mL·min⁻¹

3.5 机器学习预测

图6展示了监督长短期记忆网络对训练数据集和测试数据集的预测结果。

图7展示了相关分析结果。

【数据】原文未详述该段具体数值

讨论与解读

微生物在放射性核素固定化中发挥关键作用，通过生物吸附和微生物介导的生物矿化机制实现。值得注意的是，生物矿化可显著降低放射性核素在环境系统中的迁移性和生物可利用性。然而，微生物活动也产生促进放射性核素迁移的生物胶体，使其长期环境归趋复杂化。本研究系统考察了枯草芽孢杆菌与Eu(III)在饱和石英砂中的共迁移行为，重点阐明微生物生物学特性和物理因素对放射性核素迁移和环境归趋的影响。

结果表明，枯草芽孢杆菌根据其形态（细胞或孢子）和环境条件，既可增强也可抑制Eu(III)迁移。在有利条件下，枯草芽孢杆菌通过形成内层络合物作为载体促进Eu(III)迁移。相反，活细胞因在变化环境条件下聚集而表现出降低的吸附容量，减少了有效吸附位点。结构稳定性、表面电荷特性和胶体动力学控制着活菌和灭活细菌体系中不同的迁移行为。值得注意的是，孢子较小的尺寸和球形形态相比杆状细胞增强了Eu(III)迁移效率。此外，EPS去除改变了枯草芽孢杆菌的表面性质，影响其与Eu(III)的相互作用。

编译者解读

本研究巧妙地将传统柱实验、先进光谱表征与机器学习预测相结合，构建了"实验现象—微观机制—智能预测"的完整研究链条。SLSTM模型对多因素耦合迁移行为的预测能力为放射性废物处置安全评估提供了新工具。值得肯定的是，研究区分了细菌活性、孢子形态和EPS等生物学因素对核素迁移的差异化影响，深化了对微生物介导放射性核素环境归趋的认识。然而，实际地质环境远比均质石英砂复杂，未来研究可进一步探索天然矿物异质性条件下的迁移行为，并考虑微生物代谢活动对核素形态的长期影响。

参考来源

Tang Q. Bacillus subtilis morphology and bentonite colloids govern Eu(III) transport in quartz sand: Mechanisms and machine learning insights. Journal of Hazardous Materials, 2025. DOI: 10.1016/j.jhazmat.2025.139449

DOI: 10.1016/j.jhazmat.2025.139449