来源：Copper stress responses in Scenedesmus obliquus–Bacillus subtilis Consortia: Machine Learning-Based prediction of copper removal（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
铜污染是淡水生态系统面临的重要环境问题。本研究构建了斜生栅藻（Scenedesmus obliquus）与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的微藻–细菌联合体系，系统考察了铜胁迫下微藻的生理响应及细菌伙伴的缓解作用。研究发现，联合体在80 ppm高铜浓度下铜去除率达75.4%，显著高于纯藻组的69.0%。研究更将生理生化参数作为输入变量，构建人工神经网络（ANN）模型预测铜去除效率，整体R²达0.9744，预测偏差在±3%以内。
研究背景
铜在生物环境中广泛存在，虽为细胞代谢所必需的微量元素，但高浓度铜可干扰光合作用、酶活性及膜稳定性，对微藻造成显著毒害。微藻作为水生食物网的主要初级生产者，既是金属毒性的敏感指示生物，也是金属修复的潜在工具。其高细胞分裂速率、细胞表面丰富的官能团以及适应多种水生环境的能力，使其能够通过被动或主动吸收有效固定重金属。
传统的微藻重金属处理方法效率有限，且缺乏对处理结果的预测评估手段。本研究旨在探讨斜生栅藻在铜胁迫下的生理行为，评估微藻–细菌联合体的缓解作用，并检验生理生化响应作为机器学习模型输入参数、用于预测不同胁迫条件下铜去除效率的可行性。
研究方法
2.1 实验生物
本实验所用斜生栅藻（Scenedesmus obliquus，CCAP 276/3A）最初分离自未知淡水水体，购自马来亚大学藻类保藏中心（UMACC）。枯草芽孢杆菌ATCC 6633购自Biolution Resources公司。
【数据】菌株：S. obliquus CCAP 276/3A、B. subtilis ATCC 6633；来源：UMACC、Biolution Resources
2.2 微藻与细菌培养条件
斜生栅藻在不含铜的BG-11培养基中培养。对照组不添加Cu（0 mg/L Cu²⁺），四个处理组分别添加20、40、60、80 mg/L的Cu²⁺。参照预实验结果，这些铜浓度分别对应低、中、高和重度铜胁迫。培养温度25°C，光照强度100 μmol m⁻²s⁻¹（白光）。实验持续60小时，每天取样进行生化和生理分析。
枯草芽孢杆菌在BHI无机盐培养基中培养，于对数期（OD₆₀₀ₙₘ = 0.8）以8,000 rpm离心收集。随后将细菌悬液接种至处于对数期（OD₆₈₀ₙₘ = 0.5）的斜生栅藻培养物中。细菌占联合体总量的5%（重量/重量）。纯培养和藻–菌联合体样品均在250 mL Hydro摇瓶中培养，温度25°C，振荡转速150 rpm，持续培养120小时。铜响应评估涵盖急性、中期和长期三个阶段。每个处理设5个重复。
【数据】培养基：BG-11（微藻）、BHI无机盐培养基（细菌）；Cu²⁺浓度：0、20、40、60、80 mg/L；温度：25°C；光照：100 μmol m⁻²s⁻¹；转速：150 rpm；OD₆₀₀ₙₘ = 0.8（细菌收获）；OD₆₈₀ₙₘ = 0.5（微藻接种）；细菌占比：5%（w/w）；培养时间：120 h；重复数：n = 5
2.3 藻细胞生长抑制测定
在第0小时及随后连续5天每日采集样品。使用血球计数板量取10 μL藻悬液测定细胞密度。生长速率（μ）按公式（2.1）计算：
μ = (ln X₁ − ln X₀) / (t₁ − t₀) （2.1）
其中X₀和X₁分别代表所选时间区间起始（t₀）和结束（t₁）时的细胞密度。
【数据】取样时间：0 h起连续5天；样品量：10 μL；计算公式：μ = (ln X₁ − ln X₀)/(t₁ − t₀)
2.4 光合性能测定
使用Water-PAM荧光计（Walz，德国）测量叶绿素荧光参数，包括最大量子效率（Fv/Fm）、有效量子产率（Y(II)）、光合效率（α）、非光化学淬灭（NPQ）和最大相对电子传递速率（rETRmax）。测量前取2 mL藻培养物暗适应15分钟。快速光曲线（RLCs）在0至1208 µmol photons m⁻²s⁻¹的八个光化光梯度下生成。样品在0、24、48、72、96和120小时测定。选择40 mg/L Cu²⁺作为代表性浓度，因为该浓度不抑制生长但产生明显胁迫。
Fv/Fm、Y(II)、NPQ、rETRmax和α分别按公式（2.2–2.5）计算：
Fv/Fm = (Fm − Fo)/Fm （2.2）
rETRmax = PAR × (Fv/Fm) × 0.84 × 0.5 （2.3）
Y(II) = (Fm′ − F)/Fm′ （2.4）
NPQ = (Fm − Fm′)/Fm′ （2.5）
其中Fo为暗适应后PSII反应中心完全开放时的最低荧光；Fm为暗适应后饱和光脉冲下的最大荧光；Fm′为光化光照明下的光适应最大荧光；F为持续光化光下测得的稳态荧光。
RLCs通过将rETR-PAR数据拟合至指数函数获得：
P = Pm(1 − e^(−αEd/Pm)) （2.6）
其中P定义为特定辐照度（Ed，400–700 nm）下的rETR，参数Pm和α分别表征光合能力和效率。该方程参考Jassby和Platt（1976），基于无光抑制假设，结果为渐近最大rETR。
【数据】暗适应时间：15 min；光化光梯度：0–1208 µmol photons m⁻²s⁻¹（8个梯度）；测定时间点：0、24、48、72、96、120 h；代表性Cu²⁺浓度：40 mg/L
2.5 叶绿素a含量测定
暗适应15分钟后，使用Water-PAM测量最小荧光（F₀）。测试3个Cu²⁺浓度（0、40、80 ppm）以代表不同胁迫水平。培养物在0、24、48、72、96和120小时取样。F₀作为叶绿素a的非破坏性替代指标，因其与叶绿素a含量具有良好的正相关性。该方法无需牺牲培养物即可估算叶绿素a含量，减少了样品处理时间。仪器设置参照Zhao等（2025）标准化。
【数据】暗适应：15 min；Cu²⁺浓度：0、40、80 ppm；取样时间：0、24、48、72、96、120 h
2.6 生化参数测定
使用商业检测试剂盒测定超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性。培养物在24、72和120小时取样。选择这些时间点以显示各重金属浓度下的不同胁迫阶段。SOD活性采用氮蓝四唑（NBT）光还原法测定。POD活性采用比色愈创木酚法测定。加入检测试剂后，分别读取550 nm和420 nm处的吸光度值，按制造商说明书操作计算SOD和POD酶活性。
【数据】取样时间：24、72、120 h；SOD测定波长：550 nm（NBT光还原法）；POD测定波长：420 nm（愈创木酚法）
2.7 ROS氧化胁迫评估
测定丙二醛（MDA）以评估脂质过氧化程度。样品在24、72和120小时收集。MDA浓度采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定。TBA在酸性条件下与上清液反应，记录532 nm处吸光度。使用标准曲线和消光系数估算样品MDA含量。
【数据】取样时间：24、72、120 h；测定波长：532 nm（TBA法）
2.8 EC和TDS测定
使用Eutech PC2700（Thermo Fisher Scientific，美国）按照制造商说明书测定电导率（EC）和总溶解固体（TDS）。样品在24、72和120小时收集。每次测定取20 mL培养物置于Pyrex烧杯中混匀，用探头读取数值。TDS由仪器使用默认转换系数自动计算。所有分析在25 ± 1°C下进行。
【数据】样品量：20 mL；测定时间：24、72、120 h；温度：25 ± 1°C
2.9 铜残留水平测定
使用ICP-OES（Optima7000 DV）测定铜浓度，仪器设置如下：RF功率1400 W，雾化器气体流量0.7 L/min，辅助气体流量0.5 L/min，等离子体气体流量12 L/min，进样速度1.0 mL/min。铜去除率（R，%）按公式（2.7）计算：
R(%) = (C₀ − Cₜ)/C₀ × 100 （2.7）
其中C₀和Cₜ分别代表初始铜浓度和给定时间（t）的残留铜浓度。样品稀释10倍后进行分析。
【数据】RF功率：1400 W；雾化器气体流量：0.7 L/min；辅助气体流量：0.5 L/min；等离子体气体流量：12 L/min；进样速度：1.0 mL/min；稀释倍数：10倍
2.10 ANN机器学习模型
铜去除预测采用三层ANN模型（图1），使用5个适用数据输入参数：Cu初始浓度、Fv/Fm、rETRmax、EC和接种率。为优化网络架构，通过系统试错法进行超参数调优，评估隐藏层3至15个神经元及多种激活函数，以确定测试均方误差（MSE）最低的配置。数据集随机划分为训练集（60%）、验证集（20%）和测试集（20%）。本研究使用Levenberg-Marquardt方法训练神经网络，以获得更好的稳定性和更快的计算速度。为防止过度训练和过拟合，集成了早停技术——当验证MSE停止下降并开始上升时自动终止训练过程。建模在MATLAB 2022b中完成。通过额外的诊断检查确保模型可靠性，包括残差直方图以评估误差对称性和系统偏差的缺失。
【数据】输入参数：Cu初始浓度、Fv/Fm、rETRmax、EC、接种率（共5个）；隐藏层神经元：3–15个（试错法优化）；数据划分：训练60%、验证20%、测试20%；算法：Levenberg-Marquardt；软件：MATLAB 2022b
研究结果
3.1 藻细胞生理指标
铜暴露对斜生栅藻生物量产生了明显的时间和剂量依赖性响应，微藻组与联合体组呈现不同模式，如图2所示。在最初的24–48小时，各处理间差异较小；此后，每个取样点均出现显著差异（p < 0.05）。微藻组中，生物量随Cu浓度升高逐渐下降，120小时时60–80 ppm处理抑制最强。相比之下，联合体组在整个过程中维持较高生物量：0–20 ppm处理在72–120小时持续上升并达到最高密度，40–60 ppm处理仅表现出相对于纯培养的部分抑制；80 ppm处理仍抑制生长，但抑制程度低于微藻组。
联合体组观察到的缓解效应与此前报道的藻–菌互作优势一致，如细菌胞外聚合物（EPS）和表面官能团与Cu²⁺络合或吸附、降低游离离子活性，从而缓冲毒性。此外，细菌伙伴提供CO₂、维生素和其他代谢物支持藻类恢复。联合体在40–60 ppm的“保护”效应和0–20 ppm的持续生长，与更广泛的证据一致，即微藻–细菌联合体相比纯微藻培养具有更强的重金属耐受性和修复性能。
【数据】Cu浓度：0–80 ppm；培养时间：120 h；取样时间点：24–48 h差异小，之后各点p < 0.05；联合体组0–20 ppm持续上升至72–120 h
3.2 铜胁迫对光合参数的影响
如图3所示，40 ppm Cu暴露显著影响斜生栅藻的叶绿素荧光参数，微藻组与联合体组呈现不同响应。微藻组中，Fv/Fm（a）、Y(II)（b）、α（d）和rETRmax（e）随时间稳步下降，120小时达到最低值（p < 0.05）。同时，NPQ（c）显著升高，表明铜胁迫下非光化学淬灭增强。联合体组的Fv/Fm、Y(II)、α和rETRmax下降更为缓慢，且在所有时间点的数值均持续高于微藻组（p < 0.05）。同样，NPQ随时间升高，但升幅小于纯培养，表明联合体组在铜胁迫下维持了更好的光合效率和更低的能量耗散。
结果表明，铜胁迫严重破坏微藻组的光合性能，表现为Fv/Fm、Y(II)、α和rETRmax降低，NPQ升高。这一模式反映了PSII反应中心受损、能量耗散增强以及光化学活性整体受抑。类似铜诱导的Fv/Fm和Y(II)下降在绿色微藻中已被广泛报道，归因于氧化胁迫和类囊体膜损伤。联合体组相对稳定的参数凸显了细菌伙伴的保护作用——细菌EPS和表面官能团可吸附和螯合Cu²⁺，降低游离离子活性，减轻对PSII的直接损伤。
【数据】Cu浓度：40 ppm；测定时间：0、24、48、72、96、120 h；微藻组各参数120 h达最低（p < 0.05）；联合体组各时间点均高于微藻组（p < 0.05）
3.3 铜处理对叶绿素a含量的影响
铜暴露下斜生栅藻叶绿素a水平显著下降，微藻组与联合体组差异明显，如图4所示。起始时（0 h），各处理叶绿素a水平相当。随着暴露时间延长，两组叶绿素a含量均显著降低，尤其在80 ppm Cu处理下（p < 0.05）。微藻组中，叶绿素a从24小时起急剧下降，在40和80 ppm处理下于120小时达到最低水平。相比之下，联合体组在相同铜浓度下叶绿素a含量保持恒定或高于微藻组。即使在120小时，联合体组在40和80 ppm处理下的叶绿素a含量仍显著高于微藻组（p < 0.05）。
结果表明，铜胁迫强烈抑制斜生栅藻的叶绿素a合成，反映光合机构受损和色素积累受抑。已有研究报道，过量铜通过失活原叶绿素酸酯还原酶等酶类干扰叶绿素生物合成，同时通过氧化胁迫加速叶绿素降解。微藻组更严重的下降与早期研究一致，即纯培养因缺乏缓冲机制而对重金属胁迫尤为敏感。相比之下，联合体组相对较高的叶绿素a含量表明，细菌伙伴通过EPS结合和固定Cu²⁺并提供促生长代谢物来减轻铜毒性，从而维持色素完整性。
【数据】Cu浓度：0、40、80 ppm；测定时间：0、24、48、72、96、120 h；80 ppm处理显著降低（p < 0.05）；120 h时联合体组在40和80 ppm下显著高于微藻组（p < 0.05）
3.4 SOD和POD活性对铜的响应
铜暴露显著影响斜生栅藻的SOD和POD活性，微藻组与联合体组响应不同，如图5所示。微藻组中，0和20 ppm处理下SOD活性随时间略有上升，而40、60和80 ppm处理下呈明显下降趋势。80 ppm处理下，酶活性从24小时的75 U/mg蛋白降至120小时的约21 U/mg蛋白。极端铜胁迫下SOD活性的降低表明，作为主要抗氧化防御的酶系统无法充分缓解氧化胁迫。POD保持相对稳定，提示当SOD活性受抑时POD在过氧化氢清除中发挥补偿功能。
联合体组中，SOD活性呈现相同总体模式但下降幅度减小：60和80 ppm处理下，120小时SOD仍分别维持在23和31 U/mg蛋白，明显高于微藻组。POD活性也升高，在80 ppm铜胁迫下保持在接近22 U/mg蛋白的水平。联合体组通过缓和SOD在高铜下的下降并提高POD活性，增强了抗氧化稳定性。
这种缓冲作用与此前报道一致，即过量铜在绿色微藻中先刺激后抑制初级抗氧化防御。观察到的POD活性稳定支持了过氧化物酶在SOD失效时提供持续保护的观点。铜暴露下SOD和POD的早期刺激反映了抗氧化防御系统的诱导以清除ROS。然而，微藻组后续酶活性下降表明，长期铜胁迫压倒了酶促防御，导致对氧化损伤的保护不足。绿色微藻中抗氧化酶对铜的双相响应已有报道——初始激活后因过量ROS和蛋白质氧化导致酶失活。相比之下，联合体组SOD和POD活性的持续高水平表明，细菌伙伴通过EPS螯合Cu²⁺以及分泌调节氧化还原稳态的代谢物来帮助减轻氧化胁迫。
【数据】Cu浓度：0、20、40、60、80 ppm；取样时间：24、72、120 h；微藻组80 ppm下SOD：75→21 U/mg蛋白（24→120 h）；联合体组60/80 ppm下SOD：23/31 U/mg蛋白（120 h）；联合体组80 ppm下POD：~22 U/mg蛋白
3.5 EC和TDS的时间变化
【数据】原文未详述
3.6 铜去除效率
【数据】20 ppm：微藻组83.4%，联合体组85.2%；80 ppm：微藻组69.0%，联合体组75.4%
3.7 ANN模型性能
【数据】整体R² = 0.9744；预测误差：±3%以内
讨论与解读
铜胁迫对斜生栅藻产生显著的负面效应，但与枯草芽孢杆菌共培养可缓解这些影响。微藻组在80 ppm Cu下生物量和叶绿素a含量急剧下降，而联合体组生物量维持在接近纯培养两倍的水平。40 ppm Cu处理120小时后，联合体组光合效率（Fv/Fm）保持在0.4以上，而微藻组低于0.2。抗氧化防御方面，联合体组MDA积累限制在8 nmol mg⁻¹蛋白，而微藻组超过10 nmol mg⁻¹。铜去除率在20 ppm时微藻组和联合体组分别为83.4%和85.2%，80 ppm时分别降至69.0%和75.4%。ANN建模进一步验证了系统性能，整体R² = 0.9744，预测误差一般在±3%以内。这些结果表明，微藻–细菌系统在抵抗铜毒性、提高去除效率方面具有双重优势，且可通过可靠的预测模型进行性能评估。
编译者解读：本研究将传统的微藻重金属修复实验与机器学习预测相结合，是合成生物学领域"实验+建模"双轮驱动的典型案例。其方法学亮点在于将生理生化参数（Fv/Fm、rETRmax、EC等）作为ANN输入特征，使预测模型直接建立在生物学响应机制之上，而非纯黑箱拟合。联合体在80 ppm高铜下的性能优势（75.4% vs 69.0%）提示细菌伙伴的EPS螯合与代谢支持是增强耐受的关键。局限在于ANN模型的训练数据来自单一藻–菌组合，跨菌株、跨污染场景的泛化能力仍待验证。未来若能将分子层面的铜转运与螯合基因表达纳入模型输入，预测精度和机制可解释性将进一步提升。
参考来源
Zhao, D. (2026). Copper stress responses in Scenedesmus obliquus–Bacillus subtilis Consortia: Machine Learning-Based prediction of copper removal. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134681
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134681