来源：Enhancing ethanol production through light-induced discovery and multi-gene engineering of hyper-biofilm Saccharomyces cerevisiae（Renewable Energy）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
生物膜形成能显著增强酿酒酵母的乙醇生产效率，但蓝光调控生物膜的机制长期不明。本研究揭示蓝光通过钙信号通路（CSP）和cAMP-PKA信号通路抑制生物膜形成，并据此对关键基因（TPK1/2、PDE2、CRZ1）进行多基因工程改造，构建出超强生物膜菌株2Δ- + p(T-C)。该菌株在连续发酵第五批时将发酵周期从12.0小时缩短至1.5小时，乙醇产量峰值达24.8 g/L，生产率为16.5 g/L/h，为工业乙醇生产提供了环境调控与遗传工程协同的新范式。
研究背景
生物乙醇主要由酿酒酵母生产，在推动可持续交通方面发挥关键作用。酿酒酵母的生物膜形成通过增强胁迫抗性和代谢效率来提升生物乙醇产量。这些包裹在自分泌细胞外基质中的结构化微生物群落，支撑着更稳健高效的发酵过程。然而，工业酿酒酵母菌株中调控生物膜形成的分子机制仍不清晰，限制了生物膜增强型生产菌株的理性设计。此前的遗传改造策略多靶向单基因或单条通路，无法应对胁迫信号与生物膜生理涉及的调控网络复杂性。光作为一种多功能环境信号，能够调控微生物系统中的多种生物学过程。在酿酒酵母中，蓝光因其与真菌天然光受体的兼容性及诱导强转录响应的能力，已成为光遗传学调控的首选波长。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本研究使用酿酒酵母菌株1308（以下简称1308）作为培养菌株（表S1），在酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖培养基（YPD）琼脂平板上培养（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂）。发酵培养基成分为葡萄糖（55 g/L）、蛋白胨（4 g/L）、(NH4)2SO4（4 g/L）、酵母提取物（3 g/L）、KH2PO4（3 g/L）、MgSO4（0.5 g/L）、ZnSO4·7H2O（0.05 g/L）和FeSO4·7H2O（0.05 g/L）。菌株1308是一株具有高乙醇生产能力的二倍体酿酒酵母菌株，广泛用于工业生物乙醇发酵。突变株在补充有G418硫酸盐（终浓度500 μg/mL）的YPD平板上筛选。
【数据】菌株：1308；培养基：YPD（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂）；发酵培养基：葡萄糖55 g/L、蛋白胨4 g/L、(NH4)2SO4 4 g/L、酵母提取物3 g/L、KH2PO4 3 g/L、MgSO4 0.5 g/L、ZnSO4·7H2O 0.05 g/L、FeSO4·7H2O 0.05 g/L；G418浓度：500 μg/mL
2.2 突变株与回补菌株的构建
为构建酿酒酵母突变株，使用CRISPR/Cas9技术删除相应基因。使用山梨醇法制备酿酒酵母感受态细胞，通过电穿孔法（1.5 kV、25 mF、200 Ω脉冲控制器控制）转化修饰质粒和线性修复DNA。MID1、CNA1、CNB1、CRZ1、CYR1、TPK1、TPK2、TPK3和PDE2基因使用特异性引物从酿酒酵母基因组中扩增、纯化，并使用ClonExpress一步克隆试剂盒（Vazyme Biotech，南京，中国）插入pYX212质粒。使用G418硫酸盐筛选携带上述基因的敲除突变株，PCR引物列于表S2。
【数据】电转化参数：1.5 kV、25 mF、200 Ω；克隆试剂盒：ClonExpress One-Step Cloning Kit；筛选标记：G418硫酸盐
2.3 结晶紫染色实验
结晶紫染色测定基于Yang等人所述方法并稍作修改。酵母菌株在YPD培养基中于30°C过夜培养，收集、洗涤，并在新鲜YPD中重悬至OD600为1.0。取200 μL细胞悬液转移至96孔微量滴定板中，于30°C静置培养36小时以形成生物膜。培养后，用PBS洗涤每孔两次去除浮游细胞，贴壁生物膜用1%结晶紫染色15分钟。随后用水洗涤孔以去除多余染料并风干。结合的结晶紫用200 μL 33%乙酸溶解，使用酶标仪测定570 nm处吸光度。每个条件使用三个生物学重复。吸光度值归一化至初始OD600以校正细胞密度差异。仅含PBS的孔作为阴性对照以校正背景和非特异性染色。此外，由于结晶紫与细胞核中的DNA结合，细胞核呈现深紫色，便于区分内部细胞结构。
【数据】培养温度：30°C；培养时间：36h；结晶紫浓度：1%；染色时间：15min；乙酸浓度：33%；乙酸体积：200 μL；检测波长：570nm；生物学重复：3次
2.4 细胞黏附实验
将制备的种子培养液稀释至均匀的细胞浓度。用无菌镊子将圆形盖玻片放入6孔板中，每孔加入3 mL发酵液。编号后，每孔加入300 μL稀释的种子培养液至相应培养基中。平板在30°C、黑暗条件下以1,300 lx蓝光强度照射培养36小时。轻轻摇动平板，使圆形盖玻片上的游离细胞悬浮到培养基中。用移液器移除培养基，加入3 mL PBS缓冲液。缓慢摇动平板以洗脱圆形盖玻片上的游离细胞，随后加入500 μL预冷固定液（−20°C）。细胞在黑暗中固定20分钟。用移液器移除固定液后，加入3 mL PBS缓冲液彻底清洗残余固定液，然后进行显微镜观察。
【数据】蓝光强度：1,300 lx；培养温度：30°C；培养时间：36h；固定液体积：500 μL；固定温度：−20°C；固定时间：20min
2.5 cDNA文库构建与定量逆转录聚合酶链反应分析
使用HiScript II Q RT SuperMix（+gDNA Wiper，Vazyme，南京，中国）构建用于qRT-PCR的cDNA文库。引物使用美国国家生物技术信息中心GenBank数据库中的序列作为参考进行设计。用于分析的基因和引物列于表S3。定量实时PCR使用StepOnePlus实时PCR系统（Applied Biosystems）和2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，中国）进行。反应和计算按照制造商说明进行，每个样品进行三次技术重复，并设置无cDNA的阴性对照。差异基因表达显著性评估标准为错误发现率阈值≤0.001且绝对Log2比值≥1。
【数据】qRT-PCR系统：StepOnePlus Real-Time PCR System；试剂：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix；技术重复：3次；FDR阈值：≤0.001；|Log2 ratio|≥1
2.6 塑料表面生物膜形成能力
酿酒酵母菌株在YPD培养基中培养12小时，收集细胞并用PBS洗涤。取20 μL OD600=1的培养液转移至含180 μL发酵培养基的96孔板中。平板在30°C下分别培养36、60和84小时，然后用PBS和1%结晶紫洗涤游离发酵细胞。用蒸馏水洗涤去除多余染料。加入200 μL冰醋酸，在室温下以150 rpm振荡30分钟。使用酶标仪（SpectraMax® iD5；Molecular Devices；美国）测定570 nm处吸光度。
【数据】预培养时间：12h；接种体积：20μL（OD600=1）；培养基体积：180μL；培养温度：30°C；培养时间：36、60、84h；结晶紫浓度：1%；冰醋酸体积：200μL；振荡条件：150rpm、30min、室温；检测波长：570nm
2.7 标准平板冲洗实验
每个菌株在YPD平板上（30°C）培养3天。观察所有菌株在该环境中的生长情况。然后用流水冲洗每个平板直至无菌落残留，记录冲洗前后平板上菌株的状态。所有平板冲洗实验均进行三次重复以确保可重复性，并在冲洗前后拍照以定性评估生物膜保留能力。
【数据】培养温度：30°C；培养时间：3天；重复次数：3次
2.8 生长能力分析
菌株培养至细胞密度达到1，稀释至均匀细胞密度，然后用无菌水进行三次10倍梯度稀释。将各稀释液（2 μL）滴于YPD平板上，于30°C培养15小时并记录情况。同时，当细胞密度达到1时，取10 μL酿酒酵母液体接种于5 mL液体培养基中，于200 rpm、30°C培养15小时，测定600 nm处吸光度。
【数据】梯度稀释：10倍×3次；点样量：2μL；培养温度：30°C；培养时间：15h；摇瓶转速：200rpm；接种量：10μL/5mL；检测波长：600nm
2.9 扫描电子显微镜分析
菌株的生物膜细胞在固定化发酵12小时后收集。棉纤维用PBS缓冲液洗涤两次，并在−80°C下保存24小时。生物膜细胞使用FreeZone 4.5 L冷冻干燥系统（Labconco，堪萨斯城，密苏里州，美国）干燥，并喷金处理。使用SEM（SEM 4800，日立，日本）获取图像。
【数据】固定化发酵时间：12h；PBS洗涤：2次；冷冻温度：−80°C；冷冻时间：24h；SEM型号：SEM 4800（Hitachi）
2.10 流式细胞术
使用无菌枪头挑取pFA6a-BIFC-CRZ1-TPK1单菌落，于30°C、250 rpm传代培养12小时。培养液用无菌水稀释至均匀细胞浓度。在6孔板中加入4 mL发酵液和300 μL稀释培养液，于30°C在黑暗和蓝光（1,300 lx）条件下培养36小时。使用流式细胞仪在498 nm处分析蛋白质相互作用程度。为分析BiFC荧光，使用前向和侧向散射对细胞群进行设门以排除碎片和聚集体。BiFC阳性细胞的荧光阈值以缺乏BiFC构建体的野生型细胞作为阴性对照确定。每个样品至少收集10,000个事件，计算BiFC阳性细胞百分比。使用CytExpert软件生成直方图叠加和荧光强度分布，以评估不同光照条件下的群体异质性。所有样品均进行三次重复测量。
【数据】培养温度：30°C；转速：250rpm；培养时间：12h；蓝光强度：1,300 lx；培养时间：36h；检测波长：498nm；事件数：≥10,000；重复次数：3次
2.11 胞外多糖荧光染色
首先，酵母菌株用YPD中重悬的细胞（OD600为1）过夜培养。
【数据】OD600：1；培养方式：过夜
研究结果
3.1 蓝光信号介导酿酒酵母生物膜形成
近年来，光对微生物生理和行为的影响引起了广泛关注。研究已证明光可通过多种信号通路调控不同物种的生理特性，尤其在黑曲霉和大肠杆菌等微生物的生物膜形成过程中发挥关键作用。基于先前在大肠杆菌中使用500、900和1,300 lx蓝光强度的研究，我们将这一实验设计扩展到单细胞真菌酿酒酵母，以探索蓝光对其生物膜形成的潜在抑制作用。通过结晶紫染色法定量评估生物膜形成，发现在测试的最高蓝光强度（1,300 lx）下，酿酒酵母的生物膜形成显著降低了32.09%（图1A）。
此外，琼脂侵袭实验结果表明，在蓝光照射（1,300 lx）下，与黑暗条件相比，酿酒酵母的侵袭性显著降低（图1B）。这些发现表明蓝光在抑制酿酒酵母生物膜形成中发挥重要作用，与其他微生物的研究结果一致，凸显了光信号在微生物生物膜形成过程中的普遍作用。
为排除生物膜减少是由于细胞活力下降或生长受损的可能性，我们进一步进行了生长能力测定。在静态和振荡条件下的平板生长实验中，酿酒酵母在暴露于1,300 lx蓝光强度时保持正常生长能力，摇瓶培养的生长曲线未观察到显著差异（图1C）。这表明蓝光并未抑制细胞生长，而是直接干扰了与生物膜形成相关的分子过程。
为进一步阐明蓝光对生物膜形成机制的影响，我们使用扫描电子显微镜和光学显微镜观察了酿酒酵母细胞黏附能力的变化。显微图像显示，蓝光照射下黏附于棉纤维的细胞数量显著减少（图1D）。此外，在圆形载玻片上进行的黏附实验表明，酿酒酵母在黑暗条件下形成紧密聚集体，而蓝光暴露的细胞表现出明显的分散（图1E）。用异硫氰酸荧光素标记的刀豆蛋白A（FITC-ConA）对胞外多糖进行染色进一步证实蓝光抑制了酿酒酵母的胞外多糖产生。与黑暗中的细胞相比，蓝光照射下胞外多糖的荧光信号显著减弱（图1F和G）。这些胞外多糖是酿酒酵母生物膜形成和稳定性的关键组分，蓝光对其的抑制表明胞外多糖的减少可能是生物膜形成减少的原因。
最后，为验证我们的发现，qRT-PCR结果显示蓝光显著下调了多个与生物膜形成相关基因的表达水平。酿酒酵母的生物膜形成主要受细胞表面黏附能力和细胞外基质构建的调控。我们的研究发现FLO基因家族（FLO1、FLO5、FLO10、FLO11）与黏附素的合成密切相关，而葡聚糖生物合成基因（FKS1、FKS2、FKS3）和海藻糖生物合成基因（TPS1、TPS2、TPS3）是ECM的重要组分。在蓝光下，这些基因的表达显著下调（图1H）。这一结果表明蓝光通过在转录水平上抑制与黏附和ECM组装相关的基因表达，从而抑制酿酒酵母生物膜的发育。
【数据】蓝光强度：1,300 lx；生物膜减少幅度：32.09%；下调基因：FLO1、FLO5、FLO10、FLO11、FKS1、FKS2、FKS3、TPS1、TPS2、TPS3
3.2 CSP和PKA信号通路对蓝光照射的响应与机制
蓝光已被广泛认为是一种能够调节多种生物学和物理化学过程的调控信号。已有研究报道蓝光信号可影响CSP和PKA通路。为研究蓝光对酿酒酵母生物膜形成的抑制作用是否通过这些通路介导，我们对关键调控基因进行了qRT-PCR分析。这些基因的选择基于先前研究证明它们在钙信号传导（CSP通路）和营养感知/糖酵解调控（PKA通路）中的核心作用，与酵母的胁迫响应和生物膜发育密切相关。如图2A所示，蓝光显著抑制了CSP通路基因（MID1、CNA1、CNB1、CRZ1）和PKA通路基因（CYR1、PDE2、BCY1、TPK1、TPK2、TPK3）的表达。
此外，如图1H所示，PKA通路下游效应因子FLO11和受CSP通路调控的FKS2的表达在蓝光下也显著降低。这些结果表明蓝光通过同时影响CSP和PKA信号通路来抑制生物膜形成。
由于已有报道指出在胁迫条件下，PKA通路通过其催化亚基Tpk1p磷酸化Crz1p来负调控CSP通路，我们设计了BiFC实验以验证这一调控机制是否参与蓝光介导的酿酒酵母生物膜抑制。在来自CSP和PKA通路的四对相互作用蛋白（Cmd1p+Cnb1p、Cna1p+Crz1p、Cyr1p+Cpa2p和Ras2p+Cyr1p）中，所有蛋白对在蓝光下均表现出降低的荧光强度（图S1）。然而，菌株1308-pFA6a-BIFC-CRZ1-TPK1在蓝光下表现出显著更高的荧光，表明Tpk1p与Crz1p在此条件下的相互作用增强（图2B和C）。
为定量分析Tpk1p与Crz1p之间的相互作用，我们使用流式细胞术评估了菌株1308-pFA6a-BIFC-CRZ1-TPK1在蓝光和黑暗条件下的荧光强度。由于蓝光抑制这两个基因的表达，我们还使用qRT-PCR分析了它们在蓝光下的表达水平（图2D）。第一个荧光峰代表菌株的自发荧光（低于5,000荧光单位），第二个峰代表超过阈值荧光的所有细胞。在蓝光下，Tpk1p-Crz1p复合物的荧光峰移至显著更高的荧光单位，尽管蓝光下TPK1和CRZ1的表达下调了20%。此外，蓝光下形成成熟复合物的细胞比例更高，表明与黑暗条件相比，相互作用强度增加了20.2%（图2E）。这进一步证明蓝光下Tpk1p与Crz1p之间的相互作用增强，导致PKA通路对CSP通路的负反馈调控加强，从而进一步抑制CSP通路下游基因的表达。
【数据】蓝光下TPK1和CRZ1表达下调：20%；相互作用强度增加：20.2%；荧光阈值：5,000单位
3.3 CSP和PKA通路基因修饰对酿酒酵母生物膜形成的影响
为更好地理解PKA和CSP通路中关键基因在酿酒酵母生物膜形成中的作用，我们构建了以下突变菌株：基因敲除菌株（ΔMID1、ΔCNA1、ΔCNB1、ΔCRZ1、ΔCYR1、ΔTPK1、ΔTPK2、ΔPDE2）和过表达菌株（+pMID1、+pCNA1、+pCNB1、+pCRZ1、+pCYR1、+pTPK1、+pTPK2、+pTPK3、+pPDE2）。为排除生长差异作为影响生物膜形成的因素，我们设计了平板生长实验。如图3A所示，突变菌株的生长与1308相似，表明遗传修饰未显著影响生长。
【数据】构建菌株：8个敲除株+9个过表达株；生长表型：与1308相似
3.4 关键基因整合菌株对生物膜形成的影响
（基于原文结果部分继续翻译——该部分原文未在节选范围内完整呈现，以下基于现有信息忠实翻译可获取内容）
【数据】原文未详述
3.5 固定化连续发酵系统的构建
【数据】原文未详述
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究系统阐明了蓝光信号调控酿酒酵母生物膜形成的分子机制。蓝光通过抑制FLO基因家族降低细胞黏附能力，并通过下调胞外多糖合成相关基因减少ECM构建，最终抑制生物膜形成。CSP和PKA信号通路被鉴定为这一过程的核心调控节点——蓝光同时抑制两条通路的基因表达，且PKA通路的Tpk1p与CSP通路的Crz1p之间的相互作用在蓝光下增强20.2%，形成更强的负反馈调控。基于这些机制认识，通过过表达CRZ1和TPK2、敲除PDE2等多基因工程策略构建的超强生物膜菌株2Δ- + p(T-C)显著提升了发酵性能——第五批发酵时周期从12.0小时缩短至1.5小时，乙醇产量峰值达24.8 g/L，生产率16.5 g/L/h。该研究展示了环境信号调控与多基因工程协同优化工业酵母菌株的潜力。
编译者解读
本文的价值在于将光遗传学的环境信号感知与多基因组合工程策略有机结合，突破了以往单基因改造的局限。蓝光作为非侵入性调控手段，可在发酵过程中按需施加或解除，为工业化操作提供了灵活的时间窗口。多基因协同改造（同时调控PKA和CSP两条通路）体现了合成生物学"系统级设计"的思路——单一基因改造往往受限于通路冗余，而双通路协同干预可产生叠加效应。值得注意的是，2Δ- + p(T-C)菌株在第五批才达到最优性能，暗示生物膜成熟需要时间积累，这为工业放大中的批次策略设计提供了参考。后续研究若能进一步解析蓝光调控的全局转录网络并优化光强-时间耦合方案，有望实现更精准的"光控发酵"工艺。
参考来源
Sun W. Enhancing ethanol production through light-induced discovery and multi-gene engineering of hyper-biofilm Saccharomyces cerevisiae. Renewable Energy, 2026. DOI: 10.1016/j.renene.2025.124129
DOI: 10.1016/j.renene.2025.124129