来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
**导语**
咖啡因作为全球消费最广泛的天然生物碱之一，其工业合成主要依赖化学合成或植物提取工艺。伴随合成生物学的发展，微生物细胞工厂为天然产物的绿色合成开辟了新途径，但咖啡因复杂的多步甲基化修饰及其对宿主细胞的潜在毒性，始终制约着相关生物制造效率。近期，Ditzel 等人在《Synthetic Biology》期刊发表研究成果，首次利用无细胞蛋白质合成平台，在体外重建了完整的咖啡因生物合成途径，绕过细胞生长与毒性的瓶颈，实现了咖啡因的快速、灵活生物制造，为该类植物天然产物的合成生物学研究提供了全新范式。
**研究背景**
咖啡因（1,3,7-三甲基黄嘌呤）的生物合成途径在咖啡、茶、可可等植物中已得到充分解析。其核心过程始于黄嘌呤核苷，经过三步连续的氮位甲基化反应：7-甲基黄嘌呤、3,7-二甲基黄嘌呤（可可碱），最终生成1,3,7-三甲基黄嘌呤。这些反应由 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）依赖的 N-甲基转移酶催化，主要包括 7-甲基转移酶、3-甲基转移酶和 1-甲基转移酶。尽管该途径包含的酶元件已较为清晰，但在微生物底盘细胞中重建咖啡因合成途径却面临多重挑战。首先，咖啡因及其合成中间体对多种微生物具有明显的生长抑制作用，导致细胞活力下降、产物积累受限。其次，甲基转移酶在异源宿主中常因溶解性差、翻译后修饰缺失或辅因子 SAM 供给不足而活性低下。此外，活细胞内的代谢网络调控复杂，碳流与甲基供体再生之间的平衡难以精准控制。
无细胞蛋白质合成（cell-free protein synthesis, CFPS）系统在近年迅速崛起，它通过裂解细胞制备含有转录和翻译机器的粗提物，在外源添加底物、能量和辅因子的条件下，直接在试管中驱动目标蛋白的表达与代谢途径的运行。CFPS 平台解除了细胞生存的束缚，可自由调配反应组分，为有毒中间体或终产物的合成提供了理想环境。本研究正是基于此思路，尝试将咖啡因生物合成途径的全部甲基转移酶在无细胞体系中实现“即用即表达”，并在线催化底物转化，以突破现有细胞工厂的局限。
**研究方法**
研究团队以大肠杆菌 BL21(DE3) 为底盘制备无细胞裂解物，构建了一套高效表达与外源途径级联反应的集成平台。具体技术路线如下：
首先，选择咖啡因合成途径中的核心酶元件。研究人员从咖啡植物（*Coffea arabica*）转录组数据中筛选并密码子优化合成了三种 N-甲基转移酶基因：CaXMT（7-甲基黄嘌呤合酶）、CaMXMT（3-甲基黄嘌呤合酶）和 CaDXMT（1-甲基黄嘌呤合酶），同时引入了一种 SAM 合成酶（MetK）以强化甲基供体的原位再生能力。所有基因均构建在 T7 启动子控制下的质粒载体中，便于在 CFPS 体系中协同表达。
无细胞反应的构建采用标准流程：收集对数期大肠杆菌，经冷缓冲液洗涤、超声破碎、离心澄清后获取 S12 提取物。反应体系包含提取物、氨基酸混合物、能量再生系统（磷酸烯醇式丙酮酸/丙酮酸激酶）、NTPs、T7 RNA 聚合酶以及编码途径酶的质粒模板。在此基础上，优化了镁离子、钾离子浓度及质粒配比，以协调多酶的表达化学计量。
为实时驱动咖啡因合成，反应分为两个阶段：第一阶段为“表达期”，在 30°C 下进行 2–4 小时，使途径酶充分翻译并折叠；第二阶段启动“催化期”，向反应体系中加入底物黄嘌呤和额外补充的 SAM，继续孵育并定时取样。产物的定性与定量采用高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS），以标准品建立标准曲线，精确监测黄嘌呤、7-甲基黄嘌呤、可可碱和咖啡因的浓度变化。
为验证途径效率，设计了阶梯式模块化实验：（1）单酶表达验证各甲基转移酶活性；（2）双酶组合合成可可碱；（3）全部三种甲基转移酶与 SAM 合成酶共表达，实现从黄嘌呤到咖啡因的全合成。同时，设置无质粒、无底物等阴性对照，并比较了不同表达时间、底物浓度和 SAM 前体添加对产量的影响。
**研究结果**
研究成功在无细胞体系中实现了咖啡因的多酶级联合成。在单步反应中，纯化的无细胞表达体系表现出明显的甲基转移酶活性：当仅表达 CaXMT 时，底物黄嘌呤在 2 小时内大量转化为 7-甲基黄嘌呤，转化率超过 80%，并伴随微量的非特异性产物生成，显示出该酶的较高区域选择性。双酶系统（CaXMT + CaMXMT）以黄嘌呤为起点，在反应 6 小时后可检测到可可碱的明显累积，同时中间体 7-甲基黄嘌呤先升高后降低，呈典型的级联代谢特征。
全途径重建后，当三种甲基转移酶与 SAM 合成酶共表达，并在催化阶段以 1 mM 黄嘌呤为底物、补充 2 mM SAM 前体（甲硫氨酸与 ATP）时，咖啡因的滴度随时间稳步上升。反应 12 小时后，咖啡因终浓度达到约 65 mg/L，这是目前无细胞系统中报道的咖啡因最高产量之一。HPLC-MS 图谱清晰显示，反应体系中咖啡因的保留时间及质荷比与标准品完全一致，确证了结构正确性。
进一步分析揭示，SAM 的原位再生对整体效率至关重要。当不额外表达 MetK 而只依赖外源 SAM 时，咖啡因产量骤降约 70%，说明甲基供体的及时补充是多步甲基化反应的限速步骤。研究还发现，三种甲基转移酶的相对表达量需精细调控：过量的 CaDXMT（1-甲基转移酶）反而引起中间体可可碱的过早消耗，导致流向咖啡因的碳流量下降。通过调整质粒的质量比（CaXMT:CaMXMT:CaDXMT:MetK = 2:2:1:3），获得了最佳产量。
值得注意的是，无细胞系统的开放性还使得反应过程的实时监测与动态干预成为可能。实验表明，在催化期分次补充 SAM 前体和底物，可将咖啡因终产量再提升约 25%，体现出超越活细胞体系的灵活调控能力。此外，该平台展现出的通用性被初步验证：将途径中的甲基转移酶替换为来自茶树的同源酶，同样检测到咖啡因的生成，表明无细胞平台可快速筛选不同物种来源的酶变体，加速途径优化。
**讨论与展望**
该研究首次展示了无细胞蛋白质合成平台在复杂植物天然产物合成中的潜力，特别是对于咖啡因这类对细胞有毒性的代谢产物，CFPS 平台有效规避了细胞活力与产物毒性之间的矛盾。通过体外精确控制酶量、底物浓度和辅因子供应，实现了从廉价前体黄嘌呤到高附加值咖啡因的多步酶催化转化，产量达到可观水平。
然而，将该技术推向工业化仍面临若干关键瓶颈。当前 65 mg/L 的咖啡因滴度仍远低于传统植物提取或化学合成水平，主要限制在于 CFPS 反应规模放大的成本与效率。无细胞体系中的酶活半衰期较短，数小时后催化速率明显衰退，如何通过酶的定向进化提升热稳定性与催化寿命，将是后续优化的重点。此外，SAM 辅因子的高昂价格与再生效率不足，需要开发更经济的甲基供体循环系统，例如采用多酶耦联将甲硫氨酸再生与 ATP 再生进一步整合。
本研究的思路可拓展到其他嘌呤生物碱（如可可碱、茶碱）或结构类似物的合成，甚至通过引入非天然甲基供体，创造出具有新功能属性的甲基化衍生物。在基础研究层面，该无细胞平台为解析植物甲基转移酶的底物谱与选择性机制提供了快速表征工具，结合高通量筛选，可指导酶工程改造。总体而言，这项工作将无细胞合成生物学与天然产物生物制造相融合，为未来植物源活性物质的按需、分布式生产奠定了重要基础。
**参考来源**
Ditzel A, Zhao F, Gao X, Phillips G. Utilizing a cell-free protein synthesis platform for the biosynthesis of a natural product, caffeine. *Synthetic Biology*, 2023, ysad017. DOI: 10.1093/synbio/ysad017
DOI: 10.1093/synbio/ysad017