来源：Developing a novel heme biosensor to produce high-active hemoproteins in Pichia pastoris through comparative transcriptomics（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
血红素是真核生物中至关重要的辅因子，但过量血红素对细胞具有毒性。本研究在高效供血红素的毕赤酵母P1H9底盘菌株中，首次报道了真核生物中用于动态通路调控的血红素响应生物传感器。研究者通过比较转录组学挖掘内源血红素响应启动子，结合CRISPR/dCas9技术和N-degron降解标签，设计并优化了能够精细调控血红素生物合成的传感器系统，显著提高了猪肌红蛋白和大豆血红蛋白的产量与生物活性。
研究背景
肌红蛋白（Mb）和血红蛋白（Hb）是应用广泛的血红素蛋白，涉及食品加工、人工金属酶和血液替代品等领域。猪肌红蛋白（P-Mb）源于猪心脏和骨骼肌组织，负责肉类的红色和金属风味；大豆血红蛋白（S-Hb）由毕赤酵母合成，已被美国FDA批准作为人造肉生产中的色素添加剂（GRN No. 737）。此外，肌红蛋白常被改造为人工金属酶用于功能化反应、生物降解和染料脱色等。
目前提高血红素蛋白产量的主要策略是增强酵母中血红素的胞内生物合成。然而，过量合成的血红素带来的细胞毒性和代谢负担常被忽视。例如，利用基因组规模建模在酿酒酵母中合成的53.70 mg/L血红素明显超过合成100 mg/L S-Hb理论上所需的4.62 mg/L。本课题组前期研究发现，毕赤酵母中合成的2.93 mg/L血红素在血红素蛋白合成过程中也轻微抑制了细胞生长（约10%）。因此，设计血红素响应调控系统以精细调节血红素生物合成与珠蛋白表达之间的平衡，实现血红素蛋白的可持续生产，具有重要的研究价值。迄今为止，在真核生物中尚未见血红素响应生物传感器的报道。
研究方法
2.1 化学试剂
常规PCR反应使用2 × TransStart® FastPfu Fly PCR SuperMix（TransGen Biotech，北京，中国）。使用GeneJET基因组DNA纯化试剂盒（Thermo Scientific，上海，中国）从毕赤酵母、酿酒酵母和大肠杆菌中提取基因组DNA。质粒提取和DNA凝胶纯化分别使用SanPrep柱式质粒小提试剂盒（Sangon Biotech，上海，中国）和GeneJET凝胶回收与DNA清洁微量试剂盒（Thermo Scientific）。除特别说明外，所有其他化学品均购自Sangon Biotech。
【数据】PCR试剂：2 × TransStart® FastPfu Fly PCR SuperMix；DNA提取试剂盒：GeneJET Genomic DNA Purification Kit；质粒提取试剂盒：SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit；凝胶回收试剂盒：GeneJET Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit；化学品来源：Sangon Biotech
2.2 质粒与菌株构建
本研究所用质粒、基因和启动子详见表S1。基因敲入/敲除盒、sgRNA和引物分别列于表S2、S3和S4。异源基因和血红素响应启动子的序列见支持信息中的Notes。本研究所用菌株见表S5。详细构建过程参见补充方法。
【数据】质粒/基因/启动子：见表S1；敲入/敲除盒/sgRNA/引物：见表S2-S4；菌株：见表S5；构建细节：见补充方法
2.3 培养基
低盐Luria-Bertani培养基（10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，5 g/L NaCl，pH 7.0）用于大肠杆菌培养。YPD培养基（20 g/L胰蛋白胨，10 g/L酵母提取物，2%（w/v）葡萄糖）用于毕赤酵母培养。BMMY培养基（20 g/L胰蛋白胨，10 g/L酵母提取物，13.4 g/L YNB，1%（v/v）甲醇，4 × 10⁻⁵%（w/v）生物素，100 mM磷酸钾缓冲液，pH 6.0）用于血红素蛋白表达。
【数据】大肠杆菌培养基：低盐LB（10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，5 g/L NaCl，pH 7.0）；毕赤酵母培养基：YPD（20 g/L胰蛋白胨，10 g/L酵母提取物，2%葡萄糖）；血红素蛋白表达培养基：BMMY（13.4 g/L YNB，1%甲醇，4 × 10⁻⁵%生物素，100 mM磷酸钾缓冲液，pH 6.0）
2.4 比较转录组学分析
挑取毕赤酵母X33菌株单菌落至含50 mL YPD培养基的250 mL摇瓶中，分别加入终浓度为20 mg/L和0 mg/L的血红素。培养物在30°C、220 rpm条件下培养至对数生长期（OD600 = 2–6）。取等量培养物（约1 mL）在4°C、12,000 rpm条件下离心5 min，所得细胞沉淀用PBS缓冲液（pH 7.4）重悬，重复离心-重悬过程两次。最后将两份细胞沉淀送至华大基因（深圳，中国）进行比较转录组学分析，实验设三次重复。
【数据】菌株：P. pastoris X33；血红素浓度：20 mg/L和0 mg/L；温度：30°C；转速：220 rpm；OD600：2–6；离心：4°C，12,000 rpm，5 min；洗涤：PBS pH 7.4，重复2次；重复数：3次
2.5 β-半乳糖苷酶活性测定
挑取表达lacZ基因的重组毕赤酵母菌株单菌落至含2 mL YPD培养基的15 mL培养管中，30°C、220 rpm过夜培养。随后测定过夜培养物的OD600，将等量接种量转移至含2 mL YPD培养基的24深孔板中，分别加入终浓度为20 mg/L和0 mg/L的血红素，30°C、220 rpm培养至OD600 = 1。接下来，取10⁶至10⁷ cells/mL的培养物在12,000 rpm离心5 min，细胞沉淀用pH 7.4的PBS缓冲液洗涤两次以去除残留血红素。最后，按照先前描述的方法（Zhang et al., 1998; Hon et al., 1999）测定细胞沉淀中的β-半乳糖苷酶活性。相对酶活 = [含20 mg/L血红素的酶活]/[未添加血红素的酶活] × 100%。实验独立进行三次。
【数据】菌株：重组毕赤酵母（表达lacZ）；血红素浓度：20 mg/L和0 mg/L；温度：30°C；转速：220 rpm；OD600：1.0；细胞浓度：10⁶–10⁷ cells/mL；离心：12,000 rpm，5 min；洗涤：PBS pH 7.4，2次；计算公式：相对酶活 = 含20 mg/L血红素酶活/无血红素酶活 × 100%；重复数：3次
2.6 mScarlet荧光强度测定
挑取表达mScarlet基因的重组毕赤酵母菌株单菌落，接种至含50 mL YPD培养基的250 mL摇瓶中，加入终浓度为200 mg/L的ALA，然后在30°C、220 rpm条件下培养48 h。收集不同发酵时期的培养物（10⁶–10⁷ cells/mL），使用微板阅读器（BioTek Synergy H1，Winooski，美国）测定mScarlet表达的荧光强度（激发波长570 nm；发射波长605 nm）。mScarlet/OD表示单位OD600下的mScarlet荧光强度。
【数据】菌株：重组毕赤酵母（表达mScarlet）；ALA浓度：200 mg/L；温度：30°C；转速：220 rpm；时间：48 h；细胞浓度：10⁶–10⁷ cells/mL；荧光检测：激发570 nm/发射605 nm；仪器：BioTek Synergy H1
2.7 mScarlet和HEM2转录水平的qRT-PCR分析
对血红素响应生物传感器调控mScarlet或HEM2转录的重组毕赤酵母菌株进行定量实时PCR（qRT-PCR）分析。在发酵时间16、18、20、22、24、28、32、36、40、44和48 h收集酵母细胞。随后按照前期研究（Yu et al., 2023）描述的方法进行RT-PCR实验。表S4中的RT-PCR引物使用Beacon Designer 7.9软件设计。以ARG4作为参考基因（Abad et al., 2010），使用2^−ΔΔCt方法（Livak and Schmittgen, 2001）计算相对转录水平。mScarlet和HEM2的转录水平标准化至16 h的转录水平。
【数据】时间点：16、18、20、22、24、28、32、36、40、44、48 h；参考基因：ARG4；计算方法：2^−ΔΔCt；标准化：以16 h转录水平为基准；引物设计软件：Beacon Designer 7.9
2.8 胞内血红素滴度检测
为测定不同发酵时间点（16、18、20、22、24、28、32、36、40、44和48 h）培养物中的胞内血红素水平，通过离心（12,000 rpm，5 min）收集细胞沉淀，并使用草酸提取法（Ishchuk et al., 2022; Michener et al., 2012）进行分析。
【数据】时间点：16、18、20、22、24、28、32、36、40、44、48 h；离心：12,000 rpm，5 min；检测方法：草酸提取法
2.9 P-Mb和S-Hb滴度测定
含分泌型P-Mb和S-Hb的发酵上清液使用10%（w/v）SDS-PAGE进行鉴定。使用QuantityOne（Bio-Rad，加利福尼亚，美国）分析SDS-PAGE中目标蛋白的比例，使用Bradford法（Beyotime Biotech，上海，中国）测定发酵上清液中的总蛋白含量，以计算P-Mb和S-Hb的滴度。
【数据】检测方法：10% SDS-PAGE；蛋白比例分析：QuantityOne（Bio-Rad）；总蛋白测定：Bradford法（Beyotime Biotech）
2.10 血红素结合率和特异性过氧化物酶活性测定
分泌型血红素蛋白使用BeaverBeads™ His标签蛋白纯化试剂盒（Beaver Biomedical Engineering，苏州，中国）进行纯化，然后使用Amicon Ultra 3K（Millipore，达姆施塔特，德国）脱盐。纯化样品的血红素结合率和特异性过氧化物酶活性分别使用吡啶血色原测定法（Yu et al., 2023; Barr and Guo, 2015）和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺显色液试剂盒（Shao et al., 2022; Yu et al., 2023）测定。血红素结合率按公式（每摩尔珠蛋白结合的血红素摩尔数）× 100%计算。
【数据】纯化试剂盒：BeaverBeads™ His-tag Protein Purification kit；脱盐：Amicon Ultra 3K；血红素结合率测定：吡啶血色原法；过氧化物酶活性测定：TMB显色液试剂盒；计算公式：血红素结合率 = （mol血红素/mol珠蛋白）× 100%
研究结果
3.1 毕赤酵母中文献报道的血红素响应启动子的鉴定
在酵母中，血红素响应生物传感器的开发需要两个关键元件：i）能够响应血红素的敏感启动子；ii）成熟的真核CRISPRi技术。关于第一个元件，据报道转录调控因子Hap1p能响应血红素，通过结合其启动子激活呼吸作用所需基因和氧化损伤控制基因的转录（Zhang and Hach, 1999; Hon et al., 2005）（图2a）。这些基因包括YHB1（编码黄素血红蛋白）、CYC1（编码异-1-细胞色素c）和CYT1（编码细胞色素c₁）（Zhang and Hach, 1999; Guarente and Mason, 1983; Bao et al., 2008）。此外，在氧气充足的情况下，Hap1p通过激活编码有氧阻遏物的ROX1基因表达，参与HEM13基因（编码粪卟啉原-III氧化酶）的转录抑制（Keng, 1992）。此外，ALA合酶（由HEM1基因编码）受血红素反馈抑制，血红素加氧酶（由HMX1基因编码）能感知胞内过量血红素并导致其降解（Lathrop and Timko, 1993; He et al., 2022; Kikuchi et al., 2005）。因此，这些启动子（P_HAP1、P_HEM1、P_HEM13、P_HMX1、P_YHB1、P_CYC1和P_CYT1）可用于设计血红素响应生物传感器。
首先，需要验证候选启动子在毕赤酵母中对血红素的实际响应性。这些启动子分别用于在X33-Δku70菌株中表达lacZ报告基因。添加或不添加血红素（20和0 mg/L）时β-半乳糖苷酶的相对酶活表明，这些文献报道的启动子对血红素的响应性不够敏感。只有P_HMX1对血红素的正向响应性超过40%（图2b）。
【数据】候选启动子：P_HAP1、P_HEM1、P_HEM13、P_HMX1、P_YHB1、P_CYC1、P_CYT1；菌株：X33-Δku70；血红素浓度：20 mg/L和0 mg/L；P_HMX1正向响应性：>40%
3.2 毕赤酵母内源血红素响应启动子的挖掘
考虑到文献报道的启动子在毕赤酵母中对血红素的低响应性，有必要鉴定转录水平存在显著差异的内源基因，以进一步挖掘敏感的血红素响应启动子。对添加血红素（20 mg/L）或不添加血红素（0 mg/L）培养的毕赤酵母X33菌株进行比较转录组学分析。如图2c所示，以Log2（倍数变化）±0.5为基线，鉴定出14个转录水平存在显著差异的内源基因。这些基因包括11个上调基因（PAS_chr2-1_0235、PAS_chr2-2_0009、PAS_chr3_0251、PAS_chr3_0516、PAS_chr3_0923、PAS_chr3_0924、PAS_chr4_0008、PAS_chr4_0077、PAS_chr4_0181、PAS_chr4_0363和PAS_chr4_0821）和3个下调基因（PAS_chr3_0095、PAS_chr4_0080和PAS_chr4_0832）。基于基因本体论功能注释（图2d）和美国国家生物技术信息中心（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的信息，14个差异表达基因中的大多数（包括PAS_chr2-1_0235、PAS_chr2-2_0009、PAS_chr3_0251、PAS_chr3_0516、PAS_chr4_0008、PAS_chr4_0181和PAS_chr4_0832）与金属离子（Fe²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺和Na⁺/Pi）转运相关。研究发现这些金属离子的转运与血红素密切相关（Smith et al., 2009; Vanacore et al., 2019; Si et al., 2017; Guo et al., 2016; Pallone, 2007）。因此，这些差异表达基因的启动子可能响应胞内血红素。
为验证这一假设，将这些差异表达基因的启动子分别用于在X33-Δku70菌株中驱动lacZ基因表达。根据添加或不添加血红素时β-半乳糖苷酶的相对酶活，两个启动子（P_2-1_0235和P_3_0516）对血红素表现出最高的正向响应性，分别为121.30%和106.36%（图2e）。随后，考察了筛选所得启动子对血红素的剂量响应。随着血红素添加量增加（0–20 mg/L），P_2-1_0235和P_3_0516的正向响应性逐渐提高，但超过20 mg/L后响应基本保持稳定（图S1）。结果表明，筛选所得启动子在一定血红素浓度范围内具有剂量依赖性响应。因此，选择这两个血红素响应启动子用于后续血红素生物传感器的设计。
【数据】菌株：P. pastoris X33；血红素浓度：20 mg/L和0 mg/L；差异表达基因数：14个（11个上调，3个下调）；Log2（FC）阈值：±0.5；P_2-1_0235正向响应性：121.30%；P_3_0516正向响应性：106.36%；剂量响应范围：0–20 mg/L
3.3 血红素响应生物传感器动态调控mScarlet表达
基于已鉴定的内源血红素响应启动子，需要选择第二个基因抑制元件（CRISPRi）以进一步开发酵母中的血红素生物传感器。蔡孟浩课题组开发了名为SynPic-X的可编程高表达酵母平台，通过结合CRISPR/dCas9和CRISPR/dCpf1系统响应多种定义信号，已有效用于α-淀粉酶的生产（Liu et al., 2022b）。因此，本研究采用CRISPR/dCas9技术设计血红素响应生物传感器。
首先，将血红素响应启动子与CRISPR/dCas9技术结合，设计用于动态调控mScarlet表达的血红素响应生物传感器。使用CHOPCHOP网站（http://chopchop.cbu.uib.no/）选择两个靶向mScarlet基因的向导RNA（gRNA1_mScarlet和gRNA2_mScarlet）。以X33-Δku70菌株为基础，构建了5个重组毕赤酵母菌株，包括HEME-R1（P_2-1_0235-dCas9-P_HTX1-gRNA1_mScarlet-P_GAP-mScarlet）、HEME-R2（P_3_0516-dCas9-P_HTX1-gRNA1_mScarlet-P_GAP-mScarlet）、HEME-R3（P_2-1_0235-dCas9-P_HTX1-gRNA2_mScarlet-P_GAP-mScarlet）、HEME-R4（P_3_0516-dCas9-P_HTX1-gRNA2_mScarlet-P_GAP-mScarlet）和对照菌株（P_GAP-mScarlet）。
向培养基中添加终浓度为200 mg/L的ALA以模拟血红素稳态，监测这些工程菌株48 h内单位OD600的mScarlet表达强度（mScarlet/OD600）。结果显示，携带血红素生物传感器的重组菌株与对照菌株相比，mScarlet表达的时间进程相似（图3）。此外，16 h后HEME-R1和HEME-R3菌株中mScarlet的表达水平低于HEME-R2和HEME-R4菌株，表明P_2-1_0235启动子对血红素的响应比P_3_0516启动子更敏感。同样，比较HEME-R1与HEME-R3或HEME-R2与HEME-R4发现，gRNA2_mScarlet靶向mScarlet基因的效率高于gRNA1_mScarlet。当血红素响应启动子和gRNA正常发挥作用时，携带血红素生物传感器的工程菌株并未表现出对mScarlet表达的动态调控。这一现象可能是由dCas9对mScarlet转录的持续抑制所致（Zhang et al., 2020）。因此，有必要设计dCas9的去稳定化以实现基因转录的瞬时抑制。
接下来，引入N-degrons对dCas9蛋白进行去稳定化工程设计，以验证假设并改进血红素生物传感器。根据先前的N-degron模型，将泛素分子（Ubi4N76，Ubi4蛋白N端前76个氨基酸残基）、一个N端规则残基和一个含有赖氨酸或天冬酰胺的14间隔序列（degron）依次融合到蛋白质的N端（Peng et al., 2018; Varshavsky, 2019; Suzuki and Varshavsky, 1999）。融合蛋白经泛素C端水解酶水解后，暴露N端规则残基，导致赖氨酸/天冬酰胺间隔序列泛素化，随后被蛋白酶识别并降解（Peng et al., 2018; Varshavsky, 2019; Suzuki and Varshavsky, 1999）。本研究使用了三种具有不同泛素化水平的N-degrons（K3K15、KN119和KN113）。
【数据】菌株数量：5个重组毕赤酵母菌株（HEME-R1至HEME-R4及对照）；ALA浓度：200 mg/L；监测时间：48 h；gRNA设计工具：CHOPCHOP网站；P_2-1_0235 vs P_3_0516敏感性：P_2-1_0235更敏感；gRNA2_mScarlet效率：高于gRNA1_mScarlet；N-degrons：K3K15、KN119、KN113
3.4 P1H9菌株中HEM2转录和血红素生物合成的动态调控
在P1H9菌株中，对HEM2转录和血红素生物合成进行动态调控。P1H9-R1、P1H9-R2和P1H9（或P1H9-R3、P1H9-R4和P1H9）菌株之间的HEM2转录和血红素生物合成比较如图5a–d所示。
【数据】菌株：P1H9-R1、P1H9-R2、P1H9-R3、P1H9-R4及P1H9对照；比较指标：HEM2转录水平和血红素生物合成
3.5 P1H9和P1H9-R3菌株中P-Mb和S-Hb的合成
在P1H9和P1H9-R3菌株中合成了P-Mb和S-Hb。SDS-PAGE分析了P1H9和P1H9-R3菌株中P-Mb和S-Hb的表达水平。泳道1–2：P1H9-（P-Mb）菌株在48 h时的发酵上清液和纯化样品。泳道3–4：P1H9-（S-Hb）菌株在48 h时的发酵上清液和纯化样品。
【数据】菌株：P1H9和P1H9-R3；分析时间：48 h；检测方法：SDS-PAGE；样品类型：发酵上清液和纯化样品
讨论与解读
目前提高血红素蛋白产量的主要策略是增强酵母中血红素的胞内生物合成。然而，过量合成的血红素带来的细胞毒性和代谢负担常被忽视。例如，53.70 mg/L的血红素在酿酒酵母中合成明显超过合成100 mg/L S-Hb所需的4.62 mg/L理论值。本课题组前期研究发现，毕赤酵母中2.93 mg/L的血红素在血红素蛋白合成过程中也轻微抑制了细胞生长（约10%）。因此，设计血红素响应调控系统以精细调节血红素生物合成与珠蛋白表达之间的平衡至关重要。
由于酵母中从未报道过血红素响应调控系统，本研究首先使用比较转录组学鉴定内源血红素响应启动子，随后将鉴定的启动子与N-degrons和CRISPR/dCas9技术结合，设计血红素响应调控系统。在精细调控血红素生物合成的工程P1H9菌株（P1H9-R3菌株）中，P-Mb和S-Hb的滴度和生物活性显著提高，有利于人造肉和人工金属酶的发展。
编译者解读
该研究巧妙地利用比较转录组学挖掘内源血红素响应启动子，避免了外源启动子在异源宿主中响应性差的问题，这是方法学上的亮点。将N-degron介导的蛋白质去稳定化与CRISPR/dCas9结合，实现了对基因转录的瞬时而非持续抑制，解决了静态抑制无法动态调控的痛点。这种"感知-响应-调控"闭环设计思路在合成生物学中具有普适性，可推广至其他毒性代谢产物的动态调控。然而，该传感器对血红素的响应范围仍局限于特定浓度区间，且启动子的动态范围是否足以应对更复杂的工业生产条件，原文未详述，有待进一步优化。从应用角度而言，该方法为人工肉和人工金属酶的高效生产提供了可行路径，也为其他血红素蛋白的合成提供了通用策略。
参考来源
Fei Yu. Developing a novel heme biosensor to produce high-active hemoproteins in Pichia pastoris through comparative transcriptomics. Metabolic Engineering, 2024.
DOI: 10.1016/j.ymben.2024.06.002
DOI: 10.1016/j.ymben.2024.06.002