来源：High-level secretory production of leghemoglobin in Pichia pastoris through enhanced globin expression and heme biosynthesis（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
植物基肉类替代品的关键挑战在于模拟真肉的风味与色泽，含血红素蛋白是解决这一问题的核心食品添加剂。本研究以食品级安全菌株毕赤酵母为底盘，通过基因剂量优化与血红素合成途径整合，将大豆 leghemoglobin（LegH）的分泌产量提升超过83倍，最终在10-L生物反应器中实现3.5 g/L的分泌滴度与93%的血红素结合率，创下含血红素蛋白在GRAS微生物细胞工厂中分泌生产的最高纪录。
研究背景
随着肉类产品需求持续增长，资源密集型的工厂化养殖所造成的环境污染已成为严峻问题。肉类替代品进入日常饮食是不可逆转的趋势。肉类替代品可分为细胞基与植物基两大类——细胞基产品因缺乏经济可行性仍处于实验室阶段，而豆腐等传统植物基产品已在素食者中流行数千年。当前食品制造商面临的最大挑战之一，是如何让植物基肉类替代品获得素食者与非素食者都能接受的风味和质地。
含血红素蛋白被视为动物源肉类的关键风味催化剂和着色剂，在肉类替代品中添加血红素蛋白可大幅提升其风味特征与食用感受与真肉的相似度。除广泛食用的动物肌红蛋白和血红蛋白外，大豆 leghemoglobin 已获美国食品药品监督管理局（FDA）授权作为着色添加剂。LegH 是在豆科植物根瘤中发现的单体小分子血红素蛋白，其结构与肌红蛋白相似。
研究方法
2.1 培养基与生长条件
毕赤酵母菌株在 YPD 培养基（1% 酵母提取物、2% 蛋白胨、2% 葡萄糖）中培养以维持和增殖。摇瓶异源表达 LegH 时，重组毕赤酵母菌株接种于 50 mL BMGY 培养基（1% 甘油、1% 酵母提取物、2% 蛋白胨、1.34% YNB、4 × 10⁻⁵% 生物素、100 mM 磷酸钾，pH 6.0），于 30 ℃、250 rpm 条件下培养，每 24 h 补加 1%（v/v）甲醇。向 BMGY 中添加终浓度 0.1 mM 的 FeSO₄ 和柠檬酸以防止铁缺乏和沉淀。96 h 后测定细胞生长、LegH 浓度和 LegH 活性。补料分批生物反应器表达时，毕赤酵母菌株在 WZI 培养基（4.25 mL/L 85% H₃PO₄、5 g/L (NH₄)₂SO₄、0.93 g/L CaSO₄、18.2 g/L K₂SO₄、14.9 g/L MgSO₄·7H₂O、4.13 g/L KOH、40.0 g/L 甘油）中培养，补加 1 mM FeSO₄ 和 21.75 mL PTM1 微量元素溶液（S33234，源叶生物科技有限公司，上海，中国）。
【数据】YPD培养基：1%酵母提取物/2%蛋白胨/2%葡萄糖；BMGY培养基：1%甘油/1%酵母提取物/2%蛋白胨/1.34%YNB/4×10⁻⁵%生物素/100mM磷酸钾/pH 6.0；温度：30℃；转速：250rpm；甲醇补加：1%(v/v)/24h；FeSO₄和柠檬酸：0.1mM；培养时间：96h；WZI培养基：4.25mL/L 85%H₃PO₄/5g/L(NH₄)₂SO₄/0.93g/L CaSO₄/18.2g/L K₂SO₄/14.9g/L MgSO₄·7H₂O/4.13g/L KOH/40.0g/L甘油；补加：1mM FeSO₄、21.75mL PTM1
2.2 质粒构建
质粒 pPICZα 和 pAO815 购自 Invitrogen（上海，中国）。大豆（Glycine max）leghemoglobin C2（LegH，GenBank 登录号：NM_001248319.3）经密码子优化后由 Tsingke（杭州，中国）合成以利于在毕赤酵母中表达。LegH 编码序列插入 pPICZαA 的 EcoRI–SalI 位点，构建质粒 pPICZ-AOX1p-LegH。所有 HEM 途径基因均从 GS115 染色体 DNA 扩增并克隆至 pAO815（见补充材料）。首先，将相应基因 HEM1、HEM2、HEM3、HEM4、HEM12、HEM13、HEM14 和 HEM15 插入 pAO815，构建 pHEM1、pHEM2、pHEM3、pHEM4、pHEM12、pHEM13、pHEM14 和 pHEM15。质粒 pH3H1 和 pH3H2 分别通过将 AOX1p-HEM1 和 AOX1p-HEM2 插入 pHEM3 构建；质粒 pH1H2 通过将 AOX1p-HEM2 插入 pHEM1 构建。随后将 AOX1p-HEM2 插入 pH3H1 构建质粒 pH3H1H2。最后，将 AOX1p-HEM12 克隆至 pH3H1H2 构建质粒 pH3H1H2H12。质粒 pAO815-G418 通过将 HIS4 替换为 G418 构建，随后依次插入 AOX1p-HEM15、AOX1p-HEM4、AOX1p-HEM13 和 AOX1p-HEM14，构建 pGH15H4H13H14。
【数据】限制性酶切位点：EcoRI–SalI；基因来源：GS115染色体DNA；质粒骨架：pPICZαA、pAO815；构建质粒：pPICZ-AOX1p-LegH、pHEM1-15、pH3H1、pH3H2、pH1H2、pH3H1H2、pH3H1H2H12、pAO815-G418、pGH15H4H13H14
2.3 菌株构建
毕赤酵母 GS115 购自 Invitrogen（上海，中国）。珠蛋白过表达菌株基于毕赤酵母 GS115-Δku70 构建（该菌株由华东理工大学蔡孟浩教授惠赠）（表1）。质粒 pPICZ-AOX1p-LegH 经 SacI 酶切后电转化至 GS115-Δku70。PTVA 通过将单菌落划线于含逐渐升高 zeocin 浓度（100、500、1000 和 1500 μg/mL）的平板进行。第一轮 PTVA 后，选取 13 个生长较好且产量较高的菌落进行第二轮 PTVA，zeocin 浓度进一步提高（2000 和 2500 μg/mL）。仅获得 7 个耐受 2500 μg/mL zeocin 的菌落，其中 LegH 产量最高的菌株命名为 L9A。值得注意的是，含 zeocin 的培养基 pH 需调至 7.5。
为进一步增加 LegH 基因剂量，基于 L9A 进行 CRISPR/Cas9 介导的基因组整合。将受不同启动子（包括 AOX1p、TEF1p、GAPp 和 GCW14p）控制的一个额外 LegH 表达盒整合至 PAS_chr3_1029 上游区域（GCGGCAGTAATTGATATCGT），分别获得菌株 L10A、L9A1T、L9A1G 和 L9A1W。随后将 AOX1p-LegH 和 TEF1p-LegH 整合至菌株 L9A1T 的 PAS_chr2-1_0437 上游区域（TTTTAAGATTTCAATCTTGA），分别获得 L10A1T 和 L9A2T。
构建血红素途径过表达菌株时，将 pAO815、pHEM1、pHEM2、pHEM3、pHEM4、pHEM12、pHEM13、pHEM14、pHEM15、pH3H1、pH3H1H2 和 pH3H1H2H12 经 StuI 酶切后整合至菌株 L10A1T 的 HIS4 位点，分别构建 L10A1T-HIS4、H1、H2、H3、H4、H12、H13、H14、H15、H3H1、H3H1H2 和 H3H1H2H12。pGH15H4H13H14 经 PstI 酶切后整合至菌株 H3H1H2H12 的 Amp 位点，构建菌株 HA。通过 CRISPR/Cas9 在菌株 HA 中实现 ku70 的互补（CACGGTACCATCGATGAGCT），构建 HA-KU70 用于高密度发酵。
【数据】PTVA zeocin浓度梯度：100/500/1000/1500μg/mL（第一轮），2000/2500μg/mL（第二轮）；zeocin培养基pH：7.5；整合位点：PAS_chr3_1029上游（GCGGCAGTAATTGATATCGT）、PAS_chr2-1_0437上游（TTTTAAGATTTCAATCTTGA）；限制酶：SacI、StuI、PstI；ku70互补序列：CACGGTACCATCGATGAGCT
2.4 LegH 拷贝数测定
使用 Rapid Yeast Genomic DNA Isolation Kit（B518227，生工生物，上海，中国）提取毕赤酵母基因组，并用分光光度计（K5600，KAIAO，北京，中国）定量。分析 LegH 拷贝数时，使用 ABI StepOne Plus 仪器（Applied Biosystems，上海，中国）和 Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix（11200ES03，翌圣，上海，中国）进行 qPCR。LegH 拷贝数以 ARG4 为参考基因，采用 2⁻ΔΔCt 方法测定。
【数据】qPCR仪器：ABI StepOne Plus；qPCR试剂：Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix；参考基因：ARG4；计算方法：2⁻ΔΔCt
2.5 LegH 定量与纯化
上清液中的 LegH 通过 15%（w/v）SDS-PAGE 检测。LegH 浓度采用 Bradford 法结合 Quantity-One（BIO-RAD，加利福尼亚，美国）定量分析。检测 LegH 胞内表达时，取 1 mL 样品的细胞沉淀破碎，相应上清液用于 SDS-PAGE 分析。LegH 发酵上清液经离心收集，使用 Ni–NTA 琼脂糖柱纯化。纯化的 LegH 用 Amicon Ultra 3K（Millipore，达姆施塔特，德国）脱盐。
【数据】SDS-PAGE浓度：15%(w/v)；样品量：1mL；纯化方法：Ni–NTA琼脂糖柱；脱盐：Amicon Ultra 3K
2.6 LegH 过氧化物酶活性测定
LegH 催化氧化反应中，2.5 µL 培养上清液与 100 µL 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）辣根过氧化物酶显色液（P0209，碧云天，上海，中国）混合。37 °C 避光孵育 5 min 后，加入 100 µL 2 M H₂SO₄ 终止反应。使用多功能酶标仪（Varioskan Flash，Thermo Scientific，上海，中国）在 450 nm 处检测吸光值，通过 Beer-Lambert 定律（消光系数 59000 M⁻¹cm⁻¹）换算为 TMB 氧化产物浓度。一个 LegH 活性单位定义为每分钟催化形成 1 µmol TMB 氧化产物所需的酶量。LegH 比活性通过纯化蛋白样品的 LegH 活性与 LegH 浓度的比值确定。
【数据】上清液用量：2.5µL；TMB显色液：100µL；孵育温度：37℃；孵育时间：5min（避光）；终止液：100µL 2M H₂SO₄；检测波长：450nm；消光系数：59000 M⁻¹cm⁻¹；酶活单位定义：1µmol TMB氧化产物/min
2.7 血红素浓度与血红素结合率测定
纯化 LegH 中的血红素水平使用 QuantiChrom™ Heme Assay Kit（DIHM008，Hayward，美国）测定，该试剂盒将血红素转化为均匀的有色产物。样品中血红素含量与 400 nm 处测得的颜色强度成正比。血红素结合率通过纯化样品中血红素的摩尔浓度除以 LegH 的摩尔浓度计算。
【数据】检测波长：400nm；血红素结合率 = 血红素摩尔浓度 / LegH摩尔浓度
2.8 补料分批发酵
补料分批发酵在 10-L 生物反应器（BIOTECH-3000，BXBIO，上海，中国）中进行，遵循先前建立的方案。400 mL 种子培养液接种至含 5.0 L WZI 培养基的生物反应器中。整个过程中 pH 和温度分别维持在 6.5 和 30 °C。发酵过程主要分为四个阶段。甘油在甘油批次阶段结束时耗尽。甘油补料阶段通过泵入含 12 mL/L PTM1 的 63%（w/v）甘油溶液启动，持续至湿细胞重达到 200 g/L。在过渡阶段起始点，泵入 2 mL/L 甲醇，甘油补加速率在 3 h 内线性下降。随后将甲醇泵入生物反应器，其补加速率调节以维持 DO 在 10% 以上。发酵过程中取样测定湿细胞重（WCW，离心后细胞沉淀的重量）和 LegH 浓度。
【数据】生物反应器：10-L（BIOTECH-3000）；接种量：400mL种子/5.0L WZI培养基；pH：6.5；温度：30℃；甘油补料：63%(w/v)甘油+12mL/L PTM1；过渡阶段甲醇：2mL/L；甘油降速时间：3h；DO维持：>10%；WCW目标：200g/L
研究结果
3.1 多拷贝整合实现毕赤酵母中 LegH 的高效生产
除密码子优化和使用强 AOX1 启动子外，异源基因表达盒的拷贝数是实现高效表达的关键。Δku70 菌株具有增强的同源定向修复（HDR）效率，被选为亲本菌株通过 PTVA 生成多拷贝整合菌株。将 LegH 表达盒整合至染色体 AOX1 位点后，进行两轮 PTVA 以增加拷贝数和相应的 LegH 表达水平（图2a）。此外，本研究开发了一种基于 LegH 过氧化物酶样活性的高通量筛选方法，用于筛选 LegH 产量最高的菌株。每轮 PTVA 后拷贝数和过氧化物酶活性均有所增加。从两轮 PTVA 中筛选出的最佳菌株含有 9 个拷贝的 AOX1p-LegH，命名为 L9A。与含单拷贝 AOX1p-LegH 的初始菌株 L1A 相比，L9A 的 LegH 活性提高了 4.5 倍（图2b）。
为进一步提高 LegH 滴度，将受不同启动子（包括 AOX1p、TEF1p、GAPp 和 GCW14p）控制的一个额外 LegH 表达盒整合至 L9A，分别构建 L10A、L9A1T、L9A1G 和 L9A1W（图2a）。TEF1p、GAPp 和 GCW14p 是已广泛用于毕赤酵母重组蛋白表达的强组成型启动子。除 L9A1W 外，含额外拷贝的其他菌株均表现出更高的 LegH 产量。L9A1T 的 LegH 分泌产量最高，分别比 L9A、L10A 和 L9A1G 高 34%、12% 和 7%（图2c）。尽管 GCW14p 的转录活性强于 TEF1p 和 GAPp，但 L9A1W 中 LegH 的表达量最低，可能是由于代谢负担和细胞生长受损所致（图2c）。
为研究基因剂量对 LegH 生产的影响，将 AOX1p-LegH 和 TEF1p-LegH 整合至菌株 L9A1T，分别构建 L10A1T 和 L9A2T。如图2c所示，与 L9A1T 相比，L10A1T 和 L9A2T 在 BMGY 培养基中表现出相当的生长和 LegH 产量。为评估高密度发酵性能，通过转化线性化质粒 pAO815 互补 L10A1T 和 L9A2T 的组氨酸缺陷表型。有趣的是，L9A2T-HIS4 在 BMGY 培养基摇瓶发酵中表现良好，但在生物反应器中以 WZI 培养基培养时未能生长至高细胞密度。这些结果表明，适度的组成型表达与高诱导型表达相结合，可使工程菌株在细胞生长和异源基因表达方面达到最佳性能，从而获得最高的 LegH 产量。总体而言，L10A1T 中基因剂量效应已最大化，其 LegH 产量应受其他因素限制，如胞内血红素的可用性。
【数据】L9A拷贝数：9个AOX1p-LegH；L9A vs L1A活性提升：4.5倍；L9A1T vs L9A：+34%；L9A1T vs L10A：+12%；L9A1T vs L9A1G：+7%；启动子类型：AOX1p（诱导型）、TEF1p/GAPp/GCW14p（组成型）
3.2 解除毕赤酵母中 LegH 高水平分泌的瓶颈
对于多拷贝整合菌株，LegH 的分泌可能受辅因子（如血红素）缺乏和分泌机制饱和的限制。L10A1T-HIS4 细胞裂解液的 SDS-PAGE 分析未显示 LegH 的胞内积累，表明分泌机制是高效的，LegH 的分泌推测主要受血红素缺乏的限制（见补充材料）。为验证该假说，按先前报道以过量浓度 1 mM 和 10 μM 分别补加 ALA 和 hemin，评估其对 LegH 分泌的影响。由于血红素具有弱过氧化物酶活性，会干扰发酵液中 LegH 活性的测定，因此对 LegH 进行纯化以测定其比活性。
如图3所示，添加 10 μM hemin 使 LegH 比活性提升高达 12%，而珠蛋白浓度相当。换言之，发酵液中同时存在 apo-LegH 和 holo-LegH，apo-LegH 可被外源添加的 hemin 激活。令人惊讶的是，添加 1 mM ALA 不仅提高了 LegH 的比活性，还提高了发酵液中的 LegH 浓度。ALA 补加增加了胞内血红素的量，促进了 LegH 的正确折叠和分泌。分泌速率的提高可能反过来促进翻译速率，从而提升表达水平。值得注意的是，ALA 补加组的 LegH 比活性比 hemin 补加组高 42%，这可能是由于发酵液中的血红素穿过酵母细胞膜的效率较低（图3）。换言之，即使在发酵液中有过量 hemin 存在的情况下，也只有一小部分 apo-LegH 能被激活为 holo-LegH，这凸显了胞内血红素可用性对于血红素蛋白正确折叠和分泌生产的重要性。
【数据】hemin浓度：10μM；ALA浓度：1mM；hemin添加比活性提升：+12%；ALA vs hemin比活性：+42%；apo-LegH与holo-LegH共存于发酵液
3.3 血红素生物合成途径的组合优化增强功能性 LegH 的分泌
在确定限制 LegH 异源过表达的主要因素后，通过工程化血红素生物合成途径来增强胞内血红素可用性，而非添加昂贵的血红素前体 ALA。酿酒酵母中限速酶 Hem3p 的过表达已被描述为增加血红素蛋白产量的有效方法。因此，所有血红素生物合成途径基因（HEM1、HEM2、HEM3、HEM4、HEM12、HEM13、HEM14 和 HEM15）均在 AOX1p 控制下过表达。与 L10A1T-HIS4 相比，尽管细胞生长无明显差异，但血红素途径过表达菌株的分泌水平和 LegH 活性均不同程度提高。
在八个单独过表达血红素途径基因的菌株中，菌株 H1 的 LegH 珠蛋白表达量和过氧化物酶活性最高，分别达到 302 mg/L 和 212 U/mL（图4）。HEM1 过表达的效益与 ALA 添加相当。这一观察结果与先前研究不同——先前研究报道在毕赤酵母中单独过表达八个 HEM 基因和添加 ALA 并未提高活性异源血红素过氧化物酶的产量。这种差异可能归因于血红素过氧化物酶的基因剂量和表达水平有限。此外，在酿酒酵母中，Hem3p 被鉴定为主要限速酶，而 ALA 合成并非血红素生物合成途径的限速步骤。换言之，甲基营养型酵母毕赤酵母与模式酵母酿酒酵母之间的血红素代谢调控似乎存在差异。
由于血红素途径的所有八个基因对活性 LegH 的生产均有或多或少的正向影响，因此通过组合过表达这些基因进一步优化血红素生物合成。与菌株 H1 相比，菌株 H1H2 的过氧化物酶活性增加了 82%，但菌株 H3H1 未呈现此效果（图5b）。菌株 H3H1H2 的 LegH 活性仅略高于 H1H2。有趣的是，HEM2 和 HEM3 的共过表达导致 LegH 活性甚至低于 L10A1T。换言之，当血红素生物合成受 Hem1p 限制时，下游酶的过表达反而损害了 LegH 的生产，可能是由于代谢负担和 AOX1p 转录机制的重新分配。值得注意的是，尽管 H1H2 和 H3H1H2 表现出相当的 LegH 浓度和过氧化物酶活性，但 H3H1H2 的细胞沉淀显示出最高的密度……
【数据】H1菌株：302mg/L LegH、212U/mL过氧化物酶活性；H1H2 vs H1过氧化物酶活性：+82%；HEM2+HEM3共过表达：LegH活性低于L10A1T；八个HEM基因单独过表达均正向影响活性LegH生产
讨论与解读
本研究通过系统整合多拷贝基因整合、启动子组合优化和血红素生物合成途径工程，成功构建了能够高水平分泌 LegH 的毕赤酵母菌株。在补料分批发酵中，经 ku70 互补使菌株适应高密度发酵后，LegH 滴度达 3.5 g/L，血红素结合率达 93%，均为含血红素蛋白在 GRAS 微生物细胞工厂中报道的最高水平。值得注意的是，研究揭示了毕赤酵母与酿酒酵母在血红素代谢调控上的差异——在毕赤酵母中 Hem1p（ALA 合酶）是关键限速酶，而酿酒酵母中是 Hem3p。此外，适度组成型表达与高诱导型表达的组合策略为异源蛋白生产提供了新范式。
编译者解读：该研究的技术亮点在于将传统菌株工程手段（PTVA 基因剂量递增）与精准基因编辑（CRISPR/Cas9）有机结合，系统解决了血红素蛋白分泌生产中的"基因剂量-辅因子供给-分泌效率"三重瓶颈。从合成生物学应用角度看，该策略具有较高的可迁移性——"增强辅因子合成途径+优化蛋白折叠分泌"的组合逻辑可推广至其他含血红素蛋白（如细胞色素 P450、过氧化物酶）的微生物生产。其局限在于 WZI 培养基配方复杂且依赖甲醇诱导，工业化放大时需考虑甲醇的安全管控成本。此外，apo-LegH 与 holo-LegH 共存于发酵液的现象提示，产物质量控制（而非仅产量）可能是未来产业化需要关注的维度。
参考来源
Shao, Y. (2022). High-level secretory production of leghemoglobin in Pichia pastoris through enhanced globin expression and heme biosynthesis. Bioresource Technology, 2022. DOI: 10.1016/j.biortech.2022.127884
DOI: 10.1016/j.biortech.2022.127884