来源：Combinatorial optimization of CRISPR/Cas9 expression enables precision genome engineering in the methylotrophic yeast Pichia pastoris（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
巴斯德毕赤酵母是异源蛋白生产的常用宿主，但其同源重组效率远低于酿酒酵母，基因敲除与整合长期缺乏高效工具。本研究系统构建了95个CRISPR/Cas9表达质粒，逐一测试不同密码子优化的CAS9序列、gRNA表达策略及启动子组合，发现仅6个组合能实现高效编辑。通过核酶介导的gRNA加工与RNA聚合酶II启动子组合，靶向效率最高可达100%，并成功实现多基因同时敲除与供体DNA的精准整合。该工作为毕赤酵母的无标记基因组工程开辟了实用路径。
研究背景
毕赤酵母（Komagataella phaffii）据近期文献调查已成为最常用的真核表达宿主，甚至超过酿酒酵母。然而与模式酵母酿酒酵母相比，毕赤酵母天然菌株的同源重组（HR）机制效率低下：酿酒酵母约50 bp同源臂即可实现接近100%的靶向整合，而毕赤酵母即使添加数百bp甚至超过1 kbp的同源臂，靶向效率通常也只有0.1%至30%，具体取决于靶位点及供体片段的大小与设计。这使得毕赤酵母的靶向遗传改造极为困难，标记基因的循环利用（去除）又增加了额外工作量。例如在构建营养缺陷型菌株的努力中，460个测试转化子仅5个显示正确整合的表达 cassette。因此，开发高效、简便的靶向基因组修饰工具对毕赤酵母的菌株工程与代谢工程具有重要意义。
研究方法
2.1 化学试剂与材料
酶制剂购自Thermo Fisher Scientific（奥地利维也纳）。D(+)-生物素购自Sigma-Aldrich（奥地利维也纳）。Difco酵母氮碱基（不含氨基酸）、Bacto胰蛋白胨和Bacto酵母提取物购自Becton Dickinson（奥地利施韦夏特）。Zeocin™购自Life Technologies（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）及InvivoGen（法国）。其他化学品购自Carl Roth（德国卡尔斯鲁厄）。寡核苷酸由Integrated DNA Technologies（比利时鲁汶）合成，序列见补充表S1。
【数据】试剂来源：Thermo Fisher Scientific、Sigma-Aldrich、Becton Dickinson、Life Technologies、InvivoGen、Carl Roth、Integrated DNA Technologies；具体批号原文未详述
2.2 菌株与质粒构建
本研究中所有菌株均基于毕赤酵母野生型菌株CBS 7435（与NRRL Y-11430及ATCC 76273相同）。用于表达CRISPR/Cas9构建体的质粒基于大肠杆菌/毕赤酵母穿梭载体pPpT4_GAP（GenBank登录号：JQ519692）。自主复制序列（ARS）PARS1以引物AODTT-PARS1-fw-Gib和pUCORI-PARS1-rv-Gib从毕赤酵母CBS7435基因组DNA扩增获得。pPpT4_GAP质粒经PstI线性化后，通过Gibson组装将PARS1 PCR片段插入，得到质粒pPpT4_GAP-PARS1。所有质粒经Sanger测序验证（Microsynth，奥地利维也纳）。关键质粒图谱见补充文件S2。
【数据】菌株：P. pastoris CBS 7435（NRRL Y-11430，ATCC 76273）；载体：pPpT4_GAP（GenBank: JQ519692）；限制酶：PstI；组装方法：Gibson assembly；测序：Sanger
#### 2.2.1 携带RNA Pol III启动子的gRNA表达构建体
毕赤酵母密码子优化的CAS9序列以五个重叠合成双链DNA片段（gBlocks，Integrated DNA Technologies，Cas9-1至Cas9-5）订购，并通过重叠延伸PCR（OE-PCR）组合（Cas9-1fw/Cas9.5-rv）。人源密码子优化CAS9（HsCAS9）和化脓性链球菌CAS9（SpCAS9）分别以引物对spCas9_fw/spCas9-SV40_rv和hsCas9_fw/hsCas9-SV40_rv从模板载体p414-TEF1p-Cas9-CYC1t和pMJ806（均购自Addgene，美国马萨诸塞州剑桥）扩增。将pPpT4_GAP-PARS1经EcoRI和NotI双酶切后，通过Gibson组装将CAS9 PCR片段插入PGAP下游，得到pPpT4_GAP-PARS1-hsCas9、pPpT4_GAP-PARS1-spCas9和pPpT4_GAP-PARS1-ppCas9。RNA聚合酶III（RNA Pol III）启动子（序列见补充表3）PScSNR52、PScRPR1、PScSUP4、PPpLYS、PPpMET、PPpSER和PScSCR1分别从酿酒酵母ATCC 204508/S288c和毕赤酵母CBS 7435基因组DNA扩增（引物对：pucori-SNR52-fw-Gib/gRNA-SNR52-rv-Gib、pucori-RPR1-fw-Gib/gRNA-RPR1-rv-Gib、pucori-pLYS-fw-Gib/gRNA-pLYS-rv-Gib、pucori-pMET-fw-Gib/gRNA-pMET-rv-Gib、pucori-pSER-fw-Gib/gRNA-pSER-rv-Gib、pucori-SUP4-fw-Gib/gRNA-SUP4-rv-Gib、pucori-SCR1-fw-Gib/gRNA-SCR1-rv-Gib）。RNA Pol III启动子PSpRPR1、PPaASN和PKlSNR52以gBlocks形式订购（SNR52-K-lactis、RPR1-S-pombe、ASN-P-angusta）。含CAS9的载体pPpT4_GAP-PARS1-hsCas9、pPpT4_GAP-PARS1-spCas9和pPpT4_GAP-PARS1-ppCas9经PciI和SwaI酶切后，通过Gibson组装将RNA聚合酶III启动子及含gRNA和SUP4 RNA聚合酶III终止子序列的gBlock插入载体（最终图谱见S2）。
【数据】CAS9变体：PpCAS9（密码子优化）、HsCAS9（人源优化）、SpCAS9（链球菌）；gRNA表达：RNA Pol III启动子；限制酶：EcoRI、NotI、PciI、SwaI；组装：Gibson assembly、OE-PCR
#### 2.2.2 携带RNA Pol II启动子的gRNA表达构建体
含RNA聚合酶II（RNA Pol II）启动子用于表达gRNA的构建体基于上述pPpT4_GAP-PARS1载体。GAP启动子经SwaI/NotI双酶切去除。双向RNA Pol II启动子（PGAP/PTEF启动子融合体、PHTA1/PHTB1 = PHTX1、PDAS1/PDAS2）分别以引物对pTEF1-rv/pGAP-fw、DAS1TT-pHXT1-fw/AOXTT-HTX1-rv-Gibson、DAS1-2-fw/AOXTT-DAS1-2-rv扩增。DAS1终止子从毕赤酵母基因组DNA扩增（pUC-ORI-DAS1TT-Gibson/pHTX1-DAS1TT-Gibson）。通过Gibson组装构建含双向启动子及两侧两个终止子（AOX1TT和DAS1TT）的载体，得到pPpT4_GAP/TEF-PARS1和pPpT4_HTX1-PARS1。这些质粒在双向启动子上游含EcoRI酶切位点、下游含NotI酶切位点。CAS9 PCR片段（pPpT4_HTX1-PARS1经EcoRI酶切）和含gRNA的gBlock（pPpT4_HTX1-PARS1-Cas9经NotI酶切）依次通过Gibson组装克隆入质粒。用于扩增不同CAS9序列的Gibson引物（PpCAS9、SpCAS9、HsCAS9：pHTX1-ppCas9-Gibson/DAS1TT-ppCas9-Gibson、HTX1-spCas9-Gibson/DAS1TT-spCas9-Gibson、HTX1-hsCas9-Gibson/DAS1TT-hsCas9-Gibson）以及含不同gRNA序列的gBlocks（RZ-GUT1-gRNA1-RZ、RZ-GUT1-gRNA2-RZ、RZ-GUT1-gRNA3-RZ）列于补充表1。
【数据】启动子：PGAP/PTEF融合、PHTX1（PHTA1/PHTB1）、PDAS1/PDAS2；终止子：AOX1TT、DAS1TT；限制酶：SwaI、NotI、EcoRI；组装：Gibson assembly
#### 2.2.3 毕赤酵母靶基因与多重编辑gRNA
靶向AOX1、MPP1（Hansenula polymorpha同源基因）、TRM1、OCH1和MXR1基因编码序列的gRNA以gBlocks订购（RZ-AOX1-gRNA1-RZ、RZ-AOX1-gRNA2-RZ、RZ-AOX1-gRNA3-RZ、RZ-MXR1-gRNA1-RZ、RZ-MXR1-gRNA2-RZ、RZ-MXR1-gRNA3-RZ、RZ-MPP1-gRNA1-RZ、RZ-MPP1-gRNA1-RZ、RZ-MPP1-gRNA3-RZ、RZ-TRM1-gRNA1-RZ、RZ-TRM1-gRNA2-RZ、RZ-TRM1-gRNA3-RZ、RZ-OCH1-gRNA1-RZ、RZ-OCH1-gRNA2-RZ、RZ-OCH1-gRNA3-RZ）。pPpT4_pHTX1-PARS1-hsCas9经NotI线性化后，通过Gibson组装将gBlocks克隆入载体。对于多重编辑实验，含HsCas9和靶向GUT1的gRNA2的质粒（pPpT4_pHTX1-hsCas9-GUT1-gRNA2）经SwaI线性化。HHF2启动子以不同引物对扩增（pAOXsyn-pHHF2-fw-Gibson/HH-AOX1-gRNA1-pHHF2-rv-Gibson、pAOXsyn-pHHF2-fw-Gibson/HH-AOX1-gRNA2-pHHF2-rv-Gibson、pAOXsyn-pHHF2-fw-Gibson/HH-AOX1-gRNA3-pHHF2-rv-Gibson）。所得PCR片段具有不同的Gibson组装重叠区。订购了三个gBlock，分别携带AOX1-gRNA1、AOX1-gRNA2或AOX1-gRNA3及DAS1终止子。启动子片段与相应的含gRNA和终止子的gBlock克隆入载体骨架。
【数据】靶基因：AOX1、MPP1、TRM1、OCH1、MXR1、GUT1；限制酶：NotI、SwaI；启动子：PHHF2；组装：Gibson assembly
#### 2.2.4 HR供体cassette
选取靶基因GUT1上游5′和下游3′各约1000 bp区域以互补SwaI限制性酶切位点，并以含Zeocin标记cassette（含PARG4，参照pPpRSFC-HIS质粒）重叠区的引物从毕赤酵母CBS 7435基因组DNA扩增（引物：GUT1: 3UTRGUTF/3UTRGUTR、5UTRGUTF/5UTRGUTR）。GUT1 PCR片段经OE-PCR连接（3UTRGUTF/5UTRGUTR）后，与Zeocin标记cassette通过Gibson组装。用于毕赤酵母转化时，质粒经SwaI线性化，取1 μg DNA转化感受态细胞。另一种供体DNA cassette将靶基因5′上游和3′下游各1000 bp区域直接融合。GUT1位点5′上游和3′下游区域从毕赤酵母基因组DNA扩增（5GUT1_fw/5GUT1_rv、3GUT1_fw/3GUT1_rv）。PCR片段经OE-PCR连接（外侧引物5GUT1_fw/3GUT1_rv）后克隆入pJET1.2平端载体（CloneJET PCR Cloning Kit，Fisher Scientific GmbH，奥地利维也纳）。用于毕赤酵母转化时，供体cassette以OE-PCR外侧引物从pJET1.2-GUT1载体扩增，取1 μg DNA加入感受态细胞。
【数据】同源臂长度：~1000 bp（5′上游和3′下游）；供体类型：含Zeocin标记（3.8 kbp总大小）和不含标记；用量：1 μg DNA/转化；克隆载体：pJET1.2
2.3 转化与筛选
转化实验（100 ng环状质粒DNA/CRISPR-Cas9质粒，1 μg线性化质粒DNA/HR供体cassette）采用浓缩电穿孔方案进行，转化后在含100 μg/ml Zeocin的YPD（1% w/v酵母提取物、2% w/v蛋白胨、2% w/v葡萄糖）平板（1.5%琼脂）上生长两天。靶向OCH1位点时，因生长速率较慢，转化子培养三天。
【数据】转化DNA量：100 ng（环状质粒）、1 μg（线性供体）；培养基：YPD（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖、1.5%琼脂）；Zeocin浓度：100 μg/ml；培养时间：2天（OCH1为3天）；方法：电穿孔
研究结果
3.1 CRISPR/Cas9在毕赤酵母中的实施
#### 3.1.1 使用RNA Pol III启动子表达gRNA未能促进高效基因组编辑
本文报道了毕赤酵母中首个靶向效率可达100%的CRISPR/Cas9系统。然而，在毕赤酵母中建立CRISPR/Cas9似乎比此前在酿酒酵母和裂殖酵母中的报道需要付出更多努力，标准策略——使用RNA Pol III启动子——几乎未获成功。在本工作框架内，我们变化了Cas9/gRNA表达的多个参数（图1），共构建了95个表达质粒（表1）。
具体而言，gRNA表达的优化被证明尤为关键：多项CRISPR/Cas9文献报道了使用RNA Pol III识别的启动子实现gRNA的功能性表达。天然情况下，RNA Pol III转录5S rRNA、tRNA和小型非编码RNA。与由RNA Pol II转录的蛋白编码基因mRNA不同，RNA Pol III的转录本不含5′-7-甲基鸟苷帽（5′帽）和3′ polyA尾。5′帽负责核糖体募集和mRNA翻译，而polyA序列是转录终止的一部分，对mRNA稳定性至关重要。5′帽和polyA尾对mRNA向细胞质的输出都很重要。然而，gRNA的核输出是不期望的，转录过程中添加的序列可能阻碍gRNA折叠。因此，RNA Pol III启动子被认为更适合gRNA的表达。我们共测试了10种不同的异源和内源RNA聚合酶III启动子用于表达单一gRNA：酿酒酵母的SNR52、RPR1、SCR1和SUP4启动子，毕赤酵母内源tRNA启动子PPpLYS、PPpMET和PPpSER，Pichia angusta（H. polymorpha）的PPaASN，Kluyveromyces lactis的PKlSNR52以及S. pombe的PSpRPR1。作为测试位点，我们尝试编辑GUT1基因——该基因编码毕赤酵母的甘油激酶。GUT1缺陷菌株在以甘油为碳源时表现出比野生型菌株减弱的生长表型。因此GUT1基因的突变可通过将细胞影印至甘油平板轻松检测（补充图S4）。我们设计了三个gRNA分别靶向GUT1编码序列（CDS）距起始密码子125、256和429 bp的位置。gRNA表达cassette由RNA Pol III启动子、靶向GUT1的20 bp可变gRNA、gRNA结构组分（stgRNA1）和SUP4 3′侧翼终止子序列组成（后两者在酿酒酵母中已被DiCarlo等人成功用于CRISPR/Cas9靶向）。为匹配毕赤酵母密码子偏好性，我们对CAS9进行了密码子优化（PpCAS9），并额外测试了链球菌CAS9序列（SpCAS9，GenBank: AAK33936.1）以及人源密码子优化变体（HsCAS9）——后者已在酿酒酵母中成功应用。不同密码子优化的CAS9基因置于强组成型GAP启动子控制下（图2A）。
SV40 NLS——此前已被证明在毕赤酵母中可介导噬菌体聚合酶和GFP报告蛋白的核输入——被C端融合至CAS9用于核靶向。Cas9-eGFP融合蛋白向细胞核的转运在显微镜下观察到（补充图S5）。gRNA和CAS9表达cassette克隆入含自主复制序列（PARS1）的附加型质粒并转化毕赤酵母。该ARS允许通过简单地在非选择性培养基上生长来实现质粒消除，从而最终实现无选择标记的敲除菌株构建（见补充图S6）。在65种不同元件组合（质粒1-65，表1）中，未发现任何在甘油平板上出现生长缺陷的转化子，表明没有发生功能性Cas9介导的基因组编辑。将CAS9表达的PGAP更换为另一种调控方式的启动子（双向启动子PHTX1的单向侧，命名为PHTA1和PHTB1）也未产生甘油缺陷转化子。然而，将gRNA结构组分更换为stgRNA2（Jinek等人在体外使用）后，当使用PGAP表达HsCAS9且gRNA3置于内源SER RNA Pol III启动子下时，GUT1位点的靶向效率达到31.7%（图2A，表1）。当使用PHTA1启动子表达HsCAS9时，靶向效率降至5.6%。在两种功能组合（PGAP-HsCAS9-AOX1TT/PSER-gRNA3-stgRNA2-SUP4TT和PHTA1-HsCAS9-AOX1TT/PSER-gRNA3-stgRNA2-SUP4TT）中还获得了大量混合群体（>30%，见S4）。混合群体妨碍了对正确CRISPR/Cas9突变体的筛选，尤其是在不产生可见表型的情况下。更换可变gRNA序列（以gRNA1或gRNA2替代gRNA3）或将CAS9 DNA序列更换为SpCAS9或PpCAS9均未产生任何GUT1缺陷转化子。
【数据】测试组合：65种（质粒1-65）；靶向效率：31.7%（PGAP-HsCAS9/PSER-gRNA3-stgRNA2）；5.6%（PHTA1-HsCAS9）；混合群体比例：>30%；gRNA靶位：GUT1 CDS第125、256、429 bp处
#### 3.1.2 RNA Pol II启动子与核酶组合实现高效CRISPR/Cas9介导的基因组编辑
随后，为绕开具有挑战性的RNA Pol III启动子介导的gRNA表达，我们采用了另一种策略——由RNA Pol II启动子表达核酶侧翼的gRNA（图2A），此方法此前已在酵母中得以验证。核酶是自剪接RNA元件，可用于去除转录过程中添加的5′和3′序列。我们测试了5′切割的锤头状（HH）核酶与3′切割的丁型肝炎病毒（HDV）核酶组合，用于表达gRNA1、gRNA2和gRNA3以敲除GUT1。当使用PTEF1（翻译延伸因子1α的启动子）表达gRNA1、gRNA2或gRNA3，并使用PGAP表达HsCas9时，靶向效率达到78%至87%。当使用毕赤酵母天然双向PHTX1启动子同时表达HsCAS9和核酶侧翼gRNA时，可获得略高的靶向率（87%至94%）。甲醇诱导型表达HsCAS9（双向PDAS1,2启动子的PDAS2侧）和核酶侧翼gRNA（PDAS1侧）未获成功（数据未显示）。
【数据】靶向效率：78-87%（PTEF1-gRNA/PGAP-HsCas9）；87-94%（PHTX1共表达）；核酶：HH（5′）+ HDV（3′）
#### 3.1.3 CAS9密码子偏好影响转化率，提示毒性效应
携带SpCAS9或PpCAS9（由PHTX1控制表达）以及RNA Pol II启动子表达核酶侧翼gRNA的构建体仅产生少量甘油缺陷突变体（图2B）。因此我们推断密码子偏好性可强烈影响Cas9在特定宿主中的功能性。不同CAS9序列表达导致的转化率也差异显著。用编码HsCas9和gRNA的质粒转化毕赤酵母后，获得约5000个菌落形成单位（CFUs）/μg DNA；而PpCAS9表达质粒仅获得约500 CFUs/μg DNA。用携带SpCAS9的质粒转化细胞时，获得超过20000 CFUs/μg DNA（图2B）。PpCAS9表达似乎对细胞具有毒性作用，表现为转化子数量显著减少。
【数据】转化率：~5000 CFUs/μg DNA（HsCas9）；~500 CFUs/μg DNA（PpCAS9）；>20000 CFUs/μg DNA（SpCAS9）
3.2 多基因靶向与多重编辑
（此部分原文节选未完整提供，以下内容基于可获得的原文信息忠实翻译）
利用优化的CRISPR/Cas9系统，我们对毕赤酵母中多个基因位点进行了靶向敲除研究。该系统能够高效靶向不同基因组位点（图4A），并适用于多重编辑（图4B、C）。
【数据】靶向效率：原文未详述各基因具体数值
3.3 供体cassette整合实验
为测试CRISPR/Cas9介导的同源供体DNA的靶向整合，我们设计了不同的GUT1敲除供体cassette用于与CRISPR/Cas9载体共转化（图5A）。含Zeocin标记的供体DNA由Zeocin标记cassette及两侧同源臂组成（总大小3.8 kbp），不含标记的供体DNA则直接将同源臂融合。
【数据】供体总大小：3.8 kbp（含Zeocin标记）；同源臂：~1000 bp×2
讨论与解读
毕赤酵母中CRISPR/Cas9的高效功能存在一个狭窄的最适条件窗口，这或许解释了为何迄今尚未有该系统在该广泛使用的甲基营养型酵母中报道。我们系统测试了超过90个构建体，涵盖不同密码子优化的CAS9 DNA序列、多种gRNA序列、多个RNA Pol III和RNA Pol II启动子（与核酶组合）用于gRNA表达，以及不同RNA Pol II启动子用于CAS9和gRNA表达。令人惊讶的是，改变单一特征（如将CAS9 DNA序列改为匹配毕赤酵母密码子偏好性）即可完全消除CRISPR/Cas9功能。在95个测试构建体中仅约6%（6/95）能介导高效CRISPR/Cas9靶向——即携带RNA Pol II启动子、核酶和人源密码子优化Cas9序列的那些。通过几个代表性实例，我们证明了该CRISPR/Cas9系统在多个基因组位点敲除中的广泛适用性。多数位点的靶向效率接近100%。通过使用双切割guide RNA证明了多重编辑能力，该系统还针对同源供体cassette的整合进行了表征。凭借高效的无标记精准基因组改变，现在还可以研究由读框中断/移除产生的特定表型。该方法相比经典敲除策略具有重大优势。
编译者解读
本研究的核心价值在于揭示了"直觉优化"的陷阱——按常理为毕赤酵母优化密码子的PpCAS9反而完全失效，而人源密码子优化的HsCAS9配合RNA Pol II启动子与核酶加工系统才实现近100%编辑效率。这一反直觉发现提醒合成生物学研究者：密码子偏好性并非万能法则，异源表达系统的适配需要经验性筛选。核酶策略巧妙地绕开了毕赤酵母内源RNA Pol III启动子效率低下的瓶颈，为其他难转化真菌的CRISPR工具开发提供了可迁移的范式。从应用角度看，PARS1附加型载体实现的无标记基因编辑大幅简化了毕赤酵母的菌株工程流程，对代谢工程中多轮基因组改造尤为重要。不过，该系统对gRNA序列和启动子组合的高度敏感性也意味着——每个新靶位点可能仍需一定程度的经验性优化。
参考来源
Weninger A, et al. Combinatorial optimization of CRISPR/Cas9 expression enables precision genome engineering in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Journal of Biotechnology, 2016. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2016.03.027
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2016.03.027