来源：Construction of isopentenol utilization pathway and artificial multifunctional enzyme for miltiradiene synthesis in Saccharomyces cerevisiae（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
次丹参二烯（miltiradiene）是众多具有重要药理活性的松香烷型二萜的关键前体。酿酒酵母内源甲羟戊酸（MVA）途径受到严格调控，限制了异源合成次丹参二烯的前体供应。本研究在酿酒酵母中构建了正交的异戊烯醇利用途径（IUP），系统考察了其在线粒体和过氧化物酶体中的适配性；通过区室组合工程将产量提升至146.1 mg/L，进一步构建人工多功能酶使产量达到414.4 mg/L，最终在5 L生物反应器中通过补料分批发酵将产量提升至1.02 g/L。
研究背景
二萜家族包含种类繁多、结构和立体化学性质各异的天然产物，其中松香烷型二萜尤为丰富，为药物发现提供了大量来源。次丹参二烯是许多松香烷型二萜——如雷公藤甲素、丹参酮、鼠尾草酚、鼠尾草酸等——的关键前体，这些化合物展现出强效的抗癌活性。然而，这些萜类在原生植物中含量低且结构复杂，通过植物提取和化学合成难以满足市场需求。合成生物学策略为在微生物中异源生产二萜提供了替代途径，同时促进了循环经济的发展。酿酒酵母具有天然的MVA途径，其内膜系统适合细胞色素P450酶的表达。目前酵母中合成次丹参二烯的研究主要集中在MVA途径调控和萜烯合酶优化方面。次丹参二烯由二萜前体香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）经两步环化反应合成。本研究旨在通过区室化工程和人工多功能酶策略突破前体供应瓶颈。
研究方法
2.1 菌株、质粒与试剂
选择酿酒酵母BY4741（MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0）作为宿主菌株，该菌株适合生产二萜类化合物。所有工程化酿酒酵母菌株均通过醋酸锂法转化表达盒构建，所有表达盒见补充材料。大肠杆菌TOP10用于质粒构建。本研究所有质粒均通过无缝克隆方法构建，并采用化学转化法转入大肠杆菌TOP10。工程菌株和质粒的详细基因型列于补充材料。用于基因扩增的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase和用于PCR验证的2×Rapid Taq Master Mix购自Vazyme Biotech（南京，中国），用于质粒构建的SoSoo Seamless Cloning Kit购自北京擎科生物科技（北京，中国）。DNA凝胶纯化和质粒提取试剂盒由Solarbio（北京，中国）提供。所有密码子优化的异源基因由General Biol（安徽，中国）合成。所有引物由擎科生物科技（北京，中国）合成。密码子优化的异源基因和所有引物列于补充材料。酵母提取物和蛋白胨购自Aobox（北京，中国），胰蛋白胨购自Thermo Fisher Scientific（美国），琼脂粉购自Solarbio（北京，中国），酵母氮碱基购自Yuanye（上海，中国），所有氨基酸和异戊烯醇/异戊醇购自Heowns（天津，中国）。肉豆蔻酸异丙酯（IPM）购自Macklin（上海，中国）。
【数据】宿主菌株：S. cerevisiae BY4741；转化方法：醋酸锂法；质粒构建：无缝克隆法；试剂来源：Vazyme、Tsingke、Solarbio等
2.2 菌株培养与发酵
大肠杆菌TOP10在Luria-Bertani培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中于37°C、220 rpm条件下培养。添加相应抗生素（100 µg/mL氨苄青霉素和100 µg/mL卡那霉素）进行质粒筛选。大肠杆菌在含抗生素的LB平板上于37°C培养12 h。所有酿酒酵母菌株在30°C、220 rpm振荡条件下培养。YPD培养基由10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨和20 g/L葡萄糖组成。此外，SD培养基由6.7 g/L酵母氮碱基、20 g/L葡萄糖、20 g/L琼脂和2 g/L不含尿嘧啶、亮氨酸、组氨酸、腺嘌呤、甲硫氨酸和色氨酸的合适完全补充混合物组成，用于筛选转化的酿酒酵母菌株。URA3标记在含有6.7 g/L YNB、20 g/L葡萄糖和1 g/L 5-氟乳清酸（5-FOA）的SD + 5-FOA平板上移除。此外，在YPD中加入500 mg/L遗传霉素（G418）用于筛选重组菌株PCM-MF1、PCM-MT1和PCM-MT2。对于摇瓶发酵，从平板挑取重组酵母单菌落，接种到3 mL YPD培养基中，在30°C、220 rpm条件下培养过夜（16~18 h）。然后将培养物转移到含有30 mL YPD培养基的250 mL摇瓶中（初始OD600 = 0.05），在30°C、220 rpm条件下培养4天。对于两相发酵，培养物上层覆盖10%（v/v）肉豆蔻酸异丙酯（IPM）。在发酵过程中添加异戊醇或异戊烯醇作为IUP的底物。发酵30 h后，向YPD培养基中加入3 mL IPM和25 mM异戊醇。YPD培养基中葡萄糖和蛋白胨的浓度分别基于次丹参二烯产量和菌株生长通过单因素实验进行优化。IUP底物组成的优化在优化的YPD培养基中进行，异戊烯醇总浓度恒定为25 mM，通过改变异戊烯醇和异戊醇的比例进行。菌株PCM-MT1摇瓶发酵的最佳异戊烯醇浓度采用单因素实验方法确定。
【数据】大肠杆菌培养：LB培养基、37°C、220 rpm；酵母培养：YPD培养基、30°C、220 rpm；SD筛选培养基：6.7 g/L YNB、20 g/L葡萄糖、20 g/L琼脂；5-FOA浓度：1 g/L；G418浓度：500 mg/L；摇瓶发酵：初始OD600=0.05、30°C、220 rpm、4天；两相发酵：10%（v/v）IPM；IUP底物添加：发酵30 h后加入3 mL IPM和25 mM异戊醇；IUP底物优化：总浓度25 mM
2.3 产物提取与定量
通过将发酵液在12,000 rpm离心10 min收集有机层，并用正己烷稀释10倍。采用内标法（内标为1-二十碳烯）定量次丹参二烯浓度。将收集的材料与内标1-二十碳烯（5 g/L）和正己烷按9:1:90的体积比混合。过滤后的样品通过配备Rxi-1HT色谱柱（30 m，0.32 mm，0.25 µm；Agilent Technologies）的气相色谱仪检测。色谱条件如下：1 µL不分流进样，分流比20:1，进样口温度250°C，检测器温度300°C，载气流速1.0 mL/min，氮气流速25 mL/min，氢气流速30 mL/min，空气流速300 mL/min。初始柱温箱温度设为60°C保持1 min，然后以15°C/min的速率逐渐升至200°C，随后以10°C/min的速率加热至280°C保持2 min，最后以20°C/min的速率升至300°C保持2 min，用于测定次丹参二烯和香叶基香叶醇（GGOH）。为检测葡萄糖和乙醇的消耗，将发酵液在12,000 rpm离心8 min，取上清液稀释至适当倍数进行检测。葡萄糖含量使用葡萄糖检测试剂盒（GOD-POD比色法，Yuanye，上海，中国）检测。乙醇含量使用乙醇含量检测试剂盒（分光光度法，biotopped，北京，中国）检测。异戊醇通过使用HP-INNOWax色谱柱的GC方法检测。色谱条件如下：1 µL不分流进样，分流比20:1，进样口温度250°C，检测器温度270°C，载气流速1.0 mL/min，氮气流速25 mL/min，氢气流速30 mL/min，空气流速300 mL/min。初始柱温箱温度设为50°C保持1 min，然后以25°C/min的速率逐渐升至200°C，用于测定异戊醇。
【数据】离心：12,000 rpm、10 min；稀释倍数：10倍；内标：1-二十碳烯（5 g/L）；混合比例：9:1:90（样品:内标:正己烷）；GC条件：进样口250°C、检测器300°C；程序升温：60°C（1 min）→15°C/min至200°C→10°C/min至280°C（2 min）→20°C/min至300°C（2 min）；葡萄糖/乙醇检测离心：12,000 rpm、8 min
2.4 5 L生物反应器补料分批发酵
挑取单菌落接种到3 mL YPD培养基中，在30°C、220 rpm条件下培养16 h。将种子培养物接种到两个100 mL YPD培养基的摇瓶中，在30°C、220 rpm条件下培养16 h。将200 mL种子培养物接种到含有2 L YPD培养基的5 L生物反应器中进行发酵。生物反应器发酵温度为30°C，空气流速为2.5 vvm，通过自动添加氢氧化铵将pH维持在5.5。通过将搅拌速度控制在300至600 rpm，使溶解氧（DO）保持在35%以上。对于两相发酵，培养6 h后加入10% IPM。当葡萄糖耗尽且乙醇开始消耗时（16 h）开始补料。补料溶液含有500 g/L葡萄糖、9.0 g/L KH2PO4、3.5 g/L K2SO4、0.28 g/L Na2SO4、5.12 g/L MgSO4·7H2O、10 mL/L微量元素溶液和12 mL/L维生素溶液。补料溶液以低速率（0.6 mL/min）添加，当pH降至5.5以下时自动添加氢氧化铵。在补料分批发酵过程中，添加异戊醇以增强产物合成，每次添加间隔约20 h。
【数据】种子培养：3 mL YPD、30°C、220 rpm、16 h；二级种子：100 mL YPD×2、16 h；接种量：200 mL/2 L；发酵条件：30°C、2.5 vvm、pH 5.5、DO>35%、搅拌300-600 rpm；IPM添加：10%（培养6 h后）；补料开始：16 h；补料成分：500 g/L葡萄糖、9.0 g/L KH2PO4、3.5 g/L K2SO4、0.28 g/L Na2SO4、5.12 g/L MgSO4·7H2O、10 mL/L微量元素、12 mL/L维生素；补料速率：0.6 mL/min；异戊醇添加间隔：约20 h
2.5 靶向线粒体和过氧化物酶体
使用特异性定位信号将酶靶向不同的亚细胞区室（线粒体和过氧化物酶体）。通过添加N末端线粒体靶向序列（MTS）将酶定位到线粒体。通过添加C末端ePTS1将酶定位到过氧化物酶体。不含任何靶向信号的酶定位到细胞质。
【数据】线粒体定位：N端MTS；过氧化物酶体定位：C端ePTS1；细胞质定位：无靶向信号
2.6 统计方法
所有实验均进行三次重复，数据以平均值±标准差表示。采用Student's t检验评估两组间差异的显著性，P < 0.05被认为具有统计学意义。
【数据】重复次数：3次；显著性水平：P < 0.05
研究结果
3.1 在线粒体、过氧化物酶体和细胞质中构建IUP用于次丹参二烯生产
将ScCK（酿酒酵母内源胆碱激酶）和AtIPK（来自拟南芥的异戊烯基磷酸激酶）分别靶向细胞质（菌株CytI）、线粒体和过氧化物酶体（图2a）。为在不同细胞区室内维持DMAPP和IPP的平衡分布，在引入IUP的同时在线粒体和过氧化物酶体中共表达IDI1（分别为菌株MitI和PerI）。结果表明，在不同细胞区室中表达IUP抑制了细胞生长，且添加异戊醇加剧了细胞毒性（图2c）。异戊烯醇对酿酒酵母的生长抑制现象已有报道，但其潜在机制尚不清楚。推测IUP对酵母的毒性可能由ScCK对内源途径的干扰以及AtIPK的底物混杂性引起。与BY4741相比，添加异戊醇对CytI和PerI影响较小，但对菌株MitI的生长影响更大（图2c）。已有研究证实，线粒体中积累的DMAPP和IPP可在真核细胞中转化为ATP类似物，这些类似物必然干扰线粒体氧化磷酸化的正常功能，从而对细胞生长和代谢产生负面影响。因此，在酵母中构建IUP驱动的前体合成平台时，需要考虑异戊烯醇和途径引入对菌株生长的影响。
为评估IUP对前体合成的影响，测定了GGPP脱磷酸化衍生物GGOH的含量变化（图2b）。将IUP引入细胞质、线粒体和过氧化物酶体后，GGOH/OD600nm水平分别提高了1.5倍、1.3倍和1.2倍（图2d）。GGOH水平的升高表明GGPP和IPP/DMAPP库的积累。与先前研究结果不同，本研究发现将IUP引入细胞质和过氧化物酶体后前体含量的增加相似。这可能归因于分析所选前体的不同以及样品收集时间的差异。这些发现表明，将IUP引入线粒体和过氧化物酶体以增加萜烯前体通量是有效的。
随后，在酵母的不同亚细胞区室中引入次丹参二烯生物合成下游途径，分别获得菌株CytI-M（亲本菌株CytI）、MitI-M（亲本菌株MitI）和PerI-M（亲本菌株PerI）。利用BTS1-ERG20F96C融合蛋白和tSmCPS-tSmKSL融合蛋白实现了次丹参二烯的合成（图2a）。添加异戊醇有效提高了CytI-M（细胞质菌株）和PerI-M（过氧化物酶体菌株）中次丹参二烯的产量，分别从10.3 mg/L和12.7 mg/L提高到15.6 mg/L和16.7 mg/L（图2e）。过氧化物酶体区室化改善了底物通道效应，使得无论是否添加异戊醇，菌株PerI-M的次丹参二烯产量均高于菌株CytI-M。因此，过氧化物酶体被确定为利用IUP合成次丹参二烯的优越平台。
尽管添加了异戊醇，菌株MitI-M中次丹参二烯的滴度仍持续偏低，仅为1.8 mg/L（图2e）。推测tSmCPS-tSmKSL融合蛋白在高pH值的线粒体环境中可能表现出降低的催化效率，且先前研究已表明pH对二萜合酶活性有较大影响。值得注意的是，菌株MitI-M的GGOH含量在添加异戊醇后增加，而菌株CytI-M和PerI-M的GGOH含量保持相对稳定（图2g）。BTS1-ERG20F96C融合蛋白在线粒体中的表达通过促进IPP和DMAPP转化为GGPP来降低其毒性，因此线粒体菌株MitI-M在添加异戊醇后表现出比其亲本菌株MitI更好的生长（图2c和2f）。这些结果表明，线粒体可以引入IUP但不适合表达松香烷二萜合酶。
【数据】GGOH/OD600nm提升：细胞质1.5倍、线粒体1.3倍、过氧化物酶体1.2倍；CytI-M产量：10.3→15.6 mg/L（添加异戊醇）；PerI-M产量：12.7→16.7 mg/L（添加异戊醇）；MitI-M产量：1.8 mg/L
3.2 跨多区室协同合成次丹参二烯
为高效利用内源MVA途径产生的前体，在PerI-M的细胞质中引入次丹参二烯合成模块构建了菌株PC（图3a），次丹参二烯产量提高了2.2倍，达到35.9 mg/L（图3b）。先前研究也表明细胞质和过氧化物酶体的双重调控提高了异戊二烯产量。过氧化物酶体中产生的IPP/DMAPP可以通过单层膜扩散到细胞质中。通过在细胞质中表达次丹参二烯合成模块，细胞质中MVA途径产生的以及从过氧化物酶体泄漏的IPP/DMAPP被消耗用于次丹参二烯的合成。
尝试通过在细胞质中构建IUP来增加前体IPP/DMAPP的通量，但菌株PCC-I的次丹参二烯产量没有提高（图3b）。这可能是因为细胞质中ATP不足限制了IUP的生产力。这些结果表明，次丹参二烯合成模块在细胞质和过氧化物酶体中的双重分布可以产生协同效应以增加次丹参二烯的产量。因此，选择菌株PC进行进一步研究。
真核细胞的线粒体合成大量ATP，因此被认为是细胞的动力站。通过IUP合成的IPP/DMAPP需要ATP作为唯一辅因子。为利用线粒体内丰富的ATP库，在菌株PC的线粒体中构建了IUP驱动的前体形成平台，获得菌株PCM-I1（图3a）。菌株PCM-I1中次丹参二烯的产量提高至45.2 mg/L（图3b）。通过将IUP引入线粒体合成的DMAPP可以输出到细胞质，被细胞质模块用于次丹参二烯的合成。线粒体中DMAPP的输出也在将MVA途径引入线粒体的研究中被观察到，表明线粒体中积累的DMAPP可以通过细胞质中的下游途径被消耗。
还构建了菌株PCM-I2，在IUP的同时引入IDI1，以研究平衡线粒体中DMAPP和IPP水平的必要性。然而，菌株PCM-I2中次丹参二烯的滴度（40.9 mg/L）与PCM-I1相比没有增加（图3b），表明引入IDI1来平衡线粒体内DMAPP和IPP的水平是不必要的。线粒体中IDI1的表达不影响产物合成，因为IPP和DMAPP都可以从线粒体进入细胞质，并且其通量可以由细胞质中存在的IDI1调控。此外，IUP的引入和异戊醇的补充对菌株PCM-I1和菌株PCM-I2的生长影响较小（图3b）。IPP/DMAPP对线粒体的毒性可以通过细胞质中下游途径的过表达来降低，这促进了IPP/DMAPP从线粒体向细胞质的输出，从而减少了对菌株生长的影响。
【数据】PC菌株产量：35.9 mg/L（2.2倍提高）；PCC-I产量：无提高；PCM-I1产量：45.2 mg/L；PCM-I2产量：40.9 mg/L
3.3 多区室组合工程提升次丹参二烯产量
为进一步提高次丹参二烯的产量，在菌株PCM-I1的基础上进行了多区室组合工程。将次丹参二烯合成模块同时表达于细胞质和过氧化物酶体，构建了菌株PCM-MT1。该菌株整合了线粒体IUP驱动的前体合成、细胞质和过氧化物酶体中的下游合成模块，实现了多区室的协同生产。通过这种组合策略，次丹参二烯的产量进一步提升至146.1 mg/L（图3b），较单区室策略有了显著提高。
【数据】PCM-MT1产量：146.1 mg/L
3.4 人工多功能酶增强次丹参二烯合成
受天然多功能酶的启发，研究构建了人工多功能酶tSmCPS-tSmKSL-PvPT，将异戊烯基转移酶与tSmCPS-tSmKSL融合。该多功能酶能够催化从IPP/DMAPP到次丹参二烯的多步反应。将编码该人工多功能酶的模块在菌株PCM-MT1的细胞质中表达，构建了菌株PCM-MF1。通过筛选不同的异戊烯基转移酶结构域，最终确定PvPT为最优选择。应用人工多功能酶后，菌株PCM-MT1的次丹参二烯产量达到414.4 mg/L（图4c）。
【数据】PCM-MT1产量（含人工多功能酶）：414.4 mg/L；最优异戊烯基转移酶：PvPT
3.5 发酵优化与放大生产
在摇瓶水平对YPD培养基中的葡萄糖和蛋白胨浓度进行了单因素优化。结果表明，适当提高葡萄糖浓度有利于次丹参二烯的积累，而蛋白胨浓度对菌株生长和产物合成也有显著影响。在优化培养基的基础上，对IUP底物（异戊烯醇和异戊醇）的比例进行了优化，在总浓度25 mM恒定的条件下，确定了最佳比例。进一步通过单因素实验确定了菌株PCM-MT1摇瓶发酵的最佳异戊烯醇浓度。最终，在5 L生物反应器中进行了补料分批发酵。在发酵过程中，通过自动补料维持葡萄糖供应，并定期添加异戊醇。经过发酵优化和放大，次丹参二烯的滴度最终达到1.02 g/L。
【数据】5 L生物反应器产量：1.02 g/L；IUP底物优化：总浓度25 mM
讨论与解读
本研究通过IUP驱动的前体合成与多功能酶工程的协同策略，显著提升了酿酒酵母中次丹参二烯的产量。通过将IUP和MVA合成途径合理分布于细胞质、线粒体和过氧化物酶体，实现了各区室物质和能量的最优利用，次丹参二烯产量提高了11.5倍。随后，通过将异戊烯基转移酶与tSmCPS-tSmKSL融合构建了人工多功能酶，结合发酵优化，产量进一步提高了2.8倍至414.4 mg/L，并在5 L生物反应器中通过补料分批发酵达到1.02 g/L（较之前提高2.46倍）。这些方法可用于构建生产其他松香烷型二萜（如雷公藤甲素和鼠尾草酸）的酵母细胞工厂。未来研究可采用多组学技术阐明异戊醇底物抑制细胞生长的分子机制，优化发酵工艺将有助于该菌株在工业规模生产中的应用。
编译者解读
本研究展示了区室化工程与蛋白融合策略在萜类合成中的强大协同效应——利用过氧化物酶体的底物通道优势、线粒体的ATP供给能力，以及人工多功能酶的底物引导效应，将次丹参二烯产量从10 mg/L级别推升至克级水平。这种"空间分工+酶工程"的组合思路对其它萜类化合物的微生物合成具有直接借鉴价值。值得注意的是，线粒体虽不适合表达二萜合酶，却可作为前体供给平台，这一发现拓展了区室化设计的认知边界。未来若能在工业菌株中验证该策略的稳健性，并解决异戊醇毒性问题，将有望推动松香烷型二萜药物的微生物制造走向产业化。
参考来源
Ge W. Construction of isopentenol utilization pathway and artificial multifunctional enzyme for miltiradiene synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Bioresource Technology, 2025. DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132065
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132065