来源：Simple and reliable in situ CRISPR-Cas9 nuclease visualization tool is ensuring efficient editing in Streptomyces species（Journal of Microbiological Methods）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
CRISPR-Cas9技术在链霉菌基因工程中应用前景广阔，但Cas9核酸酶对宿主的毒性常导致编辑效率低下且重现性差。本研究开发了一种简单可靠的Cas9-SD-GusA监测工具，将cas9核酸酶与β-葡萄糖醛酸酶（gusA）报告基因进行转录融合，实现了对Cas9表达细胞的原位鉴定。在最优条件下，100%显示GusA活性的菌落携带目标基因型，而缺乏GusA活性的菌落则因cas9序列发生重组而成为携带未编辑基因型的"逃逸菌落"。该方法为CRISPR-Cas9优化提供了高效工具。
研究背景
链霉菌及其分类学近缘细菌七十多年来一直是生物活性药物最丰富的来源之一。然而链霉菌难以进行基因工程改造，开发先进的基因工具至关重要。尽管CRISPR-Cas技术已成为链霉菌遗传改造的有力工具，但在实践中仍面临诸多技术障碍。CRISPR系统通常通过高拷贝质粒递送至链霉菌，而Cas9核酸酶可能对宿主造成严重负担，导致CRISPR-Cas9编辑方法的重复性往往很低。当CRISPR-Cas工具应用于链霉菌时，编辑效率差异很大，转化后常出现含有非预期编辑或野生型序列的活菌落，即"逃逸菌落"，这些菌落往往使目标克隆的鉴定复杂化。因此，开发一种能够简单检测"逃逸"表型并高效优化CRISPR-Cas9的工具具有重要意义。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养方法
本研究所用菌株和质粒列于表S1。大肠杆菌DH10β细胞用于克隆。大肠杆菌ET12567/pUB307菌株用于将质粒接合转移至S. rimosus菌株。使用来自美国典型培养物保藏中心的Streptomyces rimosus菌株ATTC 10970（NRRL 2234）（多数文献中称R7），该菌株带有otc基因簇缺失，命名为ATCCΔotc。S. rimosus ATCCΔotc菌落在MS琼脂平板上呈现完全白色，这简化了GusA表型的观察。大肠杆菌菌株在2TY（酵母提取物-胰蛋白胨）培养基中培养，28°C条件下培养。S. rimosus在28°C下于MS琼脂培养基或液体TSB中培养，用于总基因组DNA分离。大肠杆菌培养物在需要时补充100 μg/mL阿普拉霉素（apr）和50 μg/mL卡那霉素（kan）。使用30 μg/mL硫链丝菌素（tio）用于S. rimosus的选择。接合后，使用35 μg/mL萘啶酸（nal）消除大肠杆菌。用于GusA活性可视化的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸（X-gluc）购自X-gluc Direct（西班牙）。通过将适量X-gluc溶于DMSO制备0.5 M X-gluc储备溶液。直接将X-gluc加入MS琼脂平板时，终浓度为4 mM。或者，为增强GusA可视化的强度，用4 mL 30 mM X-gluc溶液覆盖MS琼脂平板。
【数据】菌株：E. coli DH10β、E. coli ET12567/pUB307、S. rimosus ATCC 10970 (NRRL 2234) Δotc；培养基：2TY、MS琼脂、TSB；温度：28°C；抗生素浓度：apr 100 μg/mL、kan 50 μg/mL、tio 30 μg/mL、nal 35 μg/mL；X-gluc浓度：0.5 M储备液、4 mM（直接添加）、30 mM（覆盖用）
2.2 Cas9-SD-GusA筛选系统构建
引物由Integrated DNA Technologies（IDT，美国）提供，含有22–45 bp重叠区以实现基于同源性的克隆操作。所有PCR扩增均使用repliQa HiFi ToughMix DNA聚合酶混合物（Quantabio，美国）。使用peqGOLD细菌DNA分离试剂盒（VWR，美国）分离基因组DNA。使用EZNA质粒DNA小提试剂盒（Omega Bio-tek，美国）进行质粒分离。本研究中使用的质粒构建体和图形使用Geneious R10和R11.1.5软件设计（https://www.geneious.com）。
为实现在S. rimosus中质粒的有效选择，首先将硫链丝菌素抗性 cassette（tsr）引入pREP_P1_cas9质粒（图1A），该质粒由Novartis/Lek惠赠（Mrak et al., 2018）。tsr cassette从质粒pAB04中扩增，使用T4 DNA连接酶（Thermo Fischer Scientific，美国）插入到经BspOI和ClaI（FastDigest，Thermo Fischer Scientific，美国）消化的pREP_P1_cas9质粒中（图1A），从而生成质粒构建体pREP_P1_cas9_tsr（图1B）。pREP_P1_cas9_tsr用SpeI（FastDigest，Thermo Fischer Scientific，美国）线性化（图1B）以允许进一步插入。
含有gusA序列的区域从质粒pSETGUS中扩增。与cas9转录起始位点处的SD序列相同的Shine-Dalgarno序列（SD）通过SD-GusA-Fw引物引入gusA起始密码子上游。由于stAp基因缺失较小（1422 bp），使用Geneious R10软件设计了一个靶向stAp编码序列5′端的单一sgRNA（图3C）。gRNA cassette由ATG Biosynthetics GmbH（德国）合成。然后，通过NEBuilder反应（New England Biolabs，美国）将靶向stAp的20 bp gRNA区域作为ssDNA引入NcoI消化（FastDigest，Thermo Fischer Scientific，美国）的gRNA cassette中，类似于Tong等人所述方法，并进行PCR扩增（图1D）。该方法允许快速替换靶向序列。
上游（UP，1121 bp）和下游（DOWN，1094 bp）同源区从S. rimosus ATCC 10970Δotc基因组DNA扩增，起始位置紧邻stAp基因（图3C）。由于组装多个片段始终具有挑战性，研究者力求尽量减少单次反应中需要组装的片段数量。这通过将重叠延伸PCR方法（OE-PCR）与基于同源性的克隆技术SLiCE克隆相结合来实现。stAp_UP同源区、stAp_DOWN同源区和stAp_gRNA首先连接成OE-PCR片段（2625 bp）（图1D）。OE-PCR反应由等摩尔量的各部分组成，初始运行10个循环不加引物。第一步后，加入外部引物（stAp_gRNA_Fw和stAp DOWN_Rw）再运行30个循环（图1D）。然后将stAp OE-PCR片段与gusA PCR片段及SpeI线性化的pREP_P1_cas9_tsr在SLiCE反应中连接，获得最终质粒构建体pREP_cas9_SD_gusA_stAp（图1C）。
【数据】引物重叠区：22–45 bp；tsr cassette来源：pAB04质粒；限制酶：BspOI、ClaI、SpeI、NcoI（FastDigest）；gusA来源：pSETGUS质粒；stAp基因大小：1422 bp；sgRNA靶向：stAp 5′端；UP同源区：1121 bp；DOWN同源区：1094 bp；OE-PCR片段：2625 bp；OE-PCR循环：10轮无引物+30轮有引物；最终质粒：pREP_cas9_SD_gusA_stAp
2.3 微生物学方法
#### 2.3.1 属间接合与接合子筛选
通过接合将携带CRISPR-Cas9的质粒导入受体菌S. rimosus ATCC Δotc。pREP_cas9_SD_gusA_stAp首先电穿孔转入E. coli ET12567/pUB307。然后使用经典的大肠杆菌-链霉菌接合方法将质粒转移至S. rimosus。接合混合物涂布在补充有10 mM MgCl2和10 mM CaCl2的MS琼脂平板上。在28°C孵育8小时后，用2 mL tio + nal水溶液覆盖平板，终浓度为30 μg/mL。在28°C孵育6天后，将出现的接合子（图S1）划线接种到新鲜的MS + tio + nal平板上。
【数据】接合平板：MS琼脂+10 mM MgCl2+10 mM CaCl2；孵育：28°C、8h后覆盖tio+nal（终浓度30 μg/mL）；总孵育时间：6天；筛选平板：MS + tio + nal
#### 2.3.2 成功缺失stAp基因菌落的鉴定
GusA活性的视觉检测通过将X-gluc直接添加到MS平板至终浓度4 mM，或在6天孵育期后用4 mL 30 mM X-gluc溶液覆盖培养物进行（图3A）。选择8个显示蓝色着色的接合子用于验证stAp基因缺失。同时选择10个在MS + tio + X-gluc平板上生长后未显示蓝色着色的接合子进行进一步研究。从两组接合子中分离基因组DNA，并使用引物ΔstAp_Fw和ΔstAp_Rw进行PCR以确认stAp缺失（图3）。质粒构建体pREP_cas9_SD_gusA_stAp在进行PCR前未从S. rimosus培养物中清除。因此，用于确认stAp缺失的两个引物设计为在非同源区外侧退火（图3C）。
【数据】X-gluc添加：终浓度4 mM（直接添加）或4 mL 30 mM溶液（覆盖）；蓝色菌落数：8个；白色菌落数：10个；PCR引物：ΔstAp_Fw/ΔstAp_Rw（退火于同源区外侧）
#### 2.3.3 S. rimosus – E. coli质粒拯救实验
分析了直接从接合子中获得的质粒构建体的完整性。从确认stAp缺失的S. rimosus菌落中分离基因组DNA，这些菌落显示GusA活性，称为"蓝色菌落"。同时从PCR无法确认stAp缺失的菌落中分离基因组DNA，这些菌落未显示GusA活性，因此称为"白色菌落"（图3A）。将1 μL来自"蓝色"和"白色"菌落的各总DNA分离物转化电感受态E. coli DH10β，涂布于2TY + apr琼脂平板。在28°C孵育24小时后出现的单个E. coli菌落接种到2TY + apr液体培养基中，孵育16小时后进行质粒分离。
【数据】转化量：1 μL总DNA；筛选平板：2TY + apr琼脂；孵育：28°C、24h（固体）、16h（液体）
研究结果
3.1 pREP_cas9_SD_gusA_stAp质粒的构建及其用于共转录筛选
CRISPR系统（图2A）基于质粒pREP_P1_WT_cas9，含有pTJU412（pIJ101来源）复制起点、密码子优化的化脓性链球菌Cas9编码序列，以及茶碱诱导型ErmEp1-based P1启动子。pREP_P1_cas9质粒含有TraJ和oriT用于转移功能，以及阿普拉霉素抗性标记。sgRNA表达受合成P21启动子和天然化脓性链球菌反式激活CRISPR RNA终止子的控制。
为直接进行cas9转录的显色监测，构建了遗传元件Cas9-SD-GusA（图2C），其中cas9基因后接两个终止密码子、一个用于进一步修饰的HindIII限制性位点，以及含有Shine-Dalgarno（SD）序列的13 bp P1启动子片段。为防止Cas9-GusA融合双蛋白的翻译，gusA的起始密码子（ATG）以与cas9基因不同的阅读框转录。Cas9-SD-GusA的转录产生单一mRNA，通过两个核糖体结合位点翻译成两种蛋白质（图2C）。根据该策略，Cas9和GusA的翻译应同时但独立地进行。因此，当将GusA底物X-gluc直接添加到MS平板时，表达Cas9核酸酶的菌落也应产生蓝色（图3A）。在本模型系统中，靶向stAp基因（S. rimosus ATCC 10970基因组：6064838 bp–6066259 bp），该基因编码一种胞外肽酶，负责降解链霉菌中参与细胞壁重排的肽。
【数据】质粒骨架：pREP_P1_WT_cas9；复制起点：pTJU412（pIJ101来源）；启动子：P1（茶碱诱导型ErmEp1-based）、P21（合成）；Cas9-SD-GusA元件：cas9+2终止密码子+HindIII位点+13 bp P1启动子（含SD序列）；靶基因：stAp（基因组位置6064838 bp–6066259 bp）
3.2 Cas9表达的原位监测与stAp缺失确认
完成E. coli ET/pUB307 - S. rimosus ATCC 10970Δotc接合程序后，MS平板上出现的接合子被划线接种到新鲜的MS + tio + nal琼脂平板。当用X-gluc覆盖时，大量接合子呈现蓝色，可与未着色的接合子清楚区分（图3A）。选择蓝色和白色表型的菌落进行进一步评估，因此划线接种到补充X-gluc的选择性SM培养基。
所有划线接种的S. rimosus ATCCΔotc/pRep_P1_cas9_SD_gusA_stAp接合子均通过使用从各划线菌落分离的DNA进行PCR分析，检测stAp基因的靶向缺失。如图3B所示，所有显示蓝色表型的S. rimosus/pRep_P1_cas9_SD_gusA_stAp菌落均显示预期的PCR扩增产物（2303 bp），从而确认stAp基因的缺失。相比之下，仅有一个未着色的S. rimosus/pRep_P1_cas9_SD_gusA_stAp菌落似乎具有所需的ΔstAp基因型，而其他九个菌落显示WT基因型（3717 bp）。
【数据】蓝色菌落PCR产物：2303 bp（确认stAp缺失）；白色菌落中：1/10为ΔstAp基因型，9/10为WT基因型（3717 bp）
3.3 通过Cas9-SD-GusA系统鉴定质粒重组事件
由于S. rimosus中从未发生对硫链丝菌素的自发抗性，"白色菌落"被用于进一步分析。使用质粒拯救方法，分离质粒DNA并随后用PstI限制酶消化，该酶将质粒切割成大小可区分的DNA片段（图4B）。如限制性分析所示（图4A），"白色"菌落中编码大部分Cas9、GusA、gRNA以及含有同源区上下游整个DNA序列的质粒DNA片段被删除。因此，质粒DNA内一个8.2 kbp的片段被删除，产生一个更小的质粒（7856 bp），仅包含基本功能，即确保复制、接合转移和硫链丝菌素抗性。
从Sanger测序数据获得了具有大片段缺失的质粒的精确DNA序列（图S3）。令人惊讶的是，从"白色"菌落获得的所有分析质粒都携带相同的缺失。这可能表明重组事件发生在接合程序的早期阶段，即在大肠杆菌供体中。研究者评估了直接从用于将质粒从E. coli接合转移至S. rimosus的储存E. coli ET12567/pUB307菌株中分离的pREP_cas9_SD_gusA_stAp质粒的状态。根据PstI多切点酶的限制性分析，所有E. coli ET12567/pUB307克隆均携带完整的pREP_cas9_SD_gusA_stAp质粒。因此可以得出结论，质粒pREP_cas9_SD_gusA_stAp在E. coli ET12567/pUB307中稳定维持（图S2）。
【数据】缺失片段大小：8.2 kbp；缺失后质粒大小：7856 bp；分析样本：白色菌落质粒（均携带相同缺失）；E. coli ET12567/pUB307中质粒状态：完整（PstI限制性分析确认）
讨论与解读
链霉菌中CRISPR-Cas工具使用面临的困难通常源于其对宿主细胞的潜在毒性。当CRISPR-Cas工具应用于链霉菌菌株时，编辑效率差异很大。转化后常出现含有非预期编辑或野生型序列的活菌落，即"逃逸菌落"。研究表明，cas核酸酶基因或间隔区的失活是常见的逃逸机制——谷氨酸棒杆菌中cas9基因失活、盐杆菌Haloferax volcanii中77%的逃逸菌落在cas基因簇中存在缺失或突变。Cas9毒性不仅导致大量细胞不可存活，还对优先消除Cas9活性的重组事件施加选择压力。虽然CRISPR组分的过表达常导致严重细胞毒性，但极弱水平的表达又可能导致基因组编辑效率低下。
本研究开发的Cas9-SD-GusA系统通过转录融合策略，实现了对Cas9表达与编辑效率的直接关联评估。在最优条件下，100%显示GusA活性的菌落携带目标基因型，而白色菌落中90%为野生型，且其质粒均发生了相同的8.2 kbp大片段缺失。该系统能够简单、可靠地区分真正编辑菌落与逃逸菌落，为CRISPR-Cas9在链霉菌中的优化提供了实用工具。
编译者解读：该研究巧妙利用gusA报告基因与cas9的共转录融合，将不可见的Cas9毒性问题转化为可视化的蓝白斑筛选，大幅降低链霉菌基因编辑中的假阳性筛选成本。方法学上，OE-PCR与SLiCE克隆的组合有效减少了多片段组装的复杂度，值得在放线菌编辑中推广。然而，系统依赖高拷贝质粒，重组导致的质粒不稳定仍是潜在隐患；未来若能整合至染色体或采用低拷贝载体，或可进一步降低逃逸率。该工具对工业菌株的高通量编辑筛选具有直接应用价值。
参考来源
Pšeničnik A. Simple and reliable in situ CRISPR-Cas9 nuclease visualization tool is ensuring efficient editing in Streptomyces species. Journal of Microbiological Methods, 2022. DOI: 10.1016/j.mimet.2022.106545
DOI: 10.1016/j.mimet.2022.106545