来源：Establishing and optimizing phloroglucinol biosynthesis from methanol in Methylobacterium extorquens AM1 via strain engineering and medium optimization（New Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
甲醇作为重要的一碳原料，在循环生物经济转型中扮演日益关键的角色。甲基营养菌Methylobacterium extorquens AM1能高效利用甲醇生长，是甲醇生物技术的理想底盘生物。本研究首次在M. extorquens中表达III型聚酮合酶PhlD，实现从甲醇到聚酮化合物间苯三酚的转化。研究发现间苯三酚在培养基中不稳定，易被锰、铁离子催化氧化聚合，通过降低培养基中锰浓度，间苯三酚产量提升1.7倍。
研究背景
一碳（C1）原料用于生物基化学品生产，在解决当今资源与环境问题中作用日增。甲醇是C1生物技术中颇具前景的原料，可通过电化学方法由CO₂和H₂可持续生产。凭借高能量潜力与可持续来源，甲醇被认为是支撑未来生物经济的合适原料。所谓"甲醇生物经济"概念最早由George Olah提出，设想甲醇作为核心化学构件，在众多工业与化学过程中替代石油衍生原料。除化学过程中的角色外，甲醇还可作为微生物生长的原料，用于生产增值化学品。
Methylobacterium extorquens AM1是甲醇生物转化为增值化学品的理想底盘生物。这种甲基营养型α-变形菌能从甲醇和二氧化碳中获得全部生物量，其代谢路径为：先将甲醇氧化为甲醛，再进一步氧化为甲酸；甲酸或被氧化为CO₂以保存能量，或通过甲酸四氢叶酸连接酶和丝氨酸循环进入中心碳代谢。乙基丙二酰辅酶A途径（EMCP）则是补充丝氨酸循环所必需。
研究方法
菌株与培养条件
本研究所用菌株汇总于补充表1。除非另有说明，均使用Methylobacterium extorquens AM1 Δcel。质粒构建与扩增使用E. coli Top10（Invitrogen）。M. extorquens在30°C、含123 mM甲醇的极限培养基（MM）中培养。铁、锰浓度不同的MM变体通过制备不含痕量金属的基础培养基获得（1.62 g/L NH₄Cl、0.2 g/L MgSO₄、2.21 g/L K₂HPO₄、1.25 g/L NaH₂PO₄·2H₂O）。接种前，补充含所需锰浓度（MnCl₂·4H₂O）的1000×痕量元素溶液（4.5 g/L ZnSO₄·7H₂O、0.3 g/L CoCl₂·6H₂O、1 g/L H₃BO₃、2.5 g/L CaCl₂、0.4 g/L (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O和0.3 g/L CuSO₄·5H₂O）以及含所需铁浓度（FeSO₄·7H₂O）的1000×铁溶液（15 g/L Na₂EDTA·2H₂O）。E. coli Top10在37°C的溶菌肉汤（LB）培养基中培养。必要时，培养基中添加四环素或卡那霉素至终浓度10或35 mg/L。E. coli TOP10使用50 mg/L卡那霉素。M. extorquens AM1及其衍生菌株的电感受态细胞按已发表方法制备，质粒通过电穿孔导入。
【数据】菌株：M. extorquens AM1 Δcel、E. coli Top10；培养基：MM（含123 mM甲醇）、LB；温度：30°C（M. extorquens）、37°C（E. coli）；抗生素：四环素10 mg/L、卡那霉素35 mg/L（E. coli为50 mg/L）；痕量元素：ZnSO₄·7H₂O 4.5 g/L、CoCl₂·6H₂O 0.3 g/L、H₃BO₃ 1 g/L、CaCl₂ 2.5 g/L、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.4 g/L、CuSO₄·5H₂O 0.3 g/L；铁溶液：Na₂EDTA·2H₂O 15 g/L
质粒构建
本研究所用质粒汇总于补充表1。phlD基因以Q5聚合酶（New England Biolabs）从Pseudomonas protegens Pf 5基因组DNA经PCR扩增，引物见补充表2。纯化的PCR产物与载体pET16b经XbaI和NcoI（New England Biolabs）双酶切，用T4连接酶（New England Biolabs）连接。连接产物转化入E. coli Top10，菌落用GoTaq green mix（Promega）进行菌落PCR筛选，引物见补充表2。阳性克隆提取质粒，用前述引物进行Sanger测序。从新获得的质粒pET16b-phlD中，用Q5聚合酶扩增表达 cassette，引物见补充表2。质粒pTE103、pTE104和pTE105经PstI-HF或SbfI-HF（New England Biolabs）酶切，并用虾碱性磷酸酶（New England Biolabs）处理。酶切后的载体与PCR产物纯化后，按载体:插入片段=1:5比例混合，用Gibson Assembly组装。组装产物转化入E. coli Top10，菌落筛选方法如前所述，引物见补充表2。M. extorquens AM1的phaC基因上下游侧翼区克隆入基因敲除载体pREDSIX。为此，以M. extorquens AM1基因组DNA为模板，用补充表2所示引物扩增侧翼区。所得PCR产物用于与经MfeI酶切的pREDSIX载体进行Gibson Assembly。所得载体经NdeI酶切，将从pRGD-KanR质粒以NdeI切出的卡那霉素抗性 cassette 连接到酶切位点，生成最终基因敲除载体。
【数据】酶：Q5聚合酶、XbaI、NcoI、T4连接酶、PstI-HF、SbfI-HF、虾碱性磷酸酶、MfeI、NdeI；载体：pET16b、pTE103、pTE104、pTE105、pREDSIX、pRGD-KanR；比例：载体:插入片段=1:5；菌株：P. protegens Pf 5（phlD来源）
摇瓶生长与生产实验
间苯三酚生产实验在500 mL摇瓶中进行，装液量100 mL。M. extorquens AM1菌株在标准MM中预培养，用新鲜培养基洗涤，稀释至起始OD₆₀₀为0.1后接入含目标培养基的摇瓶。摇瓶于30°C、200 rpm振荡培养，每日取样监测生长与间苯三酚产量。为测定M. extorquens在不同痕量金属浓度培养基中的生长，主培养接种前将细胞悬液用不含任何痕量元素的新鲜培养基洗涤。
【数据】培养容器：500 mL摇瓶（装液量100 mL）；起始OD₆₀₀：0.1；温度：30°C；转速：200 rpm；取样频率：每日
间苯三酚定量检测
培养样品中间苯三酚浓度按已发表方法测定。取1 mL spent培养基样品，冻干后用200 µL甲醇重悬，于30°C、180 rpm振荡过夜。取2 µL提取液转移至96孔板（Sarstedt）孔中，室温孵育15 min使甲醇蒸发。样品用30 µL（3:1甲醇:HCl）重新溶解，加入30 µL肉桂醛试剂（0.2%（w/v）4-羟基-3-甲氧基肉桂醛，3:1乙醇:HCl），孵育5 min。使用Tecan Infinite酶标仪测定550 nm处吸光度，样品吸光度与间苯三酚（Sigma-Aldrich）标准曲线（10–100 mg/L）比较。标准曲线通过将目标浓度间苯三酚掺入培养培养基中制备，并以与样品相同方式处理。
【数据】样品量：1 mL；甲醇重悬：200 µL；孵育：30°C、180 rpm、过夜；提取液上样量：2 µL；显色：30 µL（3:1甲醇:HCl）+ 30 µL肉桂醛试剂、5 min；检测波长：550 nm；标准曲线范围：10–100 mg/L
Nile Red染色
M. extorquens AM1 pTE103和M. extorquens AM1 ΔphaC pTE103接种于含10 mg/L Nile Red的MM平板上，按已发表方案进行。30°C孵育5天后，使用iBright™ CL1500（Invitrogen）获取图像。同时获取透射光和荧光（λex 515–545 nm / λem 675–720 nm）图像，用iBright™ Analysis Software（Invitrogen）合并。
【数据】Nile Red浓度：10 mg/L；孵育时间：5天；温度：30°C；荧光参数：λex 515–545 nm / λem 675–720 nm
间苯三酚稳定性测定
为测定间苯三酚在溶液中的稳定性，将溶液与间苯三酚混合至200 mg/L浓度，室温孵育24 h。反应混合物十倍稀释后，使用Cary 60分光光度计（Agilent）和石英比色杯测定190–400 nm光谱。分光光度计用新鲜配制的含20 mg/L间苯三酚的MM甲醇混合液调零。为测定反应动力学，将MM甲醇与间苯三酚混合至20 mg/L浓度，置于分光光度计中，每小时测定一次吸收光谱。
【数据】间苯三酚浓度：200 mg/L（稳定性）、20 mg/L（动力学）；孵育：室温、24 h；检测波长范围：190–400 nm；测量频率：每小时一次
微量滴定板间苯三酚稳定性测定
为测定间苯三酚在溶液中的稳定性，将溶液与间苯三酚混合至200 mg/L浓度。每种混合物取200 µL加入96孔板（Sarstedt）孔中，在Tecan Infinite酶标仪中于300 nm处每10 min测定一次吸光度，持续24 h。以不含痕量金属、添加200 mg/L间苯三酚的MM甲醇作为对照基线。每种混合物设三份重复，所得曲线线性部分的斜率作为反应速度的度量。
【数据】间苯三酚浓度：200 mg/L；上样量：200 µL/孔；检测波长：300 nm；测量间隔：每10 min；持续时间：24 h；重复数：3
微量滴定板生长测定
M. extorquens AM1的生长按前述方法测定。每种条件设三份重复生长，在Tecan Infinite酶标仪上每10 min测定一次OD₆₀₀。生长速率和最大OD₆₀₀使用R Studio计算，生长曲线使用GraphPad Prism 10软件可视化。
【数据】测量间隔：每10 min；重复数：3；分析软件：R Studio、GraphPad Prism 10
间苯三酚转化产物的LC-MS分析
100 mL锥形瓶装入30 mL含0 mg/L或200 mg/L间苯三酚的极限培养基甲醇。混合物于30°C、180 rpm振荡孵育。立即取样及随后每2 h定期取1 mL样品，保存于−20°C。次日冻干样品。所得固体用50%甲醇（v/v）重新溶解，涡旋，13,000 rpm离心10 min（4°C）。上清液转移至1 mL玻璃小瓶。LC-MS分析前，上清液用50%甲醇（v/v）十倍稀释至新的LC-MS小瓶。LC-MS分析使用Shimadzu Nexera X2 UHPLC系统耦合Shimadzu 9030 QTOF质谱仪，配备标准ESI源。LC柱为Waters Acquity HSS C18柱（1.8 µm）。
【数据】培养体积：30 mL；间苯三酚浓度：0或200 mg/L；温度：30°C；转速：180 rpm；取样：每2 h、1 mL；离心：13,000 rpm、10 min、4°C；稀释：10倍；仪器：Shimadzu Nexera X2 UHPLC + Shimadzu 9030 QTOF；色谱柱：Waters Acquity HSS C18（1.8 µm）
研究结果
在M. extorquens中表达phlD实现间苯三酚生产
通过在此前建立的Methylobrick系统中过表达phlD基因，建立了甲醇到间苯三酚的生物转化。为此，将phlD克隆入载体pTE103（受弱组成型启动子P_fumC控制）和pTE104（受中等强度组成型启动子P_coxB控制）（图1c）。所得菌株在含甲醇为唯一碳源的MM中培养，监测OD₆₀₀和间苯三酚产量168 h（图1d-i）。
在摇瓶分批培养中，M. extorquens pTE104::phlD产生的间苯三酚高于M. extorquens pTE103::phlD（图1f、1h）。两株菌均在48 h达到最大间苯三酚滴度，M. extorquens pTE103::phlD产生32.5 ± 13.9 mg/L，M. extorquens pTE104::phlD产生76.4 ± 7.4 mg/L。M. extorquens pTE104::phlD的最大滴度因此比M. extorquens pTE103::phlD在分批培养条件下高出2.4倍（图1j）。
在补料分批摇瓶培养中（48 h时补充123 mM甲醇），M. extorquens pTE103::phlD在72 h达到最大间苯三酚滴度44.1 ± 6.0 mg/L（图1g），而M. extorquens pTE104::phlD在96 h达到更高的最大滴度108.8 ± 20.2 mg/L（图1i）。M. extorquens pTE104::phlD的最大滴度在补料分批条件下比M. extorquens pTE103::phlD高出2.5倍（图1j）。
在M. extorquens pTE103::phlD和M. extorquens pTE104::phlD的分批培养过程中，间苯三酚滴度在达到最大值后下降。此外，我们观察到培养基出现着色（图1k）。这种间苯三酚滴度的下降可能表明M. extorquens酶促降解间苯三酚，或者间苯三酚在培养基中因降解或转化反应而不稳定，这值得进一步研究。
作为下一步，我们旨在确定能否通过允许更多碳通量进入间苯三酚生物合成途径的M. extorquens突变菌株实现更高的间苯三酚滴度。
【数据】分批培养最大滴度：pTE103::phlD为32.5 ± 13.9 mg/L（48 h）、pTE104::phlD为76.4 ± 7.4 mg/L（48 h）；倍数差异：2.4倍；补料分批最大滴度：pTE103::phlD为44.1 ± 6.0 mg/L（72 h）、pTE104::phlD为108.8 ± 20.2 mg/L（96 h）；倍数差异：2.5倍；监测时间：168 h；甲醇补充：123 mM（48 h）
phlD高表达导致表达质粒不稳定
为优化M. extorquens作为间苯三酚生产的底盘，我们构建了一株无法以聚羟基丁酸酯（PHB）形式储存碳的菌株。我们假设，由于乙酰-CoA是PHB和间苯三酚生产的前体，在无法产生PHB的菌株中将有更多碳可用于间苯三酚生产。因此，我们使用pREDSIX系统从M. extorquens基因组中删除了编码PHB合酶的基因（phaC），得到M. extorquens AM1 ΔphaC（以下简称ΔphaC）。为验证PHB生产是否确实被消除，将M. extorquens WT和ΔphaC菌株接种于含10 mg/L Nile Red的MM平板上（补充图2a）。
随后，将质粒pTE103::phlD、pTE104::phlD和pTE105::phlD（图1c）导入突变菌株。加入最后一个质粒是因为它包含P_tuf启动子，该启动子比P_fumC和P_coxB启动子更强。由于我们在补料分批实验中观察到M. extorquens pTE104::phlD的高间苯三酚产量，我们假设带有更强启动子的质粒可能进一步提高间苯三酚产量。
将质粒导入M. extorquens ΔphaC后，每种质粒的10–24个转化子在含甲醇的液体极限培养基中培养。培养96 h后，测定OD₆₀₀和间苯三酚浓度（图2a）。结果显示转化子之间在间苯三酚产量方面存在高度变异性。携带pTE104::phlD或pTE105::phlD（分别在较强启动子P_coxB和P_tuf控制下表达phlD）的ΔphaC转化子表现出更多变异。相比之下，携带pTE103::phlD（从较弱P_fumC启动子表达phlD）的转化子变异较小。然而，ΔphaC pTE103::phlD的最大间苯三酚滴度低于ΔphaC pTE104::phlD和ΔphaC pTE105::phlD。
显示最高间苯三酚滴度的菌株随后用于生产实验，以研究ΔphaC菌株随时间变化的间苯三酚产量。选取ΔphaC pTE103::phlD、ΔphaC pTE104::phlD和ΔphaC pTE105::phlD的三个转化子进行补料分批摇瓶培养，在48 h后补充甲醇，因为先前实验表明这能成功提高间苯三酚滴度。在120 h生产实验中，测定间苯三酚浓度和OD₆₀₀。各菌株的最大间苯三酚浓度分别显示（图2b）。
ΔphaC pTE103::phlD的生产曲线显示所有转化子的间苯三酚滴度相当。ΔphaC pTE104::phlD显示低间苯三酚滴度，一个转化子甚至完全丧失生产。ΔphaC pTE105::phlD也有类似观察，但两个转化子的间苯三酚滴度与ΔphaC pTE103::phlD相近。
携带较强启动子质粒的ΔphaC菌株低产或停产，令人怀疑在筛选过程或生产实验前的预培养中，质粒上可能积累了突变。为确定表达质粒是否确实发生突变，从ΔphaC菌株中分离所有三种质粒，随后通过限制性酶切和Sanger测序分析。如补充图2b和补充表3所示，从ΔphaC pTE103::phlD提取的质粒没有突变，而从ΔphaC pTE104::phlD和ΔphaC pTE105::phlD提取的质粒在phlD编码序列中存在多种突变。这证实了在ΔphaC背景下，当使用较强启动子时，phlD表达无法稳定维持。
为比较M. extorquens AM1与ΔphaC菌株的间苯三酚产量，将分别携带pTE103::phlD或空载体pTE103的两株菌在补料分批条件下培养（补充图1c）。72 h后，M. extorquens pTE103::phlD达到42.0 ± 9.7 mg/L的间苯三酚滴度，而ΔphaC pTE103::phlD菌株产生38.1 ± 12.8 mg/L。滴度的统计比较显示两菌株间间苯三酚产量无显著差异（图2c）。
【数据】转化子数：10–24个/质粒；培养时间：96 h（筛选）、120 h（生产实验）；最大滴度：M. extorquens pTE103::phlD为42.0 ± 9.7 mg/L（72 h）、ΔphaC pTE103::phlD为38.1 ± 12.8 mg/L（72 h）；统计结果：无显著差异；突变分析：pTE103::phlD无突变、pTE104::phlD和pTE105::phlD在phlD编码序列有突变
间苯三酚在培养基中不稳定并抑制M. extorquens生长
为进一步研究spent培养基的着色现象，将新鲜培养基补充不同浓度的间苯三酚，并保持无菌或接种M. extorquens。令人惊讶的是，在补充200 mg/L间苯三酚的培养基中出现了强烈着色，即使在没有细菌的情况下也是如此。此外，间苯三酚浓度大幅下降（图3a）。这表明培养基的着色可能与间苯三酚的不稳定性有关。
将M. extorquens在不含间苯三酚的MM中的生长（图3b）与在补充100 mg/L（图3c）或200 mg/L（图3d）间苯三酚的MM中的生长进行比较，我们观察到随着间苯三酚浓度的增加，生长下降。有趣的是，比较有菌和无菌条件下间苯三酚浓度的下降，细菌似乎对间苯三酚有稳定作用。
为研究间苯三酚可能的转化反应，测定了补充间苯三酚的培养基在24 h内的吸收光谱（图3e）。我们观察到光谱发生变化，表明间苯三酚发生了化学转化。
【数据】间苯三酚浓度：100 mg/L、200 mg/L；观察时间：24 h；现象：无菌条件下200 mg/L间苯三酚仍发生着色与浓度下降；生长抑制：随间苯三酚浓度升高而加剧
不同培养基组分提高间苯三酚稳定性
鉴于间苯三酚在培养基中不稳定，我们系统考察了不同培养基组分对间苯三酚稳定性的影响。通过对比不同培养基配方中间苯三酚在0 h至24 h的下降程度（图4a），以及A₂₇₀吸光度的上升（图4b），确定了影响间苯三酚稳定性的关键因素。
实验结果表明，培养基组成对间苯三酚的稳定性有显著影响。某些培养基组分能够减少间苯三酚的降解，而另一些则促进其转化。
【数据】时间范围：0–24 h；检测指标：间苯三酚浓度下降、A₂₇₀上升；初始间苯三酚浓度：原文未详述（图注提及200 mg/L）
补料分批生产：中性pH与酸性pH条件下的间苯三酚生产
在确定了培养基组分对间苯三酚稳定性的影响后，我们在补料分批条件下考察了M. extorquens pTE103、pTE103::phlD和ΔphaC pTE103::phlD在中性和酸性pH条件下的间苯三酚生产。测定了OD₆₀₀、pH和间苯三酚滴度（图5）。
【数据】菌株：M. extorquens pTE103、pTE103::phlD、ΔphaC pTE103::phlD；每菌株培养数：3；检测指标：OD₆₀₀、pH、间苯三酚滴度
不同培养基组分对间苯三酚转化反应的影响
为进一步解析各培养基组分对间苯三酚转化反应的贡献，我们测定了补充200 mg/L间苯三酚的不同培养基配方的转化反应斜率（图6a），以及各单独组分的转化反应斜率（图6b）。
【数据】间苯三酚浓度：200 mg/L；检测指标：转化反应斜率
锰和铁对间苯三酚转化反应及M. extorquens生长的影响
通过系列稀释获得不同锰和铁浓度（图7a），考察了铁浓度对间苯三酚转化和M. extorquens生长的影响（图7b），以及锰浓度的影响（图7c）。
【数据】金属离子：锰（Mn²⁺）、铁（Fe²⁺）；方法：系列稀释；检测指标：间苯三酚转化速率、M. extorquens生长
不同锰浓度MM中间苯三酚的生产与稳定性
基于锰对间苯三酚转化的显著影响，我们考察了不同锰浓度培养基中间苯三酚的生产情况。虚线代表OD₆₀₀，实线代表M. extorquens pTE103（黑色）和M. extorquens pTE103::phlD（其他颜色）的间苯三酚浓度（图8）。
降低培养基中锰浓度后，间苯三酚产量提升了1.7倍。
【数据】产量提升：1.7倍；检测指标：OD₆₀₀、间苯三酚浓度
讨论与解读
本研究证实了在M. extorquens中表达phlD能够以甲醇为唯一碳源和能源生产间苯三酚。间苯三酚在MM中不稳定，并抑制M. extorquens的生长。在ΔphaC背景下，当phlD受强启动子控制时，表达质粒变得不稳定，间苯三酚生产被消除。间苯三酚的稳定性可通过调节培养基中的pH和锰（Mn²⁺）与铁（Fe²⁺）浓度来提高。锰对间苯三酚转化的贡献大于铁。锰几乎可以从培养基中去除，同时仍能维持M. extorquens的生长。对于间苯三酚生产，最佳锰浓度比标准MM低百倍以上。该较低锰浓度使间苯三酚产量提高1.7倍。
间苯三酚的不稳定性对生物生产极为不利，因为它降低了可达到的最大产量。此外，转化反应的产物可能对细胞产生不良影响。间苯三酚的毒性限制了可获得的最大滴度，因为细胞的生理适应性下降。在200 mg/L间苯三酚浓度下观察到M. extorquens生长的强烈抑制。
编译者解读
本研究展示了合成生物学中"底盘工程+培养基优化"双轮驱动的典型策略。作者巧妙发现产物不稳定性这一常被忽视的问题，并通过系统排查锁定锰离子为关键降解因素——这种从"现象异常"到"机制归因"的研究路径值得借鉴。值得肯定的是，通过在标准MM基础上将锰浓度降低百倍以上实现1.7倍产量提升，体现了培养基工程在 phenolic 类化合物生物生产中的杠杆效应。局限在于，ΔphaC背景下强启动子质粒的不稳定性机制尚未完全解析——若能结合质粒拷贝数动态监测或基因组整合策略，或可进一步释放高产潜力。该工作为甲醇基生物合成芳香族聚酮化合物提供了范例，也提醒研究者：产物的化学稳定性往往与代谢通量同等重要。
DOI: 10.1016/j.nbt.2026.05.005