高光谱受激拉曼散射显微技术揭示瓦伦烯生物

📅 2026-08-28 📰 Cell Reports Physical Science 2026-05-20 📂 研究进展 👁 16

来源：Single-cell metabolic heterogeneity dynamics and optimization of valencene biosynthesis by hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy（Cell Reports Physical Science）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

📎 相关工具：代谢通路设计

导读

合成生物学中，微生物群体的代谢异质性常被群体平均测量掩盖，制约产量优化。本研究构建了产瓦伦烯的解脂耶氏酵母（Y. lipolytica），并将无标记、非侵入的高光谱受激拉曼散射（SRS）显微镜与Lasso解混算法结合，在单细胞水平定量瓦伦烯合成，揭示了产量上此前难以分辨的代谢异质性。通过底物共投喂和碳氮比优化，最终将瓦伦烯产量提升至125 mg/L。

研究背景

瓦伦烯是一种高价值倍半萜化合物，主要存在于柑橘类水果中，广泛用于香料和制药行业。当前萜类生产正从低效的植物提取转向高效微生物培养，利用酿酒酵母和解脂耶氏酵母等工程底盘生物。然而，微生物群体固有的代谢异质性使稳定可控的培养仍具挑战。个体细胞间酶表达和前体通量的差异常导致瓦伦烯产量出现显著克隆变异。气相色谱-质谱联用（GC-MS）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）等传统分析技术仅提供群体平均值，无法解析单细胞代谢动态或异质性。质谱成像（MSI）等单细胞分析手段虽能揭示单细胞水平的代谢物分布，但在实时监测和非破坏性分析方面存在明显局限。荧光成像（FL）技术则依赖外源荧光标记，可能引入细胞毒性效应，干扰细胞天然代谢和生理状态。

研究方法

试剂

BSA、TO、瓦伦烯和乙酸-d4购自阿拉丁（中国上海）。用于制备YPD培养基的酵母提取物和蛋白胨购自Oxoid（中国北京），葡萄糖购自General Reagent（中国上海）。IPM购自Adamas-beta（Titan Scientific，中国上海）。正十二烷-d26购自MedChemExpress（中国上海）。4%多聚甲醛和poly-L-赖氨酸购自Boster Biological Technology（中国武汉）。

菌株构建

构建含有部分rDNA（26s rDNA）序列的载体，以实现瓦伦烯生物合成相关基因的稳定多拷贝表达。使用2× Phanta Max Master Mix（Dye Plus，Vazyme，中国南京）通过聚合酶链式反应（PCR）从解脂耶氏酵母PO1f（ATCC MYA-2613）菌株基因组中扩增编码异戊烯基二磷酸异构酶和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的天然基因（IDI和HMGc）。来自阿拉斯加扁柏（Callitropsis nootkatensis）的密码子优化CnVS基因（编码瓦伦烯合酶）由Genewiz（中国苏州）合成。通过将对应过氧化物酶体靶向信号肽（PTS1）的SKL编码序列引入CnVS序列终止密码子上游，构建CnVS-SKL融合片段。通过将HMGc、IDI和CnVS-SKL表达盒依次组装到含有部分26s rDNA序列的载体中，构建重组质粒26s rDNA-HMGc-IDI-CnVS-SKL，以实现多拷贝基因组整合。从大肠杆菌阳性克隆中提取的质粒经DNA测序验证，由北京擎科生物科技完成。线性化质粒DNA通过限制性内切酶酶切产生，随后转化入解脂耶氏酵母PO1f以构建产瓦伦烯菌株。酵母感受态细胞制备和转化使用Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit（Zymo Research，美国尔湾），按制造商说明书操作。EGC15菌株通过将质粒pUTinX-ERG20-GGGS-CnVS的线性化DNA导入解脂耶氏酵母PO1f获得。融合基因盒通过将编码法尼基二磷酸合酶的解脂耶氏酵母ERG20基因经GGGS柔性连接肽与CnVS连接构建，随后连接至实验室开发的表达载体pUTinX，由组成型启动子P TEF1N控制。所得质粒pUTinX-ERG20-GGGS-CnVS线性化后，DNA转化入解脂耶氏酵母PO1f。

【数据】菌株：解脂耶氏酵母PO1f（ATCC MYA-2613）；载体：26s rDNA-HMGc-IDI-CnVS-SKL、pUTinX-ERG20-GGGS-CnVS；引物/基因：IDI、HMGc、CnVS（密码子优化）、ERG20；信号肽：SKL（PTS1）；试剂盒：Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit；测序验证：北京擎科生物

SRS成像装置

SRS成像使用双输出飞秒激光器（InSight X3，Spectra-Physics，美国纽波特），激光重复频率为80 MHz。输出分别作为泵浦光（可调谐：680–1,300 nm，120 fs）和斯托克斯光（固定：1,045 nm，200 fs）。斯托克斯光束经声光调制器（AOM；1205-C，Isomet）在2.8 MHz下调制。采用四根玻璃棒（SF-57，每根长15 cm）对飞秒脉冲进行啁啾。两束激光合并耦合，实现时间和空间同步后送入显微镜。使用水浸物镜（60×，1.2数值孔径，Olympus）将激光束聚焦到样品上，油浸聚光镜（1.4数值孔径，Olympus）用于收集信号。短通滤波器（1,000 nm短通，Thorlabs，美国）用于阻挡斯托克斯光束。最后，泵浦信号由光电二极管（S3994-01，Hamamatsu Photonics）检测，并经锁相放大器（HF2LI，Zurich Instruments）提取。在高光谱SRS成像中，施加到样品的功率约为泵浦光8 mW、斯托克斯光48 mW。图像尺寸为200 × 200像素，像素驻留时间为10 μs。

【数据】激光重复频率：80 MHz；泵浦光：680–1,300 nm，120 fs；斯托克斯光：1,045 nm，200 fs；调制频率：2.8 MHz；物镜：60×/1.2 NA（水浸）；聚光镜：1.4 NA（油浸）；样品功率：泵浦8 mW、斯托克斯48 mW；图像尺寸：200×200像素；像素驻留时间：10 μs

样品制备

样品制备主要包括菌株培养和样品玻片制备。YPD液体培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨和20 g/L葡萄糖）用于常规培养酵母种子，添加琼脂的YPD培养基用于固体平板培养。扩培24 h后，将200 μL在2% YPD培养基中生长的种子培养物转移到5% YPD培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨和50 g/L葡萄糖）中进行产物形成。培养期间，收集2 mL酵母细胞并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。弃去上清液，酵母细胞用4%多聚甲醛溶液固定。离心后收集酵母细胞沉淀并重悬于PBS缓冲液中。将约3 μL样品溶液置于poly-L-赖氨酸包被的玻璃载玻片（Boster，中国湖北）上，盖上另一张载玻片，用双面胶固定。

【数据】培养基：YPD（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）；种子培养：2% YPD、24 h；产物流加：5% YPD（50 g/L葡萄糖）；取样量：2 mL；固定液：4%多聚甲醛；样品量：约3 μL

培养筛选

转化细胞涂布于酵母氮源基础（YNB）培养基上，该培养基含有除亮氨酸和尿嘧啶外的必需氨基酸，用于筛选。YNB培养基通过添加0.67% YNB粉末、2%葡萄糖、2%琼脂和50 mg/mL亮氨酸或尿嘧啶配制。平板在30°C培养72 h以形成菌落。单菌落形成后，随机挑取15个菌落接种到YPD培养基中进行后续培养。为增强产物积累，YPD培养基中葡萄糖含量提高至50 g/L（5% YPD）。摇床转速和温度分别设为200 rpm和28°C（ZQLY-380，上海知楚仪器）。

【数据】筛选培养基：YNB（0.67% YNB粉末、2%葡萄糖、2%琼脂、50 mg/mL亮氨酸或尿嘧啶）；培养温度：30°C；时间：72 h；菌落数：15个；产物流加：5% YPD（50 g/L葡萄糖）；摇床：200 rpm、28°C

葡萄糖与乙酸共投喂培养

在不同葡萄糖与乙酸比例培养中，总碳源浓度固定为50 g/L，其他底物浓度保持不变（蛋白胨20 g/L、酵母提取物10 g/L）。设置不同质量比（4:1、2.5:2.5和1:4，以纯乙酸和纯葡萄糖作为对照组），以确定瓦伦烯生产的最佳条件。初始pH设为5.5以最小化实验组间差异。

【数据】总碳源：50 g/L；蛋白胨：20 g/L；酵母提取物：10 g/L；葡萄糖:乙酸比例：4:1、2.5:2.5、1:4；初始pH：5.5

不同C/N比培养

在不同C/N比培养中，通过改变葡萄糖、酵母提取物和蛋白胨的浓度来调整碳源和氮源比例。培养体系中，葡萄糖和酵母提取物作为主要碳源，各占总质量的40%；蛋白胨和酵母提取物是主要氮源，蛋白胨占总质量的13%，酵母提取物占10%。不同比例下碳氮总含量保持恒定。具体各组配置如下：纯碳组（70 g/L葡萄糖）、纯氮组（7.7 g/L蛋白胨）、C/N比为2组（40 g/L葡萄糖、22.5 g/L酵母提取物和77 g/L蛋白胨）、C/N比为4组（50 g/L葡萄糖、25 g/L酵母提取物和40 g/L蛋白胨）、C/N比为6组（50 g/L葡萄糖、30 g/L酵母提取物和20 g/L蛋白胨）、C/N比为8组（50 g/L葡萄糖、32.5 g/L酵母提取物和9 g/L蛋白胨）、C/N比为10组（70 g/L葡萄糖、15 g/L酵母提取物和5 g/L蛋白胨）。初始pH设为5.5以最小化组间差异。

【数据】C/N比配置：纯碳（70 g/L葡萄糖）、纯氮（7.7 g/L蛋白胨）、C/N=2（40 g/L葡萄糖+22.5 g/L酵母提取物+77 g/L蛋白胨）、C/N=4（50 g/L葡萄糖+25 g/L酵母提取物+40 g/L蛋白胨）、C/N=6（50 g/L葡萄糖+30 g/L酵母提取物+20 g/L蛋白胨）、C/N=8（50 g/L葡萄糖+32.5 g/L酵母提取物+9 g/L蛋白胨）、C/N=10（70 g/L葡萄糖+15 g/L酵母提取物+5 g/L蛋白胨）；初始pH：5.5

摇瓶补料

菌株培养使用5% YPD培养基。在48 h和96 h时，将培养液无菌转移至无菌离心管中。4,000 rpm离心10 min后，弃去上清液并更换为新鲜5% YPD培养基。随后立即恢复培养。对照组采用常规培养。

【数据】培养基：5% YPD；补料时间点：48 h、96 h；离心条件：4,000 rpm、10 min；对照组：常规培养

GC-MS分析

GC-MS检测作为定量瓦伦烯的金标准。收集1 mL培养样品用于瓦伦烯定量。将1 mL细胞培养物与500 μL IPM混合，用0.5 mm玻璃珠（BioSpec Products，美国巴特尔斯维尔）在组织研磨器（Tis）中裂解细胞。

【数据】样品量：1 mL；萃取剂：500 μL IPM；玻璃珠：0.5 mm

研究结果

产瓦伦烯工程菌株构建及单细胞瓦伦烯SRS成像

我们以解脂耶氏酵母作为瓦伦烯生产的微生物底盘（图1A）。在该系统中，葡萄糖作为主要碳源，可进一步通过线粒体三羧酸（TCA）循环分解代谢。然而，在产油酵母解脂耶氏酵母中，胞质乙酰辅酶A——脂质和萜类生物合成的通用前体——主要由于途径区室化而通过柠檬酸产生。同时，过氧化物酶体是解脂耶氏酵母中天然存在的细胞器，具有相对独立的代谢环境。为将瓦伦烯合成定位到过氧化物酶体，我们选择了共识过氧化物酶体靶向序列1（PTS1）信号肽（C端三肽序列，如SKL），通过基因融合将其添加到阿拉斯加扁柏瓦伦烯合酶（CnVS）的C端。由于过氧化物酶体的区室化效应，该设计可减少胞质代谢竞争并提高瓦伦烯合成效率。为实现瓦伦烯生物合成相关基因的稳定多拷贝表达，我们构建了含有核糖体DNA（26s rDNA）序列的载体（图1B）。此外，将降解信号肽（Deg-peptides；ACKNWFSSLSHFVIHL）融合至标记蛋白C端以确保高标记表达。随后，通过同源重组组装融合质粒（26s rDNA-HMGc-IDI-CnVS-SKL），线性化后通过随机基因组整合转化入解脂耶氏酵母。野生型和工程菌株YLT3培养物的GC-MS分析确认了瓦伦烯的成功生产和产量（图1C和S1）。

▲ Construction of valencene-producing Y. lipolytica and SRS imaging of valencene in single cells (A) Reconstruction of themevalonate (MVA) pathway in peroxisomes. (B) Construction of plasmid for valencene synthesis. Pleu, promoter of leu2; Leu, lue2 selection marker; HMGc, 3-hydroxy-3-methylglutaryl-C

为观察产量和空间分布，我们采用高光谱SRS检测瓦伦烯（图1D）。通过将泵浦波长调至801 nm，我们在2,750至3,075 cm⁻¹范围内采集了瓦伦烯、三油酸甘油酯（TO，脂质代表）和牛血清白蛋白（BSA，蛋白质代表）的SRS光谱（图1E）。结果表明，瓦伦烯具有与脂质和蛋白质不同的SRS光谱，中心峰约在2,917 cm⁻¹，另有三个峰分别在约2,878、2,850和2,971 cm⁻¹处。这些结果经自发拉曼光谱验证，其拉曼峰与高光谱SRS光谱一致（图S2）。为评估瓦伦烯的检测限，我们采集了不同浓度瓦伦烯的高光谱SRS图像和光谱（图1F和S3）。值得注意的是，使用氘代十二烷（dodecane-d26）作为溶剂稀释瓦伦烯，以避免普通十二烷在C-H区域的信号干扰。信噪比（SNR）与浓度呈良好线性关系（R² = 0.999）。基于这些结果，高光谱SRS检测瓦伦烯的检测限约为0.1%（约700 mg/L）。为从高光谱数据中获取不同产物的化学含量，我们采用了将Lasso解混算法与Cellpose分割相结合的分析方法（图S4）。在C-H振动区域，观察到蛋白质、脂质和瓦伦烯的强信号（图1H）。有趣的是，结果表明瓦伦烯以聚集体形式存在，定位于脂质区域附近或与之重叠，如沿虚线的单细胞信号分布所示（图1I）。这表明瓦伦烯倾向于靠近或混合脂质，可能归因于萜类的疏水性质。这些观察结果通过表达过氧化物酶体绿色荧光蛋白的样品同步SRS和双光子荧光（TPF）图像得到证实（图S5），也展示了瓦伦烯与脂质的共定位。

【数据】泵浦波长：801 nm；光谱范围：2,750–3,075 cm⁻¹；瓦伦烯特征峰：2,917、2,878、2,850、2,971 cm⁻¹；检测限：约0.1%（约700 mg/L）；线性关系：R² = 0.999；溶剂：dodecane-d26

瓦伦烯的定量与异质性分析

为在单细胞水平定量胞内瓦伦烯，我们将高光谱SRS成像应用于不同菌株。用CnVS表达载体转化解脂耶氏酵母PO1f后，从15个单克隆转化子中选取两个菌株进行测试：YLT3（现有产量最高）和YLT9（随机选取）。此外，还测试了由解脂耶氏酵母构建的含pUTinX-ERG20-GGGS-CnVS质粒的EGC15菌株（图S6）。经高光谱SRS成像和Lasso分析，我们获得了瓦伦烯的化学含量图（图2A）。YLT9、YLT3和EGC15中均可检测到瓦伦烯信号。相比之下，野生型中未检测到瓦伦烯。单细胞SRS信号分析显示细胞群体中存在显著异质性，反映了单细胞水平的瓦伦烯差异分布。平均而言，YLT3的信号高于YLT9，而EGC15的信号因使用不同质粒进一步增强（图2B）。为确认这些结果，我们用GC-MS测量了群体瓦伦烯水平，结果显示野生型、YLT9、YLT3和EGC15的瓦伦烯产量分别为0、9.9、20.5和45.6 mg/L（图2C）。值得注意的是，瓦伦烯的SRS信号随产物浓度增加而增强，瓦伦烯SRS信号与GC-MS检测的瓦伦烯含量之间存在线性关系（R² = 0.980）（图2D）。这些结果表明，SRS可用于定量瓦伦烯水平并在单细胞水平预测其代谢模式，这是GC-MS无法实现的。基于SRS结果进一步分析了单细胞间的异质性（图S7）。结果表明，野生型细胞不产生瓦伦烯。YLT9的信号强度主要在0–0.1之间，占94%。YLT3具有较高的瓦伦烯产量：54%在0–0.1范围内，46%在≥0.1强度范围内。这些结果清楚地证明了细胞间的异质性。由于这种异质性，高产菌株中高产量细胞比例更高，但也存在低产量细胞。

▲ Quantitative and heterogeneity analysis of valencene using SRS imaging (A) SRS images at the C-H region and the Lasso reconstructed concentration maps of valencene for the wild-type, YLT9, YLT3, and EGC15 strains (scale bar: 10 μm). (B) Scatterplot of the SRS valencene intensity in the wild-type, YL

【数据】菌株产量（GC-MS）：野生型0 mg/L、YLT9为9.9 mg/L、YLT3为20.5 mg/L、EGC15为45.6 mg/L；SRS信号与GC-MS线性关系：R² = 0.980；YLT9信号分布：0–0.1占94%；YLT3信号分布：0–0.1占54%、≥0.1占46%

SRS成像揭示瓦伦烯时间序列代谢

为探索瓦伦烯的代谢过程，我们监测了摇瓶中的实时培养（图3A）。基于所得结果，我们开发了一套从细胞培养到数据分析的整合工作流程方案。解脂耶氏酵母菌株首先从冷冻管中解冻，在2%酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）固体平板培养基上生长至菌落形成。然后挑取单菌落转移至5% YPD摇瓶中扩培。随后，在不同时间点从摇瓶中收集2 mL细胞培养物，用于600 nm光密度（OD600）和葡萄糖含量测定以及SRS成像。离心并沉积到盖玻片上后，用SRS对细胞成像以观察胞内瓦伦烯。接下来，野生型和YLT-3菌株均按该工作流程进行测试。不产生瓦伦烯的野生型作为对照（图S8和S9）。我们首先采集了不同时间点的原始SRS光谱，并使用Lasso算法对高光谱数据进行解卷积（图3B和S10）。然后对单细胞信号进行定量（图3C）。瓦伦烯信号最初处于低水平，随时间推移而增加，在96 h达到峰值，随后下降，很可能归因于瓦伦烯被消耗以产生下游产物。这些结果经GC-MS证实，其显示瓦伦烯产量呈相似趋势：96 h产量为35 mg/L，在120 h和144 h分别降至27和15 mg/L（图3D）。采用皮尔逊相关系数评估SRS的准确性。进行了皮尔逊分析。

▲ 利用SRS成像对单细胞中朱栾倍半萜进行纵向定量，并与GC-MS比较。（A）菌株培养与SRS成像的工作流程。（B）不同时间点朱栾倍半萜的SRS图像及Lasso重建浓度图（比例尺，10 μm）。（C）SRS朱栾倍半萜的统计结果。

【数据】峰值时间：96 h；GC-MS产量：96 h为35 mg/L、120 h为27 mg/L、144 h为15 mg/L；分析方法：皮尔逊相关系数

葡萄糖与乙酸底物竞争研究

（原文该部分内容未在节选范围内完整呈现，以下为方法部分对应结果的忠实翻译）

▲ Substrate competition study between acetic acid and glucose for valencene synthesis using hyperspectral SRS imaging (A) Schematic diagram of the product metabolism flux under co-culture conditions with glucose and acetic acid-d4. (B) Normalized SRS spectra of deuterated protein, lipid, and valencene

【数据】总碳源：50 g/L；葡萄糖:乙酸比例：4:1、2.5:2.5、1:4；初始pH：5.5

不同C/N比下的瓦伦烯产量

▲ 不同C/N比条件下的缬草烯生产。(A) 不同C/N比的示意图（数据以平均值 ± SEM表示，n = 3）。(B) 上清液中葡萄糖浓度的监测（数据以平均值 ± SEM表示，n = 3）。(C) 不同C/N比下的细胞生长（数据以平均值 ± SEM表示，n = 3）。

摇瓶补料分批培养的实时监测

▲ Real-time monitoring of fed-batch metabolism in shake flasks using hyperspectral SRS imaging (A) Schematic of fed-batch shake-flask cultivation. (B) Raw SRS images and the Lasso concentration maps of valencene for non-fed-batch groups (scale bar, 10 μm). (C) SRS valencene intensity and statistical d

【数据】培养基：5% YPD；补料时间点：48 h、96 h；离心条件：4,000 rpm、10 min；对照组：常规培养

Single-cell metabolic heterogeneity dynamics and optimizatio — ▲ 论文配图

讨论与解读

本研究将高光谱SRS显微技术与Lasso解混算法相结合，实现了产瓦伦烯解脂耶氏酵母单细胞水平的无标记、非侵入式定量成像。该方法突破了GC-MS等群体平均测量无法分辨单细胞代谢异质性的局限，也克服了MSI和荧光成像在实时监测和非破坏性分析方面的不足。通过过氧化物酶体区室化设计和26s rDNA多拷贝整合，研究构建了高效产瓦伦烯菌株。底物共投喂实验揭示了细胞优先利用乙酸而非葡萄糖合成瓦伦烯的代谢偏好。通过C/N比优化和补料分批培养，最终将瓦伦烯产量提升至125 mg/L。该工作为合成生物学中微生物代谢的原位可视化提供了强有力工具。

编译者解读

这项研究的核心价值在于把物理光学工具嵌入合成生物学闭环——用SRS的化学选择性成像"看见"单细胞里瓦伦烯的时空分布，这是传统色谱和质谱给不出的维度。过氧化物酶体靶向策略也值得关注：把亲脂性萜类合成"关进"天然疏水细胞器，既减少胞质竞争又顺应产物特性。局限在于SRS设备门槛高、通量有限，且0.1%的检测限对痕量中间产物仍不够敏感。未来若能与其他单细胞组学联用，或可进一步揭示代谢异质性的调控开关。

参考来源

Shi Y. Single-cell metabolic heterogeneity dynamics and optimization of valencene biosynthesis by hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Cell Reports Physical Science, 2026. DOI: 10.1016/j.xcrp.2026.103256

DOI: 10.1016/j.xcrp.2026.103256

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