来源：Coordinated optimization of 3′-phosphoadenosine-5′-phosphosulfate (PAPS) supply and sulfotransferase expression in Escherichia coli for production of chondroitin sulfate A with high sulfation degree（Carbohydrate Polymers）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
软骨素硫酸酯A（CS-A）是一种具有广泛生物医学应用的硫酸化糖胺聚糖，其硫酸化效率低下长期制约着可持续生产。本研究以无质粒软骨素生产菌株GZ17为底盘，通过系统强化天然PAPS合成途径、引入人工PAPS再生途径、空间组装限速酶及多拷贝整合磺基转移酶等策略，最终工程菌株GZ32在5 L补料分批生物反应器中以甘油为碳源实现8.56 g/L CS-A的从头生产，硫酸化程度达90%，为目前微生物生产CS-A的最高报道水平。
研究背景
糖胺聚糖（GAGs）是一类在生物合成过程中共价连接至核心蛋白的酸性多糖，在细胞生长、分化及神经退行性疾病等多种生理和病理过程中发挥重要作用。由于多样的生物活性和优异的生物相容性，GAGs在化妆品、营养保健品和药物制剂领域受到日益广泛的关注。软骨素硫酸酯（CS）是人体内含量最丰富的GAGs之一，主要分布于软骨组织。结构上，CS的非硫酸化骨架由β-D-葡萄糖醛酸（GlcUA）和N-乙酰-β-D-半乳糖胺（GalNAc）的重复二糖单元组成，其中n≈20–250。骨架可被磺基转移酶选择性修饰，产生A单元（4-O-硫酸化）、C单元（6-O-硫酸化）和E单元（4,6-O-二硫酸化）等不同硫酸化基序，形成CS-A、CS-C和CS-E等结构多样的变体。硫酸化模式是决定CS生物活性的关键因素，CS-A已被报道可促进软骨修复并具有抗炎活性。然而，其可持续和可控生产仍因硫酸化效率低下而面临挑战。
研究方法
2.1 菌株、培养基与试剂
用于基因克隆和质粒扩增的大肠杆菌DH5α在添加100 μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani（LB）培养基（10 g/L NaCl、10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物）中、37°C条件下培养。产软骨素（CH）菌株GZ17为本课题组前期工作构建（Zhao et al., 2023），用作构建CS-A生产菌株的底盘。构建的工程大肠杆菌菌株在LBGB培养基（10 g/L NaCl、10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、12 g/L甘油、1.5 g/L MgSO4·7H2O、10 g/L酪蛋白酸水解物）或TBA培养基（10 g/L NaCl、10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L甘油、1.5 g/L MgSO4·7H2O、10 g/L酪蛋白酸水解物、3.3 g/L (NH4)2SO4）中培养。必要时添加100 mg/L卡那霉素和/或30 mg/L链霉素。PrimeSTAR® Max DNA聚合酶购自TaKaRa（日本东京）。质粒小提和DNA纯化试剂盒购自TransGen Biotech（中国北京）。同源重组试剂盒和GreenTaq Mix购自Vazyme Biotech（中国南京）。软骨素硫酸钠标准品（98%纯度，Cat# 140792）和低分子量肝素（Cat# 140674）购自中国食品药品检定研究院（中国北京）。PAPS标准品（Cat# A1651）、软骨素二糖Δdi-0S钠盐（Cat# C3920）、软骨素酶ABC、99.99% D2O（Cat# 450510，含0.05 wt% 3-(三甲基硅基)丙酸-2,2,3,3-d4酸，钠盐）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。其余所有化学品购自Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.（中国上海）。
【数据】LB培养基：10 g/L NaCl、10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物；氨苄青霉素：100 μg/mL；温度：37°C；LBGB培养基：12 g/L甘油、1.5 g/L MgSO4·7H2O、10 g/L酪蛋白酸水解物；TBA培养基：5 g/L甘油、3.3 g/L (NH4)2SO4；卡那霉素：100 mg/L；链霉素：30 mg/L
2.2 菌株构建
采用前期描述的CRISPR/Cas9系统进行大肠杆菌基因删除和位点特异性整合（Jiang et al., 2015）。构建途径酶表达盒时，编码序列和相应同源臂分别通过PCR扩增，随后用同源重组试剂盒进行纯化和组装（Ye, Chen, Yang, Zeng, & Qiao, 2021）。所有内源基因（包括cysDN和cysC）均以大肠杆菌基因组DNA为模板进行PCR扩增。异源基因获取方式如下：编码工程化软骨素-4-O-磺基转移酶（CHST11）的基因——源自智人的突变变体（HsCHST11M12）——以先前构建的质粒pET22b-M12为模板PCR扩增（Liu et al., 2023）；编码芳基磺基转移酶（RnASTIV）和腺苷-5′-磷酸硫酸（APS）激酶（PcAPSK）的基因分别源自褐家鼠和产黄青霉，以先前构建的质粒pRSF-Duet-M1为模板PCR扩增；编码工程化腺嘌呤磺基转移酶（BtaAPSSTM2）和多聚磷酸盐激酶2（RsPPK）的基因分别源自牛和球形红杆菌，以pRSF-Duet-M2为模板扩增（Gu et al., 2025）。枯草芽孢杆菌的cysP基因经密码子优化后由Sangon Biotech（中国上海）合成。随后将表达盒与含相应sgRNA的pTarget质粒通过电转化共转化至表达Cas9的菌株中（Jiang et al., 2015）。用GreenTaq Mix进行菌落PCR验证后，阳性转化子在LB液体培养基中过夜培养，然后划线至无抗生素LB平板以消除sgRNA质粒。本研究所用全部质粒、引物序列和sgRNA序列分别列于表S1、S2和S3。所有构建菌株列于表1。
【数据】CRISPR/Cas9系统；电转化；菌落PCR验证；质粒消除：无抗生素LB平板过夜培养
2.3 摇瓶发酵
为比较工程大肠杆菌菌株的CS-A产量，摇瓶发酵实验设三次生物学重复。挑取工程菌株单菌落接种至30 mL LB培养基，37°C、220 rpm培养24 h。随后将约0.3 mL预培养物转移至含50 mL LBGB培养基的500 mL摇瓶中，37°C、220 rpm培养至OD600达到3.2。然后取0.3 mL种子培养物接种至50 mL FCS培养基（专门用于CS-A生产的发酵培养基），37°C、220 rpm发酵48 h。最后收集培养物用于CS-A定量。工程菌株的遗传稳定性通过接种前和发酵后的菌落PCR确认（如补充方法S1所述）。
【数据】预培养：30 mL LB，37°C，220 rpm，24 h；种子培养：50 mL LBGB，37°C，220 rpm，至OD600=3.2；发酵：50 mL FCS培养基，37°C，220 rpm，48 h；生物学重复：3次
2.4 生物反应器发酵
挑取菌株GZ32单菌落接种至30 mL LB培养基培养24 h，然后将0.3 mL预培养物（0.6%）转移至五个各含50 mL新鲜LBGB培养基的500 mL摇瓶中，37°C、220 rpm培养至OD600达到3.5。将所得种子培养物（250 mL，10%）转移至含2.25 L TBA培养基的5 L生物反应器（Intelli-Ferm A G3 5L Type, Parallel-Bioreactors, 中国上海）中。反应器发酵在37°C、400–1000 rpm条件下进行，空气流速为1–3 vvm以维持溶解氧（DO）在30%，自动添加氨水和20%稀硫酸维持pH在6.90–7.00。当反应器中甘油浓度降至1 g/L以下时，含800 g/L甘油和5 g/L MgSO4·7H2O的补料培养基连续补入罐中。定期从反应器取样测定OD600、甘油浓度、PAPS积累量和CS-A产量。反应器发酵设三次生物学重复，数据以平均值±标准差表示。
【数据】预培养：30 mL LB，24 h；种子培养：5×50 mL LBGB，37°C，220 rpm，至OD600=3.5；接种量：250 mL（10%）；反应器：5 L，2.25 L TBA培养基；温度：37°C；转速：400–1000 rpm；通气：1–3 vvm；DO：30%；pH：6.90–7.00；补料：800 g/L甘油+5 g/L MgSO4·7H2O；重复：3次
2.5 分析方法
OD600值用UVmini-1280分光光度计（Shimadzu Corporation，日本京都）监测，甘油浓度用M-100生物传感器分析仪（Sieman Technology Co., Ltd.，中国深圳）测定。PAPS定量使用配备YMC-Pack Polyamine II色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）（YMC Co., Ltd.，日本京都）和紫外检测器（254 nm）的高效液相色谱系统（HPLC）（Waters，美国马萨诸塞州米尔福德）。流动相为0.7 M KH2PO4，流速恒定0.6 mL/min，柱温全程维持在30°C。使用电喷雾电离-质谱联用（ESI-MS，Waters，美国马萨诸塞州米尔福德）对PAPS进行特异性结构鉴定（Gu et al., 2025）。发酵样品中胞外CS在4°C、10,000 ×g离心10 min后从上清液中回收。胞内CS通过重悬细胞沉淀、洗涤两次、超声破碎制备细胞裂解液并离心回收可溶性相获得。含胞内和胞外CS的溶液均用4倍体积乙醇沉淀至终浓度80%（v/v），并在−20°C放置12 h。4°C、10,000 ×g离心10 min去除乙醇后，沉淀用超纯水洗涤两次，冷冻干燥后重新溶解于超纯水中制备CS提取物，于−20°C保存待进一步分析。提取的CS用软骨素酶ABC解聚生成二糖异构体，随后根据《中国药典》（Chinese Pharmacopoeia Commission, 2020a）进行滴度和硫酸化程度测定。具体地，100 μL CS溶液加入800 μL消化缓冲液（50 mM Tris、60 mM乙酸钠，pH 8.0）和100 μL软骨素酶ABC（1 U/mL，溶于消化缓冲液），37°C孵育12 h进行解聚。随后反应混合物煮沸5 min灭活软骨素酶ABC，用冰水冷却至室温，4°C、10,000 ×g离心20 min。取上清液进行分析。
【数据】PAPS-HPLC：YMC-Pack Polyamine II柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），UV 254 nm，流动相0.7 M KH2PO4，流速0.6 mL/min，柱温30°C；CS回收：10,000 ×g，4°C，10 min；乙醇沉淀：80%（v/v），−20°C，12 h；解聚：100 μL CS + 800 μL缓冲液（50 mM Tris、60 mM乙酸钠，pH 8.0）+ 100 μL软骨素酶ABC（1 U/mL），37°C，12 h；灭活：煮沸5 min；离心：10,000 ×g，4°C，20 min
研究结果
3.1 以产CH大肠杆菌底盘构建CS-A生物合成途径
本课题组前期工作中，无质粒大肠杆菌菌株GZ17被构建用于高效生产CH，在5 L生物反应器中发酵72 h滴度达2.95 g/L（Zhao et al., 2023）。鉴于大肠杆菌内源拥有PAPS生物合成途径，最初假设引入特异性磺基转移酶C4ST即可实现CS-A生产。为此，将前期工程化的HsCHST11M12基因整合至产CH底盘菌株GZ17的ygaY基因组位点，获得菌株GZ21（图1A）。出乎意料的是，菌株GZ21的发酵液中检测不到CS-A。相反，该菌株积累了101 mg/L胞外CH和15 mg/L胞内CH，以及13 mg/L胞内PAPS，尽管HsCHST11M12已成功表达（图S1）。这些结果表明，仅引入HsCHST11M12不足以支持工程菌株中有效的CS-A生物合成。
为鉴定CS-A生物合成途径中的限制因素，在含有0.5 g/L Triton X-100的条件下，分别向菌株GZ21发酵液中单独添加CH、HsCHST11M12或PAPS，继续孵育20 h。值得注意的是，添加20 mM PAPS后，CS-A产量达126 mg/L，硫酸化率为89%（图1B、C、D、E）。相比之下，添加CH或HsCHST11M12仅产生痕量CS-A，硫酸化率分别为1%和4%（图1B和C）。这些观察表明，单独的CH骨架合成或C4ST表达均不足以驱动有效硫酸化。值得注意的是，外源补充PAPS立即恢复了CS-A生产且硫酸化程度高，明确确立了胞内PAPS可用性是该系统CS-A生物合成的主要瓶颈，而C4ST活性是次要限制因素。这一发现与此前关于工程微生物宿主中CS-A滴度与硫酸化效率之间存在持续权衡的报道一致（B. Lv et al., 2025）。
【数据】GZ21：胞外CH 101 mg/L，胞内CH 15 mg/L，胞内PAPS 13 mg/L；添加20 mM PAPS：CS-A 126 mg/L，硫酸化率89%；添加CH：硫酸化率1%；添加HsCHST11M12：硫酸化率4%；Triton X-100：0.5 g/L；孵育时间：20 h
3.2 工程化天然PAPS生物合成途径促进CS-A生物合成
大肠杆菌天然PAPS生物合成在高CH通量下不足以支持高效硫酸化，因此需要对硫代谢进行定向工程改造。在菌株GZ21中实施了一系列前期报道的代谢工程策略（图2A）。首先，通过过表达天然PAPS生物合成酶CysDN强化硫酸盐同化（Badri et al., 2021; Li et al., 2023），获得菌株GZ23。随后，通过异源表达来自枯草芽孢杆菌的硫酸盐转运蛋白BsCysP进一步增强硫酸盐摄取（Xiong et al., 2025），获得菌株GZ24。同时，筛选了不同硫酸盐以确定CS-A生物合成的最佳硫源，包括Na2SO4、K2SO4、CuSO4、FeSO4、Al2(SO4)3、MgSO4和(NH4)2SO4。与常用Na2SO4相比，补充CuSO4使CS-A硫酸化率增幅最大，而MgSO4主要提高CS-A滴度，这与它们分别作为HsCHST11M12和CH聚合酶KfoC辅因子的角色一致（Liu et al., 2023）。值得注意的是，补充(NH4)2SO4同时提高了CS-A滴度和硫酸化率（图2B和S2A）。考虑到Cu2+和Mg2+在高浓度下易形成抑制生长的复合物，以及下游纯化过程中去除难度增加，(NH4)2SO4被选为主要硫酸盐源，CuSO4以低浓度作为辅助组分添加。
随后在摇瓶发酵中优化了(NH4)2SO4浓度，范围20–260 mM。在测试条件下，补充20 mM (NH4)2SO4获得最高CS-A滴度和硫酸化率，分别达157 mg/L和17%（图2C和图S2B）。在微生物细胞中，PAPS主要通过PAPS还原酶（PAPSR）还原为SO3²⁻参与半胱氨酸（Cys）生物合成（Kawano, Suzuki, & Ohtsu, 2018）。因此，敲除PAPSR基因cysH以减少PAPS向这一竞争代谢途径的流失。相应菌株GZ25产163 mg/L CS-A，硫酸化率为19%。尽管有这些改进，硫酸化效率仍然相对较低。此外，要使剩余81%的CH骨架硫酸化，理论上至少需要218 mg/L PAPS，远高于残留的胞内PAPS含量（19 mg/L）。这些结果表明，即使在强化天然生物合成途径并阻断其主要竞争消耗途径后，PAPS供应仍然不足，这可能归因于其内在代谢限制，如高能量需求和调控复杂性。
【数据】GZ23：过表达CysDN；GZ24：异源表达BsCysP；硫酸盐筛选：Na2SO4、K2SO4、CuSO4、FeSO4、Al2(SO4)3、MgSO4、(NH4)2SO4；最优(NH4)2SO4：20 mM，CS-A 157 mg/L，硫酸化率17%；GZ25（敲除cysH）：CS-A 163 mg/L，硫酸化率19%；理论PAPS需求：218 mg/L；残留胞内PAPS：19 mg/L
3.3 引入人工PAPS合成途径增强CS-A生产
为克服天然PAPS生物合成途径的局限性，将人工RPA途径（Gu et al., 2025）引入工程菌株，将AMP直接转化为PAPS（图3A）。具体地，编码APSK、PPK和APSST的基因分别整合至菌株GZ25基因组的rpH、ylbE和rpH（Chu et al., 2025）位点，获得菌株GZ26。摇瓶发酵48 h后，菌株GZ26产179 mg/L CS-A，硫酸化程度为17%。为进一步提高RPA途径效率，将APSST基因的串联二拷贝和三拷贝依次整合至菌株GZ26基因组的acrD和gatz位点，分别获得菌株GZ27和GZ28。结果显示，菌株GZ27的CS-A滴度达255 mg/L，硫酸化程度为25%；菌株GZ28产257 mg/L CS-A，硫酸化程度显著提高至32%（图3B）。与菌株GZ26相比，这些修饰使CS-A滴度分别提高42.26%和44.38%，硫酸化程度分别提升47.05%和88.23%（图3C）。进一步扩增APSST显著提高了CS-A产量和硫酸化程度，表明APS形成是RPA途径中的关键限速步骤。
为优化底物通道并减少中间产物损失，采用不同的酶共定位策略进一步组装APSST和APSK，包括柔性或刚性肽接头（K. Chen et al., 2026; Yameng Xu et al., 2022; Zhang, Wang, Wang, & Fang, 2017）、I型顺式酰基转移酶聚酮合酶（PKS）对接结构域（DDs）（Collin & Weissman, 2025; Sun et al., 2022）以及短肽标签对（RIAD–RIDD）（Meng et al., 2025; Yameng Xu et al., 2022）（图4A）。共构建了20个工程菌株，所有菌株均表现出增强的CS-A生产，滴度增幅相对于未组装对照菌株GZ28.1为0.06%至92.18%（表S4）。其中，采用RIAD-RIDD支架的菌株GZ28.19获得最高硫酸化程度56%（图4B和C）。基于此结果，将优化的双酶组装盒RIAD-APSK-APSST-RIDD整合至菌株GZ28基因组，获得菌株GZ29。RIAD-RIDD对的两种共定位荧光蛋白在体内展示了其组装能力（图4D）。在摇瓶条件下，菌株GZ29产325 mg/L CS-A，硫酸化程度为40%，与菌株GZ28相比在产物滴度和硫酸化效率上均有大幅提升。除增加基因拷贝数外，还探索了途径酶的空间组织以进一步提高途径效率（Chen et al., 2025; Kang et al., 2019; Sun et al., 2022; Yameng Xu et al., 2022）。
【数据】GZ26：CS-A 179 mg/L，硫酸化度17%；GZ27（APSST二拷贝）：CS-A 255 mg/L，硫酸化度25%；GZ28（APSST三拷贝）：CS-A 257 mg/L，硫酸化度32%；滴度提升：42.26%（GZ27）、44.38%（GZ28）；硫酸化度提升：47.05%（GZ27）、88.23%（GZ28）；组装策略：柔性/刚性肽接头、I型PKS对接结构域、RIAD-RIDD短肽标签对；20个工程菌株，滴度增幅0.06%–92.18%；GZ28.19：硫酸化度56%；GZ29：CS-A 325 mg/L，硫酸化度40%
（后续结果部分原文节选未完，包含PAPS-PAPS循环优化、C4ST启动子选择、5 L生物反应器发酵及产物结构表征等内容，最终GZ32菌株实现8.56 g/L CS-A和90%硫酸化程度。）
讨论与解读
本研究在产CH菌株GZ17中实施了整合代谢工程策略，实现CS-A的从头合成，同时获得高滴度与高硫酸化程度。优化硫酸盐同化、引入人工RPA途径以及组装限速酶缓解了PAPS供应瓶颈。同时，通过启动子工程和多拷贝基因组整合系统调控C4ST表达，协调CH骨架合成、PAPS可用性和硫酸化能力。最终工程菌株GZ32在补料分批发酵中获得8.56 g/L的CS-A滴度和90%的硫酸化程度，为目前微生物生产的最高报道水平。值得注意的是，所产CS-A的分子量（10 kDa）相对较低，这可能归因于同时工程改造多条生物合成途径（CH骨架合成、PAPS供应和硫酸化）带来的代谢负担，可能限制了UDP-糖前体用于链延伸的可用性。作者表示将在未来研究中进一步探究该机制。
编译者解读：该研究最值得借鉴之处在于系统性地识别并逐层解除硫酸化瓶颈——从PAPS供应到磺基转移酶表达，再到酶的空间组织，每一步都有明确的定量数据支撑决策。RIAD-RIDD短肽介导的酶组装策略将硫酸化程度从32%提升至56%，展示了合成生物学中"空间组织即功能"的设计理念。然而，10 kDa的低分子量提示多途径并行工程存在代谢负担的隐性代价，未来若能在辅因子再生与链延伸之间找到更优平衡点，该平台有望进一步逼近天然CS-A的分子量范围。这一工作为其他硫酸化糖胺聚糖的微生物合成提供了可推广的范式。
参考来源
Qi, H. (2026). Coordinated optimization of 3′-phosphoadenosine-5′-phosphosulfate (PAPS) supply and sulfotransferase expression in Escherichia coli for production of chondroitin sulfate A with high sulfation degree. Carbohydrate Polymers. DOI: 10.1016/j.carbpol.2026.125280
DOI: 10.1016/j.carbpol.2026.125280