来源：Production of glucaric acid from myo-inositol in engineered Pichia pastoris（Enzyme and Microbial Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
葡糖二酸是一种高价值有机酸，广泛用于食品、化工和医药行业，但传统化学合成法成本高、污染大。本研究在毕赤酵母中首次构建了从肌醇合成葡糖二酸的完整代谢通路，通过共表达内源肌醇加氧酶（ppMIOX）和恶臭假单胞菌来源的糖醛酸脱氢酶（Udh），实现了葡糖二酸的从头合成。进一步引入小鼠来源的MIOX并采用融合表达策略优化酶活，最终在补料分批发酵中将葡糖二酸产量提升至6.61 g/L——这是迄今为止报道的最高水平。
研究背景
葡糖二酸天然存在于部分水果、蔬菜和哺乳动物体内，其衍生物在食品、化工、制药等领域应用广泛，已被列为"来自生物质的高附加值化学品"。目前工业上主要采用硝酸作为溶剂和氧化剂，通过葡萄糖化学氧化合成葡糖二酸，但该工艺条件剧烈、选择性差、成本高昂，且化学合成产品在食品领域的应用受到消费者心理抵触。因此，构建微生物细胞工厂生产葡糖二酸成为备受关注的替代方案。哺乳动物和植物细胞虽能合成葡糖二酸，但途径冗长（超过10步转化），且UDP-葡糖醛酸转化所需酶尚未完全明确。Moon等人近期在大肠杆菌中构建了葡糖二酸合成途径，但真核宿主中的研究仍属空白。毕赤酵母作为成熟的蛋白表达系统，具有完整的肌醇代谢途径，是构建葡糖二酸合成通路的理想底盘。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养条件
大肠杆菌TOP10（Invitrogen）用于分子克隆和质粒操作。恶臭假单胞菌KT2440基因组DNA作为克隆udh基因的模板。毕赤酵母GS115作为初始宿主。本研究所用引物和毕赤酵母菌株分别列于表1和表2。质粒pPIC9K和pGAPZB用于构建重组菌株。所有大肠杆菌菌株在37°C的Luria–Bertani肉汤（LB，10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl）或添加卡那霉素（30μg/mL）或博来霉素（25μg/mL）的琼脂平板上培养。YPD培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖）添加或不添加10g/L肌醇，作为毕赤酵母摇瓶培养的初始发酵培养基。摇瓶培养时，从单菌落制备的预接种物在含25mL YPD培养基的250mL摇瓶中于30°C、220rpm过夜培养。将10%（v/v）种子培养物接种至含50mL YPD培养基（添加或不添加10g/L肌醇）的500mL摇瓶中，继续培养60h，每12h取样一次。优化后，YPD培养基中添加葡萄糖的初始浓度为60g/L，培养基最佳初始pH控制在5.5。培养24h后，以25%（v/v）接种量进行接种。
【数据】菌株：E. coli TOP10、P. putida KT2440、P. pastoris GS115；培养基：LB（10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl）、YPD（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖）；抗生素：卡那霉素30μg/mL、博来霉素25μg/mL；温度：37°C（大肠杆菌）、30°C（毕赤酵母）；转速：220rpm；时间：过夜、60h；接种量：10%（v/v）、25%（v/v）；肌醇：10g/L；葡萄糖：60g/L；pH：5.5
2.2 质粒构建与毕赤酵母转化
内源肌醇加氧酶编码基因（ppMIOX）从毕赤酵母GS115基因组中扩增获得。小鼠来源的mMIOX基因（GenBank登录号：AF197127）根据毕赤酵母密码子偏好性合成（密码子优化后的mMIOX基因GenBank登录号：KT735052）。mMIOX基因的天然序列和优化序列列于补充图1。编码糖醛酸脱氢酶的途径基因udh从恶臭假单胞菌KT2440基因组中扩增。经限制性内切酶XhoI和XbaI消化后，ppMIOX和mMIOX片段插入pGAPZB载体（GAP启动子，Zeocin™抗性标记基因），分别产生重组质粒pGAPZB-pM和pGAPZB-mM。udh基因插入pPIC9KGAP载体（pPIC9K的衍生载体，其中甲醇诱导型启动子PAOX1被组成型启动子PGAP替代），产生重组质粒pPIC9KGAP-Udh。所有构建的表达载体均经DNA测序确认。重组载体pGAPZB-pM和pGAPZB-mM用BspHI线性化以插入GAP启动子位点，重组载体pPIC9KGAP-Udh用SalI线性化以插入HIS4位点。然后，将5–10μg线性化质粒通过电穿孔转化入毕赤酵母感受态细胞。对于多拷贝整合转化子的梯度筛选，携带pGAPZB-pM或pGAPZB-mM载体的转化子转移到含500、1000、1500和2000μg/mL Zeocin™的YPD平板上，而携带pPIC9KGAP-Udh载体的转化子接种到含1.0、2.0、3.0和4.0μg/mL G418的YPD平板上。一般来说，高拷贝整合与高抗生素抗性一致。表达盒整合到毕赤酵母GS115基因组中，并以重组菌株基因组DNA为模板通过PCR确认。
【数据】限制酶：XhoI、XbaI、BspHI、SalI、SacI；线性化DNA量：5–10μg；Zeocin™浓度：500、1000、1500、2000μg/mL；G418浓度：1.0、2.0、3.0、4.0μg/mL；转化方法：电穿孔
2.3 Udh与mMIOX在毕赤酵母GS115中的融合表达
为构建表达双功能融合蛋白的质粒，通过首尾相连技术（udh融合到mMIOX的N端）[21]，使用10种不同连接肽（GGGGS、GGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGS、EAAAK、EAAAKEAAAK、EAAAKEAAAKEAAAK、PTPTP、PTPTPTPTP、PTPTPTPTPTPTPTP和SSSNNNNNNNNNN）[22–24]构建了11个融合片段（udh基因去除终止密码子）。融合PCR所用引物列于表1。所得融合片段亚克隆到pPIC9KGAP中，生成11个重组质粒，包括pPIC9KGAP-(U-mM)、pPIC9KGAP-U-(G4S)1-mM、pPIC9KGAP-U-(G4S)2-mM、pPIC9KGAP-U-(G4S)3-mM、pPIC9KGAP-U-(EA3K)1-mM、pPIC9KGAP-U-(EA3K)2-mM、pPIC9KGAP-U-(EA3K)3-mM、pPIC9KGAP-U-(PT)2P-mM、pPIC9KGAP-U-(PT)4P-mM、pPIC9KGAP-U-(PT)7P-mM和pPIC9KGAP-U-S3N10-mM。随后，所有重组质粒用SacI线性化以插入GAP启动子位点，并通过电穿孔转化入毕赤酵母GS115。所得重组菌株列于表2。
【数据】连接肽：10种（GGGGS、GGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGS、EAAAK、EAAAKEAAAK、EAAAKEAAAKEAAAK、PTPTP、PTPTPTPTP、PTPTPTPTPTPTPTP、SSSNNNNNNNNNN）；融合方式：udh融合至mMIOX N端；限制酶：SacI；转化方法：电穿孔
2.4 3-L发酵罐补料分批发酵
种子培养在含50mL YPD培养基的500mL带挡板摇瓶中于30°C、220rpm振荡培养24h。将25%（v/v）种子培养物接种至装有1L初始发酵培养基的3-L发酵罐（LiFlus GM BioTRON，韩国）中。改良基础盐培养基（BSM）含60g/L葡萄糖、13g/L肌醇、18.2g/L K2SO4、0.93g/L CaSO4、14.9g/L MgSO4·7H2O、4.13g/L KOH、26.8mL/L H3PO4和4.35mL/L痕量矿物溶液（PTM1），作为发酵培养基，PTM1组成与先前描述相同[25]。补料培养基由800g/L葡萄糖溶液加12mL/L PTM1组成。当残余葡萄糖浓度低于5g/L时，以15mL/h的恒定流速开始葡萄糖补料。当培养液中的生物量达到稳定状态时停止补料。发酵40h时，向培养基中加入100mL含13g肌醇的溶液。两个六叶盘式涡轮提供搅拌。发酵过程中，通过自动添加50%氢氧化铵将培养液pH控制在5.5，温度、搅拌速度和通气速率分别维持在30°C、800rpm和4vvm。
【数据】发酵罐：3-L（LiFlus GM BioTRON）；初始培养基：改良BSM（60g/L葡萄糖、13g/L肌醇、18.2g/L K2SO4、0.93g/L CaSO4、14.9g/L MgSO4·7H2O、4.13g/L KOH、26.8mL/L H3PO4、4.35mL/L PTM1）；补料培养基：800g/L葡萄糖+12mL/L PTM1；补料流速：15mL/h；补料触发条件：残糖<5g/L；肌醇添加：40h时加入100mL含13g肌醇溶液；pH：5.5（50%氢氧化铵自动调节）；温度：30°C；转速：800rpm；通气：4vvm
2.5 LCMS-IT-TOF和HPLC产物分析
培养上清液在8000g离心5min后，先通过混合离子阱飞行时间液相色谱/质谱（LCMS-IT-TOF）分析以表征产物。LC分离使用C18柱（150×2.0mm；Shimadzu，京都，日本），条件与先前描述相同[26]。流动相为水和甲醇，均含甲酸（0.01% v/v）和甲酸铵（1mM），采用0–20min线性梯度，恒定流速0.5mL/min。MS在负离子模式下扫描m/z范围100–500，10s/次扫描。葡糖二酸和肌醇的定量采用高效液相色谱（HPLC），使用折光指数和二极管阵列检测器，条件与先前描述相同[7]。对于葡糖二酸分析，培养上清液首先用硼酸亲和凝胶预处理以去除干扰化合物。具体而言，所有样品在分析前经0.22μM滤膜过滤。
【数据】离心：8000g、5min；LC柱：C18（150×2.0mm）；流动相：水/甲醇+0.01%甲酸+1mM甲酸铵；流速：0.5mL/min；梯度：0–20min线性；MS扫描：m/z 100–500，负离子模式，10s/次；滤膜：0.22μM
2.6 酶活测定
细胞通过5000g、4°C离心5min从发酵液中收集。弃去上清液，沉淀用Tris-HCl（10mM，pH 8.0）洗涤两次。沉淀重悬于混有玻璃珠的洗涤缓冲液中。使用FastPrep-24（Molecular Biology）进行细胞破碎，6个循环，每次击打20s，循环间冰浴1min。上清液中的粗酶用于活性测定。MIOX和Udh的活性按先前描述的方法测定[7]。细胞裂解液中的蛋白质浓度用Bradford法[27]定量。1单位MIOX活性定义为在测定条件下每分钟产生1nM葡糖醛酸所需的酶量；1单位Udh活性定义为在测定条件下每分钟产生1μM NADH所需的酶量。每个数值为三次重复样品的平均值，误差线代表标准差。
【数据】离心：5000g、4°C、5min；洗涤缓冲液：Tris-HCl（10mM，pH 8.0）；破碎：FastPrep-24，6循环×20s击打+1min冰浴；蛋白定量：Bradford法；酶活单位：MIOX=1nM葡糖醛酸/min，Udh=1μM NADH/min；重复：三次
研究结果
3.1 毕赤酵母中潜在MIOX编码基因的功能验证
MIOX是一种独特的单加氧酶，催化肌醇代谢的第一个限速步骤[28]，已在哺乳动物和部分酵母物种中发现[29]，因为它可能是治疗糖尿病并发症的潜在靶点[30]。本研究在分析毕赤酵母GS115的基因组信息和预测的葡糖二酸途径后（图1），扩增了一个潜在的肌醇加氧酶编码基因（ppMIOX）。多序列比对分析结果（图2A）显示，来自毕赤酵母的这个潜在肌醇加氧酶（ppMIOX）与其他已充分研究的MIOX具有高度序列同一性。高度保守的基序148DxSDPD153（含底物结合残基D148和S150）和185HDxGK189（含铁结合残基H185、D186和底物结合残基K189）[28]在ppMIOX中均保守。此外，其他相应的功能性结合残基也能在ppMIOX中找到，表明它应该是毕赤酵母中的一个功能性MIOX。为确认该假设蛋白的功能并进一步表征，将潜在编码基因整合到毕赤酵母GS115基因组中进行过表达。相应的重组菌株毕赤酵母GS115-pM在补充10g/L肌醇的培养基中培养，因为如果ppMIOX功能表达，应能检测到葡糖醛酸。随后，用LCMS-IT-TOF分析重组毕赤酵母GS115-pM的培养上清液。如预期所料，在重组毕赤酵母GS115-pM培养物中检测到葡糖醛酸积累（图2B和C）。相比之下，对照菌株毕赤酵母GS116（整合空质粒pGAPZB的毕赤酵母GS115）中未检测到葡糖醛酸。因此，结果证明假设蛋白ppMIOX是一种肌醇加氧酶，且毕赤酵母中从葡萄糖经肌醇合成葡糖醛酸的生物合成途径是完整的。然而，既未检测到可测量的酶活性，也未检测到相应蛋白（补充图2A和B），提示该内源蛋白在毕赤酵母中表达量低或不稳定。此外，培养过程中未检测到葡糖二酸，表明毕赤酵母中葡糖二酸生物合成途径不完整。
【数据】比对分析：ppMIOX与其他MIOX高度同源；保守基序：148DxSDPD153、185HDxGK189；肌醇添加：10g/L；检测产物：葡糖醛酸（LCMS-IT-TOF确认）；对照菌株：GS116（空质粒）未检出；酶活性：未检测到；蛋白表达：未检测到；葡糖二酸：未检出
3.2 毕赤酵母中葡糖二酸生物合成途径的构建
为构建葡糖二酸生物合成途径，从恶臭假单胞菌KT2440克隆编码糖醛酸脱氢酶的udh基因，插入带有组成型PGAP启动子的pPIC9K中，并整合到毕赤酵母GS115和毕赤酵母GS115-pM基因组中，分别生成毕赤酵母GS115-U（Udh）和毕赤酵母GS115-U-pM（Udh+ppMIOX）。然后，将毕赤酵母GS115-U和毕赤酵母GS115-U-pM在添加10g/L肌醇的YPD培养基中进行比较培养。尽管ppMIOX在毕赤酵母中是功能性肌醇加氧酶（图2B和C），但在仅过表达Udh的毕赤酵母GS115-U培养过程中未检测到葡糖二酸积累。相反，在毕赤酵母GS115-U-pM中观察到明显的葡糖二酸积累（图3A–C），添加10g/L肌醇培养60h时滴度为90.46±0.04mg/L。为进一步评估该途径，测定了重组毕赤酵母GS115-U-pM中ppMIOX和Udh的活性。出乎意料的是，尽管ppMIOX过表达使得肌醇能够积累葡糖醛酸（图2C）和葡糖二酸（图3B），但在酶活测定中未观察到可测量的MIOX活性，提示ppMIOX在毕赤酵母正常生长条件下不表达或不稳定。此前，小鼠来源的MIOX（mMIOX）已获得良好表达，可溶性蛋白产量高于人源或大鼠来源的酶[31]，并已用于大肠杆菌中葡糖二酸的合成[7]。因此，我们还构建了重组菌株毕赤酵母GS115-U-mM，在组成型启动子pGAP控制下共过表达mMIOX和Udh。如图3C所示，在添加10g/L肌醇的YPD培养基中，重组毕赤酵母GS115-U-mM的葡糖二酸产量提高至785.4±1.41mg/L，比毕赤酵母GS115-U-pM的产量高约9倍。此外，与毕赤酵母GS115-U-pM（在YPD培养基中无葡糖二酸积累）不同，毕赤酵母GS115-U-mM在不添加肌醇的YPD培养基中积累107.19±11.91mg/L葡糖二酸（图3C）。这些结果表明，与内源ppMIOX相比，异源mMIOX在毕赤酵母中表现出更高的活性。相应地，在毕赤酵母GS115-U-mM中检测到明显的MIOX活性（图3D）。特别是在含肌醇的YPD培养基中培养毕赤酵母GS115-U-mM时，观察到更高的MIOX比活性（图3D），这与近期在大肠杆菌中的报道一致[4,7]。此外，还分析比较了Udh活性。如图3E所示，添加或不添加肌醇时观察到相似的Udh比活性，表明肌醇对Udh活性无影响。综上，这些结果表明肌醇转化为葡糖醛酸（由MIOX催化）是葡糖二酸生物合成途径中的限速步骤，且毕赤酵母中肌醇的合成受到严格调控。同时，结果也表明mMIOX比ppMIOX具有更高活性，因为当过表达Udh和内源ppMIOX时，从葡萄糖未能积累葡糖二酸（图3C）。尽管Udh克隆自细菌菌株，但它在毕赤酵母中表达良好，未导致中间产物葡糖醛酸的积累（数据未显示）。因此，提高MIOX比活性是实现更高葡糖二酸滴度的关键。
【数据】菌株：GS115-U（仅Udh）、GS115-U-pM（Udh+ppMIOX）、GS115-U-mM（Udh+mMIOX）；葡糖二酸产量（GS115-U-pM，10g/L肌醇，60h）：90.46±0.04mg/L；葡糖二酸产量（GS115-U-mM，10g/L肌醇）：785.4±1.41mg/L；葡糖二酸产量（GS115-U-mM，无肌醇）：107.19±11.91mg/L；提升倍数：约9倍；MIOX活性：仅在GS115-U-mM中检出；Udh活性：肌醇无影响
3.3 通过Udh和mMIOX融合表达增强葡糖二酸生产
此前，使用不同肽连接肽的融合表达策略[24,32]已被开发并成功应用于酿酒酵母中优化途径以提高有价值化学品的产量[21,33]。为提高酶和中间体的局部浓度并增加mMIOX的比活性，将关键酶mMIOX和Udh用10种不同连接肽进行首尾融合（图4A）。图4B显示，与游离酶对照菌株毕赤酵母GS115-U-mM（785.4±1.41mg/L）相比，重组菌株毕赤酵母GS115-U-(G4S)1-mM、毕赤酵母GS115-U-(EA3K)3-mM和毕赤酵母GS115-(U-mM)在补充10g/L肌醇的条件下积累了更高浓度的葡糖二酸，分别为944.67±5.31mg/L、930.63±3.35mg/L和921.30±45.86mg/L。相反，与其他连接肽融合则显著降低了葡糖二酸的积累。结果表明，酶融合中的(GGGGS)1和(EAAAK)3连接肽有利于葡糖二酸的合成。为验证这一假设，对重组菌株中MIOX和Udh的活性进行了研究和比较。如预期所料，使用(GGGGS)1和(EAAAK)3连接肽的MIOX和Udh融合表达产生了更高的MIOX比活性（5.46±0.32U/mg和5.16±0.17U/mg，图4C），高于菌株毕赤酵母GS115-U-mM中的游离MIOX（3.21±0.17U/mg），这与更高的葡糖二酸产量一致。相比之下，所有其他连接肽，尤其是(PT)nP或S3N10连接肽，显著降低了MIOX和Udh的比活性（图4C和D），尽管已有报道称这些肽段具有抗蛋白水解特性[24]。结果表明，使用由小侧链氨基酸组成的柔性肽进行物理融合……
【数据】对照菌株产量（GS115-U-mM，10g/L肌醇）：785.4±1.41mg/L；U-(G4S)1-mM产量：944.67±5.31mg/L；U-(EA3K)3-mM产量：930.63±3.35mg/L；U-mM产量：921.30±45.86mg/L；MIOX比活性：U-(G4S)1-mM为5.46±0.32U/mg，U-(EA3K)3-mM为5.16±0.17U/mg，游离MIOX为3.21±0.17U/mg；(PT)nP和S3N10连接肽：显著降低MIOX和Udh活性
讨论与解读
本研究在毕赤酵母中表征了一个内源MIOX，并通过共表达Udh构建了合成葡糖二酸的代谢途径。为提高葡糖二酸产量，引入了小鼠来源的MIOX并通过融合表达策略上调其活性。经Udh和mMIOX融合表达及培养工艺优化后，摇瓶中添加10g/L肌醇时葡糖二酸滴度从785.4±1.41mg/L提高至1697.60±74.61mg/L。综合考虑细胞生长、葡萄糖对葡糖二酸生物合成的贡献（108.44±3.22mg/L，图5A）以及维持高MIOX比活性，在补料分批发酵中采用葡萄糖和肌醇混合底物，最终将葡糖二酸产量大幅提升至6.61±0.30g/L。据作者所知，这是迄今为止报道的最高值（表3）。
编译者解读
该研究展示了典型的"底盘挖掘+异源强化"策略：先验证内源酶的可行性，再以活性更高的异源酶替代，最后通过蛋白融合工程解决限速步骤。融合表达中柔性连接肽筛选的对比设计尤为扎实——10种连接肽的平行数据既证明了策略有效性，也揭示了连接肽选择对融合蛋白活性的决定性影响。从合成生物学应用角度看，6.61 g/L的产量已具备工业转化潜力，但依赖外源肌醇添加的成本问题仍是规模化瓶颈。后续若能强化内源肌醇合成通路，实现完全从葡萄糖合成葡糖二酸，将更具经济可行性。
参考来源
Liu Y, et al. Production of glucaric acid from myo-inositol in engineered Pichia pastoris. Enzyme and Microbial Technology, 2016. DOI: 10.1016/j.enzmictec.2016.05.009
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2016.05.009