来源：Deployment of metabolic heat rate based soft sensor for estimation and control of specific growth rate in glycoengineered Pichia pastoris for human interferon alpha 2b production（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
治疗性蛋白药物的生产过程控制长期受制于在线传感器匮乏与过程变异性大等瓶颈。本研究开发了一种以代谢热率为输入信号的非侵入式软传感器，用于糖工程毕赤酵母（Pichia pastoris）诱导阶段比生长速率（μ）的实时估计。研究系统比较了前馈控制、标准PID控制与自适应PID（增益调度）三种策略，其中自适应PID将μ的跟踪误差控制在6%以内，并将人干扰素α2b（huIFNα2b）的生产率提升至前馈控制的2.2倍。该工作为高密度发酵过程的精准控制提供了新范式。
研究背景
干扰素α2b（165个氨基酸残基，分子量19 kDa）是最重要的细胞因子之一，通过与特异性IFN α/β受体结合激活JAK-STAT信号通路，进而启动免疫调节、抗增殖和抗病毒蛋白的表达。其商业制剂Intron®A已获FDA批准用于慢性丙型肝炎、乙型肝炎、毛细胞白血病、恶性黑色素瘤、滤泡性淋巴瘤、尖锐湿疣及艾滋病相关卡波西肉瘤的治疗。近年来，由于IFNα2b与抗逆转录病毒和抗疟药物联用治疗SARS-CoV-2（COVID-19）的潜力，其需求急剧上升。生物药专利期满后，IFNα2b生物类似药的竞争性生产成为可能，经济高效的生产工艺成为产业关注焦点。
毕赤酵母兼具高效的翻译后修饰能力（类似哺乳动物宿主）和卓越的培养稳定性，被广泛认可为治疗性蛋白合成的安全微生物宿主。然而，生物过程系统中缺乏合适的过程模型、可靠的在线传感器以及过程变异性大等问题，对关键过程参数（CPPs）的实时监控构成了严峻挑战。比生长速率（μ）是诱导阶段最重要的CPP之一，其精确控制直接关系到重组蛋白的产量与质量。
研究方法
2.1 菌株
本研究使用一株人源化糖工程毕赤酵母菌株（Glycoswitch® SuperMan5 pep4Δ prb1Δ，购自美国Biogrammatics Inc.），具有Mut+表型，表达huIFNα2b。此前的研究已描述了克隆构建、huIFNα2b生产率及纯化产物的表征（Katla et al., 2019a）。甘油保存管在含20%（v/v）甘油的酵母蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基中于−80°C保存。
研究中使用的各种培养基组成如下：
- 起始培养基（酵母提取物蛋白胨葡萄糖，YPD），g/L：酵母提取物10；蛋白胨20；葡萄糖20
- 预培养培养基（酵母提取物蛋白胨甘油，YPG），g/L：酵母提取物10；蛋白胨20；甘油20
- 优化发酵培养基（基础盐培养基，BSM）（Katla et al., 2019c）：甘油48.84 g/L；K₂SO₄ 18.2 g/L；MgSO₄ 7.28 g/L；KOH 4.13 g/L；CaSO₄·0.2H₂O 0.93 g/L；(NH₄)₂SO₄ 8.42 g/L；85% H₃PO₄ 26.7 mL/L；PTM4盐4.4 mL/L
【数据】菌株：Glycoswitch® SuperMan5 pep4Δ prb1Δ（Mut+）；保存温度：−80°C；YPD培养基含20%（v/v）甘油；BSM甘油浓度：48.84 g/L
2.2 接种物制备
将−80°C保存的甘油管划线于YPD平板以生长单菌落。从YPD平板挑取单菌落接种至含5 mL YPD培养基的试管中作为起始培养。预培养通过将起始培养接种至含300 mL YPG培养基的挡板摇瓶中进行。预培养在30°C、220 RPM条件下培养24小时，至最终OD₆₀₀为4吸光度单位。
【数据】温度：30°C；转速：220 RPM；时间：24h；OD₆₀₀：4
2.3 发酵量热计装置与原理
热补偿发酵量热计是一种配备高灵敏度温度探头和低温恒温器隔热层的专用生物反应器，通常用于研究宏观尺度生物过程的热焓（Maskow et al., 2010）。本研究采用自建的发酵量热计（印度金奈Biojenik Engineering）追踪糖工程毕赤酵母的代谢活动（Mohan and Sivaprakasam, 2017）。
反应器装置包括一个双夹套生物反应器，配备四个灵敏度为1 mK的高灵敏度温度探头，分别置于反应器培养液（2个）和夹套进出口处。发酵量热计的等温条件由两个独立的PID控制器维持，它们分别调节发酵量热计中补偿加热器的功率和低温恒温器的动态设定点以调整夹套温度。第一个PID控制器通过操纵与生物热产生速率成比例的适当功率来驱动补偿加热器。该加热器的输出（72 ± 0.05 W）与低温恒温器协同维持反应器温度。第二个PID控制器调节低温恒温器以控制夹套入口温度Tⱼ,ᵢₙ。
毕赤酵母培养过程中产生的代谢热率通过将发酵量热计中各种热源分解为非生物和生物热率来解卷积。由各种机械操作产生的非生物热率针对每个操作参数进行了估算（Mohan and Sivaprakasam, 2017）。对发酵量热计施加动态能量平衡以计算生物热率，如式(1)所示：
(1) q_C − q_J − q_E + q_S − q_A + q_B = m_w C_P dT_r/dt
其中q_B（生物热率，W/L）、q_C（补偿加热器产生的功率，W/L）、T_r（反应器温度）、m_w（水质质量，kg）。非生物活动的热率贡献包括环境热损失（q_E，W/L）、从反应液到夹套的热流（q_J，W/L）、搅拌热率（q_S，W/L）和通气热损失（q_A，W/L）。“+”或“−”符号分别对应发酵过程中吸收和释放的热率。
为了准确测量非生物热率，量热计应在无发酵的稳态条件下运行。因此，式(1)中的导数项（dT_r/dt→0）变为零，所有非生物热率源可合并为q_baseline，如式(2)所示：
(2) q_baseline = q_S − q_J − q_E − q_A
其中q_baseline为基线热率（W/L）。此时，生物热率的测量变得更加直接，可从q_baseline和q_C读取，如式(3)所示：
(3) q_B = q_baseline − q_C
【数据】温度探头灵敏度：1 mK；补偿加热器功率：72 ± 0.05 W；探头数量：4个
2.4 介电谱法
介电谱法（阻抗谱法/电容探头）基于悬浮在导电培养基中细胞所表现出的介电特性来测量活细胞浓度（VCC）。电容探头（英国Aberystwyth，Aber Instruments）的尖端被陶瓷覆盖层上的两个环形圈环绕，产生施加于所应用频率的电场。电场对细胞的影响迫使离子穿过细胞膜极化，细胞内/细胞外离子向非导电质膜移动（Flores-Cosio et al., 2020）。跨膜电荷梯度建立电容，每个细胞充当一个微小的电容器，保持介电常数（ε）或电容（pF/cm）。这可以与细胞膜受损的死细胞区分开来，死细胞被假定为裂解、损伤或碎片化。除生物量外，培养液中剩余的悬浮颗粒不产生电容，因为它们缺乏质膜。
在本研究中，通过Futura软件（英国Aberystwyth，Aber Instruments）在双频率（580 kHz和15.560 MHz）下记录电容值，频率之间的差值（ΔC）代表总电容值。本研究还探索了将介电谱法作为辅助过程分析技术（PAT）过程分析仪的应用，以阐明代谢热率信号在监测毕赤酵母培养方面的潜力。
【数据】测量频率：580 kHz和15.560 MHz；测量参数：电容差值（ΔC）
2.5 尾气分析仪
尾气分析仪（Ultramat 23，德国柏林西门子股份公司）测量CO₂的气相浓度。检测器读取CO₂的吸收光谱，其与气相组成成比例，并以摩尔分数y_CO₂,out传输信号。数值由监控与数据采集系统（SCADA）每5秒记录一次，测量值用于计算CO₂释放速率（CER），如式(4)所述：
(4) CER (mg/L·s) = ṁ_g/V_R [y_CO₂,out (y_inert,in/y_inert,out) − y_CO₂,in]
其中ṁ_g为气体质量流量（L/s），V_R为反应液体积（L），y_CO₂,in为空气入口流中CO₂的摩尔分数，y_CO₂,out为空气出口流中CO₂的摩尔分数，y_inert,in为空气入口流中N₂的摩尔分数，y_inert,out为空气出口流中N₂的摩尔分数。
【数据】记录间隔：5s；分析仪型号：Ultramat 23（Siemens AG）
2.6 huIFNα2b生产
糖工程毕赤酵母生产人IFNα2b在5 L规模下进行。量热计装置原位灭菌，在121°C、1 bar压力下用蒸馏水预填充20分钟，随后无菌转移单独灭菌的优化BSM培养基。反应温度设置为30°C，通过添加氨水（25% v/v溶液）和正磷酸（85% v/v溶液）将培养物pH维持在5.4。通过将空气流与纯氧结合（总流量1 vvm）并将搅拌速率控制在400至800 rpm之间，使溶解氧维持在15%以上。
将10% v/v的预培养物无菌转移至量热计中，最终工作体积为2.5 L。生物体的生长过程按以下顺序进行：甘油批次阶段、适应阶段和诱导阶段。第一阶段以甘油为主要碳源，产生较高量的生物量。碳源耗尽使代谢活动趋于平稳，随后进入适应阶段。诱导阶段通过甲醇流加启动重组蛋白表达。
图1展示了用于糖工程毕赤酵母培养的各类传感器分类。
图2展示了用于实时监测和控制糖工程毕赤酵母培养比生长速率（用于生产huIFNα2b）的发酵量热计装置示意图。
【数据】发酵规模：5 L；灭菌条件：121°C、1 bar、20 min；温度：30°C；pH：5.4；溶解氧：>15%；通气量：1 vvm；搅拌：400–800 rpm；接种量：10% v/v；工作体积：2.5 L
研究结果
3.1 过程分析仪的比较评估及从热率信号推导的μ_est
发酵量热计、电容探头和CO₂分析仪等过程分析仪的联合部署显示了毕赤酵母生长过程中生物量、CER和其他代谢活动的增加。上述过程分析仪信号之间的同步性及其持续增加可归因于毕赤酵母高细胞密度培养期间生物量的体积增加。
在甘油阶段结束时过程分析仪信号的下降以及甲醇利用的较慢适应，随后进入诱导阶段，可以在热谱图和呼吸谱图中于培养的不同阶段观察到（图3）。μ_est表示huIFNα2b生产阶段（即诱导阶段）μ的实时估计。对于前馈（FF）和反馈（FB）策略，依次执行了3个不同的设定点，即0.04、0.035和0.03 h⁻¹。根据先前控制策略的结果，带增益调度的PID仅以0.035 h⁻¹执行。
在所有补料分批操作中，离线估计的比生长速率（μ_off）值可高达0.05 h⁻¹，最低至0.025 h⁻¹，如图3、图4和图5所示。使用式(9)开发的热率估计器在估计比生长速率方面是可靠的。实时与离线μ值之间计算的均方根误差（RMSE）决定了μ_est信号的质量。较低的RMSE指数更有利于设定点-过程变量组合以实现稳健的控制操作。平均RMSE为0.0051 h⁻¹。
图3显示了在3种不同控制策略下，代谢热率（黑色连续线）、电容（红色连续线）和CER（绿色连续线）的动态图，分为甘油批次阶段、适应阶段和诱导阶段。A) 前馈控制（阶段I μ_SP 0.04 h⁻¹，阶段II μ_SP 0.035 h⁻¹，阶段III μ_SP 0.03 h⁻¹）；B) 反馈控制；C) 自适应PID控制。
【数据】μ_SP设定点：0.04、0.035、0.03 h⁻¹；μ_off范围：0.025–0.05 h⁻¹；平均RMSE：0.0051 h⁻¹
3.2 不同控制策略对huIFNα2b生产的影响
批次生长阶段持续至甘油耗尽，这通过DO信号的突然上升表现出来（数据未显示）。甘油耗尽发生在接种后约18至20小时之间，产生22–25 g/L范围内的细胞密度。受甘油限制的批次生长阶段主要支持生物量合成，这从75%的碳通量分布用于实现更高的生物量产率（Y_X/S = 0.756 g生物量/g甘油）可以看出。因此，产生了大量生物量以在随后的甲醇诱导阶段维持较长时间。
最初，将较短脉冲的甲醇（5 g）进料至反应器中，使其代谢并缓慢激活AOX转录元件。过渡阶段的特点是初始阶段呈负生长速率，并在重复脉冲中逐渐发展为正的较慢生长速率。在FF和FB策略的诱导阶段，分别以0.04、0.035和0.03 h⁻¹三个不同设定点值（μ_SP）进行甲醇进料，并持续进料72小时。
比生产率（q_P）、生物量和huIFNα2b产率在最佳μ_SP 0.035 h⁻¹时呈现最高值（表1）。由于先前操作中得出的最佳huIFNα2b生产率，增益调度方法仅在μ_SP 0.035 h⁻¹下进行。在该方法中，μ_SP设定点根据过程变量的先前趋势动态变化。在固定μ_SP下记录了PID参数对进料速率随时间的影响，这种关系有助于增益调度方法。
FF控制策略通过预定的甲醇进料实现。使用式(12)计算的初始进料速率（F₀）对于FF、FB和FB+GS方法分别观察到为5.5 mL/h、5 mL/h和5 mL/h。F₀根据批次阶段数据确定，如式(13)所示，FF策略独立于时间继续执行，忽略了μ_met值的动态变化。在FB控制策略的情况下，进料速率更具体地基于μ_est确定，如式(14)所示。尽管FB策略独立调节进料，但设有限制条件，即进料不超过50 mL/h以避免甲醇毒性（>1.4% v/v）。
最佳μ_SP为0.035 h⁻¹，导致huIFNα2b生产率显著增加，这在FF和FB策略中均重复观察到。在所有基于FB的运行中，指数进料速率通过同时底物利用（残余甲醇浓度维持在接近零）满足细胞的整体代谢需求超过14小时，如图4所示。
图4显示了细胞浓度（红色圆圈）、甘油消耗（绿色菱形）、甲醇消耗（深黄色方块）和huIFNα2b产生（蓝色三角形）的时间过程。A) 前馈控制（阶段1 μ_SP = 0.04 h⁻¹，阶段2 μ_SP = 0.035 h⁻¹，阶段3 μ_SP = 0.03 h⁻¹）；B) 反馈控制；C) 自适应PID控制。
CER信号的轨迹与热率和电容很好地吻合。然而，诱导阶段累积的CO₂形成量成比例地比甘油批次阶段高三倍。诱导阶段发生较高的体积CO₂产生，这是由于使用了最高还原程度的碳源，即甲醇（还原程度，γ_S = 8）。
基于实验数据，简单自适应控制显著提高了q_P值，比常规FB方法（PID控制）高1.5倍，比FF控制高2.2倍。
【数据】甘油耗尽时间：18–20h；细胞密度：22–25 g/L；碳通量分布：75%；Y_X/S：0.756 g/g；甲醇脉冲：5g；诱导时间：72h；初始进料速率：5.5/5/5 mL/h；最大进料限制：50 mL/h；甲醇毒性阈值：>1.4% v/v；CER倍数：3倍；q_P提升：1.5倍（vs FB）、2.2倍（vs FF）
3.3 PID参数对控制特性的影响
FF策略不受过程输入的影响；当进料有毒底物如甲醇时，操作会变得麻烦，容易过度进料，最终导致培养物失稳。但是，调节平衡的进料和一致的培养条件能够在甲醇诱导下实现huIFNα2b的持续合成。图3A中在线信号（即热率、电容和CER）的稳定上升表明FF策略中的进料稳定了生长与蛋白质产生之间的平衡。
然而，FF策略缺乏对甲醇进料的稳健控制，如果不注意，会导致危险的积累，这从图4A中可以明显看出。开放回路培养的建立可以通过引入能够实时测量甲醇浓度的额外过程分析仪来加强。尽管甲醇的连续进料对整体代谢构成威胁，但量热法解决了识别实时μ_est以控制和调节甲醇进料的空白。
使用PID控制器的FB策略旨在抵消甲醇积累并允许伪连续进料。在FB和FB+GS培养中，PID控制器在第36小时启动，μ_SP维持在0.04 h⁻¹持续12小时，随后分别在0.035 h⁻¹和0.03 h⁻¹的μ_SP值下运行。
平均跟踪误差定义了过程变量与其指定设定点的偏差百分比，并指示了所部署控制器的强度。FF策略中μ_est的误差幅度相对较大（>15%），这是由于进料与过程动态不成比例。PID控制参数的调整带来了可容忍的跟踪误差并改善了过程稳定性。
初始调谐参数组基于手动和Zeigler-Nichols设置，以较低值开始（控制器增益k_c 3.5，积分时间τ_i 60 s，微分时间τ_d 0.5 s），以避免受控变量的高振荡（表2）。控制器增益是控制动作（进料速率）可以针对过程变量（μ_est）的增加/减少而被引发的限度。具有较大k_C值的PID控制器高度敏感，反之亦然；因此，仔细选择增益更为重要。开环测试帮助我们获得可以进行稳定控制动作的值范围。实际上，较大的响应时间（τ_I）减少了响应（μ_est）中的振荡。微分值在使过程变量与设定点对齐方面起次要作用。
图5显示了前馈控制器性能，基于μ_est（蓝色连续线）、μ_off（红色连续线和黑色实心圆圈）和μ_SP（黑色连续线）在不同设定点下的比较评估。A) μ_SP = 0.04 h⁻¹，B) μ_SP = 0.035 h⁻¹，C) μ_SP = 0.03 h⁻¹。D) 基于PID控制的反馈策略。
图6显示了由于控制器误差变化而导致的进料速率（蓝色连续线）的影响。A) 使用标准PID控制的反馈；B) 使用带增益调度策略的自适应PID控制的反馈。
【数据】PID启动时间：36h；μ_SP 0.04 h⁻¹持续时间：12h；FF策略跟踪误差：>15%；初始PID参数：k_c 3.5、τ_i 60s、τ_d 0.5s
讨论与解读
4.1 毕赤酵母比生长速率的控制
微/宏观尺度的量热信号高度敏感，代表了由吉布斯自由能耗散所决定的生长驱动力，如有氧、厌氧、产甲烷、藻类生长等。微量热计可在微瓦范围内提供高精度的热活性测量，广泛应用于蛋白质-蛋白质相互作用、土壤微生物组、生物膜等研究（Maskow et al., 2010）。从宏观尺度发酵过程中获取热率信号具有挑战性；许多尝试都致力于提高mW范围内信号的分辨率。本研究团队自建的热补偿发酵量热计已知可展现60.73 mW/L的分辨率，并已在此前用于细菌和酵母发酵（Mohan and Sivaprakasam, 2017）。数十年来，不同配置的发酵量热计已被证明是监测和控制细菌及酵母发酵比生长速率的有效工具。
毕赤酵母以展现双代谢特征而闻名，具有AOX诱导系统，即前期生长阶段和后期诱导阶段。利用抑制性碳源（如甘油）进行细胞生长更易于调节和控制μ。已有多种基于量热法和其他软传感器的方法被报道用于生物过程监测（Luttmann et al., 2012; Schuler et al., 2020）。
本研究通过将代谢热率作为软传感器的输入信号，成功实现了糖工程毕赤酵母诱导阶段比生长速率的实时估计与控制。自适应PID（增益调度）策略在μ_SP 0.035 h⁻¹下实现了超过20小时的窄范围μ控制，平均跟踪误差低于6%，并将huIFNα2b的生产率提升至标准PID的1.5倍、前馈控制的2.2倍。该策略通过动态调整控制器增益，有效抑制了甲醇进料过程中的振荡，实现了长期控制器稳定性。
编译者解读
本研究展示了代谢热率作为软传感器信号在治疗性蛋白生产中的独特价值——量热法非侵入、实时且对代谢状态高度敏感，弥补了传统在线传感器在甲醇诱导阶段的监测盲区。自适应PID的增益调度策略是亮点，它针对毕赤酵母双相代谢的非线性特征动态调整控制参数，将μ的跟踪误差压至6%以下，这种控制精度在工业发酵中具有直接转化价值。值得注意的是，该研究在5 L规模验证了从传感器信号到控制策略的完整闭环，为放大至工业生产提供了可靠的数据基础。局限在于，当前软传感器依赖精确的热补偿量热装置，设备成本较高；未来若能与更廉价的在线传感器（如电容或CER）融合建模，或可进一步降低应用门槛。从合成生物学角度看，该工作提示：精密过程控制与基因工程改造同样重要，两者协同才能释放工程菌株的最大生产潜力。
参考来源
Allampalli, P. (2022). Deployment of metabolic heat rate based soft sensor for estimation and control of specific growth rate in glycoengineered Pichia pastoris for human interferon alpha 2b production. Journal of Biotechnology, 2022. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2022.10.006
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2022.10.006