来源：Whole-pathway stimulation of anthocyanin biosynthesis by UDP-glycose: Flavonoid glycosyltransferase gene (UFGT) providing new insights into natural product development based on plant cell factory（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
花青素是一类重要的植物天然产物，在食品、医药、化妆品和染料领域应用广泛，但传统植物提取方式造成生态破坏和资源浪费。本研究从葡萄中克隆花青素生物合成关键基因VdUFGT，通过农杆菌介导法过表达于葡萄细胞中，获得花青素含量提高4.4倍的转基因细胞系vgt3。整合转录组与代谢组分析揭示了VdUFGT对类黄酮通路的全局激活效应，并成功建立小规模植物细胞工厂，12天内花青素产量达4.11 mg/g（DW），为WT细胞系的8.5倍。
研究背景
植物次生代谢产物是植物通过次生代谢产生的小分子有机化合物，在植物生长发育和环境适应中发挥重要功能，同时在食品、医药和化妆品行业具有巨大商业潜力。花青素作为水溶性天然色素，赋予植物器官丰富色彩，具有抗氧化、抗肿瘤、抗衰老和抗炎等生物活性。目前花青素主要来源于植物组织提取，但水果种植成本上升导致原料价格上涨，制约了天然花青素的开发利用。本研究提出基于悬浮细胞培养的植物细胞工厂策略，通过基因工程手段实现花青素的高通量、生态可持续生产。
研究方法
2.1 植物材料
以刺葡萄未成熟胚诱导的愈伤组织细胞系"CLR-a"为研究材料。每20天继代培养一次，培养基为MS培养基，添加1.0 mg/L 2,4-D、0.6%琼脂和3.0%蔗糖，pH 5.8。培养温度25 ± 2°C，光周期为16小时光照/8小时黑暗。收获的细胞材料在−80°C下保存，最长不超过两个月用于后续实验。
【数据】材料：刺葡萄愈伤组织细胞系CLR-a；培养基：MS + 1.0 mg/L 2,4-D + 0.6%琼脂 + 3.0%蔗糖；pH：5.8；温度：25 ± 2°C；光周期：16h光照/8h黑暗；继代周期：20d；保存：−80°C，最长2个月
2.2 VdUFGT基因克隆
取20天培养的葡萄细胞提取RNA。使用RNArep Pure Plant Plus Kit（天根，北京）提取总RNA，并评估RNA的完整性、质量和浓度。cDNA合成使用EasyScript® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（全式金，北京）。RNA和cDNA分别于−80°C保存，最长不超过1个月和2个月。以葡萄cDNA为模板扩增UFGT基因，PCR引物见表S1。扩增产物经纯化后连接至pLB克隆载体，转化至Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell（全式金，北京），通过电泳和测序验证。
【数据】试剂盒：RNArep Pure Plant Plus Kit（天根）；cDNA合成：EasyScript® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix；转化菌株：Trans1-T1；保存条件：RNA −80°C最长1个月，cDNA −80°C最长2个月
2.3 载体构建与遗传转化
pBI121-GFP载体经BamHI和XmaI双酶切线性化。设计含载体同源臂序列的UFGT特异性引物扩增UFGT基因，通过同源重组方式将含载体同源序列的UFGT片段整合至pBI121-GFP载体。构建程序按照pEASY-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit（全式金，北京）说明书操作。重组载体经PCR和测序确认后导入农杆菌GV3101。随后进行农杆菌介导的葡萄细胞UFGT过表达遗传转化。葡萄细胞在农杆菌重悬液中浸泡10–12分钟，然后在含3.0%蔗糖、0.6%琼脂和100 μmol/L乙酰丁香酮（AS）的固体MS培养基上共培养60小时。随后将愈伤组织细胞系转移至含1.0 mg/L 2,4-D、0.6%琼脂、3.0%蔗糖、50 mg/L卡那霉素（Kan）和120 mg/L替门汀（Tim）的MS培养基中，pH 5.8。抗性葡萄细胞用于后续阳性鉴定。
【数据】载体：pBI121-GFP；酶切：BamHI和XmaI双酶切；农杆菌菌株：GV3101；浸染时间：10–12min；共培养：60h，含100 μmol/L AS；筛选抗生素：50 mg/L Kan + 120 mg/L Tim；培养基：MS + 1.0 mg/L 2,4-D + 0.6%琼脂 + 3.0%蔗糖，pH 5.8
2.4 阳性转化细胞系检测
使用荧光蛋白手持灯（LUYOR-3415，上海）观察抗性细胞系。呈现绿色荧光特征的细胞系初步鉴定为阳性转化细胞系。这些阳性细胞系经过三代进一步筛选，逐步降低抗性浓度，随后转移至不含抗生素的含1.0 mg/L 2,4-D固体MS培养基中继续继代培养。提取基因组DNA进行PCR和测序验证转化。UFGT亚细胞定位使用FV1200共聚焦显微镜（Olympus，东京）观察。
【数据】筛选设备：LUYOR-3415荧光蛋白手持灯；共聚焦显微镜：FV1200（Olympus）；筛选代数：3代
2.5 UFGT对细胞生长和代谢产物产生的影响
在25天时对WT和VdUFGT转基因细胞系进行表型观察、生长评估及花青素和类黄酮含量测定。生长评估采用增殖系数计算，定义为增殖质量与接种质量之比（g）。花青素和类黄酮的测定按照Lai等人（2022）先前描述的方法进行。基于上述产物测定结果筛选花青素高产细胞系。培养25、35和45天的葡萄细胞用于进一步探索不同培养时长下的代谢物积累。
【数据】测定时间点：25d；增殖系数：增殖质量/接种质量（g）；测定方法：参照Lai et al., 2022
2.6 RNA-seq分析
为提高代谢物合成与积累效率，葡萄细胞系在含1.0 mg/L 2,4-D、3.0%蔗糖、pH 5.8的液体MS培养基中培养。RNA-seq分析中，WT（DLR-a）和UFGT过表达细胞系的悬浮细胞培养10天。RNA提取使用RNAprep Pure Plant Plus Kit with Polysaccharides & Polyphenolics-rich（天根，北京）。RNA测序由百迈客生物技术公司（北京）完成。参考葡萄基因组为Vitis vinifera PN40024.v4（http://plants.ensembl.org/Vitis_vinifera/Info/Index），用于后续转录组分析。基因表达水平以每千碱基转录本每百万映射读段的片段数（FPKM）评估（Trapnell et al., 2010）。基因本体论（GO）、直系同源簇（COG）和KEGG通路富集分析按照先前详述的方法进行（Conesa et al., 2005; Mao et al., 2005; Tatusov et al., 2000）。
【数据】培养方式：液体MS + 1.0 mg/L 2,4-D + 3.0%蔗糖，pH 5.8；培养时间：10d；参考基因组：Vitis vinifera PN40024.v4；表达量指标：FPKM
2.7 RT-qPCR分析
使用上述RNAprep Pure Plant Plus Kit从8、10和12天的WT和转基因细胞系中提取总RNA。cDNA合成使用PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara，大津，日本）。定量逆转录PCR（RT-qPCR）使用TB Green® Premix Ex Taq™（Takara，大津，日本）在LightCycler® 480（Roche Applied Science，巴塞尔，瑞士）上进行。PCR引物基于参考基因组和转录组数据设计，列于表S1。以ɑ-tublin为参考基因，采用2-ΔΔct方法计算相对表达水平。
【数据】时间点：8、10、12d；RT-qPCR试剂：TB Green® Premix Ex Taq™；仪器：LightCycler® 480；内参基因：ɑ-tublin；计算方法：2-ΔΔct
2.8 非靶向代谢组学分析
UPLC-MS/MS分析由百迈客生物技术公司（北京）完成，使用配备Agilent SB-C18色谱柱（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）的Shimadzu Nexera X2 UHPLC系统（岛津公司，京都，日本）。色谱柱洗脱的代谢物通过电喷雾电离（ESI）-三重四极杆-线性离子阱（QTRAP）-质谱仪（AB Sciex 6500 QTRAP UPLC/MS/MS系统）检测。色谱和质谱条件按照Xiao等人（2022）先前描述的方法设置。MS数据采集和处理遵循Chen等人（2013）先前研究的方法。
【数据】色谱柱：Agilent SB-C18（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）；质谱：AB Sciex 6500 QTRAP；方法参照：Xiao et al., 2022；Chen et al., 2013
2.9 悬浮细胞系中花青素、类黄酮和原花青素的测定
在液体悬浮培养基中培养8、10和12天的WT和过表达细胞用于显微镜观察。细胞经洗涤和过滤后收集用于产物提取。花青素、类黄酮和原花青素的测定按照Lai等人（2022）先前描述的方案进行。
【数据】培养时间：8、10、12d；测定方法：参照Lai et al., 2022
2.10 花青素生产植物细胞工厂系统
悬浮细胞培养12天后收获，进行真空冷冻干燥。花青素提取使用含2%甲酸的80%乙醇提取溶剂，液料比为20:1（mL/g）。花青素提取液经0.22 μm滤膜过滤获得纯净上清液。乙醇提取液随后在38°C下使用旋转蒸发仪（环晨RE-5205，郑州）配合循环水真空泵（环晨SHZ-D（III），郑州）浓缩，获得浓缩花青素溶液。选择AB-8树脂进行进一步纯化，树脂首先在无水乙醇中浸泡24小时确保充分溶胀后装柱。层析柱随后用无水乙醇洗涤，再用蒸馏水洗至无白色浑浊，继续用蒸馏水洗涤至无乙醇残留。层析柱随后用5%盐酸洗涤至流出液呈酸性，浸泡2–4小时，然后继续后续操作。
【数据】培养时间：12d；提取溶剂：80%乙醇 + 2%甲酸；液料比：20:1（mL/g）；滤膜：0.22 μm；浓缩温度：38°C；旋转蒸发仪：环晨RE-5205；纯化树脂：AB-8；树脂预处理：无水乙醇浸泡24h；盐酸浓度：5%，浸泡2–4h
研究结果
3.1 UFGT基因克隆、载体构建与遗传转化
以刺葡萄细胞cDNA为模板成功克隆VdUFGT基因。PCR扩增结果如图1A所示，获得预期大小的1500 bp PCR片段。PCR产物经纯化后连接至pLB克隆载体。验证PCR和电泳结果如图1B所示。测序揭示1469 bp序列，开放阅读框为1371 bp，编码456个氨基酸残基。pBI121-VdUFGT-GFP融合载体的结构示意图如图1C所示。此外，图1D展示了pBI121载体的线性化以及含载体同源臂的VdUFGT基因。pBI121-VdUFGT-GFP构建体通过菌落PCR成功验证（图1E），并经测序确认。农杆菌介导的VdUFGT遗传转化结果显示，葡萄细胞在卡那霉素选择压力下逐渐褐变，形成部分抗性愈伤组织，在荧光灯下呈现绿色荧光信号（图1F）。
【数据】PCR片段：1500 bp；测序序列：1469 bp；开放阅读框：1371 bp；编码氨基酸：456个
3.2 转基因细胞特征与花青素高产细胞系筛选
转基因筛选鉴定出4个阳性葡萄细胞系（图2A），这些细胞系呈现绿色荧光信号，但随着培养时间延长，由于细胞衰老，荧光信号减弱或消失。因此，便携式荧光激发灯有助于对转化细胞进行全面的全阶段体内观察和筛选。这4个阳性葡萄细胞系通过DNA-PCR进一步验证（图2B）。亚细胞定位分析显示VdUFGT定位于细胞质和细胞核（图2C），提示其在相关过程中可能发挥作用。WT和4个VdUFGT转基因细胞系均呈现不同程度的红色（图2D）。转基因细胞系表面通常呈现深红色，而WT呈浅红色，表明转基因细胞系中花青素积累更高。增殖系数结果显示不同细胞系之间无显著差异（图2E），表明VdUFGT过表达对葡萄细胞生长无显著影响。过表达细胞系的花青素含量显著高于WT细胞系，其中vgt3细胞系达到195.2 μg/g（FW），较WT提高4.2倍（图2F）。然而，vgt3的类黄酮含量显著低于WT细胞系（1504.6 μg/g FW）（图2G）。这一差异可能归因于花青素是末端代谢产物而类黄酮是中间代谢产物。因此，VdUFGT过表达促进了花青素积累，vgt3被鉴定为高产细胞系用于后续利用。
【数据】阳性细胞系：4个；vgt3花青素含量：195.2 μg/g（FW），WT的4.2倍；WT类黄酮含量：1504.6 μg/g FW
3.3 VdUFGT上调促进不同培养时长下的花青素积累
VdUFGT过表达显著增强了vgt3细胞系的花青素积累。表型观察显示，WT和vgt3细胞系的颜色强度随培养时间延长而增加，vgt3的红色调比WT更为突出（图3A），表明花青素积累更高。vgt3细胞系中VdUFGT的相对表达量在25天时增加了26.3倍（图3B）。尽管该表达量在35天和45天时有所下降，但仍维持在相对较高水平。相比之下，WT中VdUFGT的表达几乎检测不到。此外，vgt3比WT表现出更快的颜色变化，花青素含量在25天时达到191.7 μg/g（FW），在35天和45天时分别增加到220.1和286.9 μg/g（FW）（4.6倍）（图3C）。花青素定量分析显示，VdUFGT过表达产生的花青素水平是WT的3.3–4.8倍。vgt3细胞系中的原花青素含量在25天时显著低于WT，但在培养后期超过WT。原花青素含量在45天时升至2873.3 μg/g（FW），显示2.1倍增加（图3D）。相反，类黄酮含量呈现与花青素和原花青素相反的趋势。vgt3细胞系中的类黄酮水平显著低于WT，尽管差异随培养时间延长逐渐缩小（图3E）。这种对比性积累模式可能归因于类黄酮作为中间产物，而花青素和原花青素作为末端代谢产物。总体而言，VdUFGT过表达在不同培养阶段显著促进了葡萄细胞系中花青素的生物合成和积累。
【数据】vgt3中VdUFGT相对表达：25d时增加26.3倍；花青素含量：25d为191.7 μg/g FW，35d为220.1 μg/g FW，45d为286.9 μg/g FW（4.6倍）；VdUFGT过表达花青素水平：WT的3.3–4.8倍；原花青素含量：45d为2873.3 μg/g FW（2.1倍）
3.4 RNA-seq显示靶通路的激活
由于葡萄细胞顶部与培养基之间缺乏直接接触，大多数葡萄细胞无法从固体培养基中获得充足营养。因此，将葡萄细胞转移至液体培养基进行悬浮培养以获得最佳实验材料。悬浮培养10天后WT和vgt3细胞系的生长状态如图4A所示。WT细胞呈浅红色，而vgt3细胞呈深红色。此外，vgt3转基因细胞在共聚焦显微镜下显示绿色荧光信号（图4B），表明UFGT具有高基因表达和蛋白质活性。为全面研究VdUFGT过表达引起的基因表达变化，进行了RNA-seq分析。数据质量、比对信息、基因本体论（GO）和直系同源簇（COG）分析分别见表S2和表S3以及图S1和图S2。在WT和vgt3细胞系中共鉴定出5113个差异表达基因，包括2509个上调基因和2604个下调基因（图4C和D）。KEGG富集分析揭示显著富集通路，包括MAPK信号通路、淀粉和蔗糖代谢、植物-病原体互作、植物激素信号转导、苯并噁嗪类生物合成、半乳糖代谢、类黄酮生物合成、聚糖降解、苯丙烷类生物合成和氰基氨基酸代谢（图4E）。这些通路大多涉及植物生长、信号转导和基础代谢。有趣的是，VdUFGT过表达对靶代谢通路产生显著影响，特别是类黄酮和苯丙烷类。进一步分析表明，在所有代谢通路中，类黄酮生物合成通路是最显著上调的，苯丙烷和异黄酮也受到影响（图4F），表明VdUFGT过表达极大地促进了靶代谢。聚类热图结果显示，类黄酮和花青素生物合成中涉及的许多关键基因上调，包括CHS、CHI、F3H、F3′H、F3′5′H、DFR、UFGT等（图4G）。此外，共鉴定出65个差异表达转录因子基因，包括36个MYB、25个bHLH和4个WD40，统称为MBW复合物，在花青素生物合成中发挥重要作用。其中，MYB被认为是调控该通路的主要转录因子。此外，VdUFGT过表达导致MYB显著上调，其中26个上调和10个下调。因此，VdUFGT在促进花青素生物合成中涉及的结构基因和调控基因MYB的表达方面发挥了重要作用。
【数据】差异表达基因：5113个（2509个上调，2604个下调）；转录因子：65个（36个MYB，25个bHLH，4个WD40）；MYB：26个上调，10个下调
3.5 RT-qPCR分析揭示VdUFGT促进上游基因表达
前期转录组分析表明，VdUFGT过表达显著上调了类黄酮生物合成通路中的多个关键基因。RT-qPCR结果进一步验证了这些发现。VdUFGT过表达导致类黄酮通路相关基因上调，但ANR-b（ID: Vitvi13g04712）除外。这些基因包括CHS（查尔酮合酶）、CHI（查尔酮异构酶）、F3H（黄烷酮3-羟化酶）、F3′H（类黄酮3′-羟化酶）等。
【数据】上调基因：CHS、CHI、F3H、F3′H等；例外基因：ANR-b（ID: Vitvi13g04712）
3.6 代谢组学分析与类黄酮差异代谢物积累
代谢组学分析进一步验证了VdUFGT过表达对类黄酮代谢的促进作用。差异积累代谢物（DAMs）统计分析显示，KEGG分析表明花青素和类黄酮生物合成通路显著富集。DAM统计和聚类热图展示了不同代谢物的积累模式。
【数据】显著富集通路：花青素生物合成、类黄酮生物合成
3.7 悬浮细胞培养与代谢物定量测定
悬浮细胞培养和显微镜观察展示了vgt3在不同培养时长的细胞状态。在不同培养时长下测定了花青素、类黄酮和原花青素的含量，进一步验证了VdUFGT过表达对代谢产物积累的促进作用。
【数据】测定指标：花青素、类黄酮、原花青素；培养时长：多个时间点
3.8 花青素生产植物细胞工厂
植物细胞工厂生产花青素的工艺流程包括：细胞培养、细胞收集、花青素提取、产物纯化、液体浓缩、真空冷冻干燥获得粉末。花青素溶液在不同条件下呈现多种显色效果。小规模植物细胞工厂在12天内实现花青素产量4.11 mg/g（DW），为WT细胞系的8.5倍，纯化冻干花青素粉末得率达3.17%。
【数据】花青素产量：4.11 mg/g（DW）；培养时间：12d；产量倍数：WT的8.5倍；冻干粉末得率：3.17%
讨论与解读
4.1 全阶段荧光观察为阳性细胞转化筛选提供高效策略
报告基因在阳性转基因筛选中发挥关键作用，显著加速了筛选进程。绿色荧光蛋白（GFP）由238个氨基酸残基组成，最初从水母Aequorea victoria中分离获得，1992年被克隆。GFP在秀丽隐杆线虫中异源表达后，成为哺乳动物和非哺乳动物系统中流行的基因表达报告分子。Tsien团队通过定点突变和随机突变获得新的GFP衍生物，阐明了发光机制。GFP及其突破性贡献使下村脩、Martin Chalfie和Roger Tsien获得2008年诺贝尔化学奖。增强型绿色荧光蛋白（EGFP）作为广泛使用的报告分子，包含两个突变——发色团区域的Phe64至Leu和Ser65至Thr，这些突变导致荧光显著增强。
4.2 VdUFGT过表达对花青素生物合成的全局激活
本研究通过转录组和代谢组整合分析证明，VdUFGT过表达不仅直接促进花青素合成，还激活了类黄酮通路上游多个结构基因的表达，包括CHS、CHI、F3H、F3′H等。同时，MBW转录因子复合物中MYB基因的显著上调表明VdUFGT可能通过调控转录水平实现通路的全局激活。这种"全通路刺激"效应解释了花青素含量的大幅提升，也为植物细胞工厂的高效生产提供了理论基础。
编译者解读
本研究采用"单基因过表达+悬浮细胞培养"策略，以UFGT为切入点实现了花青素生物合成通路的全局激活，体现了合成生物学中"关键节点调控"的巧妙思路。4.11 mg/g（DW）的产量和8.5倍的提升幅度展示了植物细胞工厂的工业化潜力。然而，从实验室规模到工业放大仍面临细胞系稳定性、培养成本等挑战。将转录组与代谢组联用解析全局调控机制的方法值得借鉴，为其他植物天然产物的细胞工厂开发提供了可复用的技术范式。
参考来源
Lai, G. (2024). Whole-pathway stimulation of anthocyanin biosynthesis by UDP-glycose: Flavonoid glycosyltransferase gene (UFGT) providing new insights into natural product development based on plant cell factory. Food Bioscience, 105409. DOI: 10.1016/j.fbio.2024.105409
DOI: 10.1016/j.fbio.2024.105409