来源：Synthetic metabolic transducers in Saccharomyces cerevisiae as sensors for aromatic permeant acids and bioreporters of hydrocarbon metabolism（Biosensors and Bioelectronics）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
芳香族有机酸是烃类降解过程中的关键代谢产物，也是土壤和地下水污染的重要标志物。然而，目前酵母生物传感器可检测的化学物质范围极为有限。本研究将细菌中的变构转录因子MarR和PdhR引入酿酒酵母，构建了可检测苯甲酸盐、水杨酸盐和丙酮酸的模块化生物传感器。工程菌株对浓度低至2 fM的化学物质表现出快速响应和强荧光输出，并能在多种复杂培养基中稳定工作，为实时监测烃类代谢和环境污染物检测提供了新工具。
研究背景
微生物将烃类转化为甲烷的过程是油污生态系统中的重要生物过程。芳香族有机酸（如儿茶酚、苯甲酸和水杨酸）是多环芳烃等复杂烃类降解过程中的关键代谢物，也是地下水污染的主要化合物。渗透性有机酸可在生物组织中积累并进入生态系统食物链，具有重要的生态意义。例如，苯甲酸盐可在细胞质中积累，降低细胞质pH和质子动力势；水杨酸是植物防御调节因子，可通过果蔬摄入进入人体饮食。
然而，现有酵母生物传感器可检测的化学物质范围十分有限。本研究旨在通过招募细菌变构转录因子，扩展酵母生物传感器的可检测化学物质谱系，为设计模块化酵母生物传感器奠定新基础。
研究方法
2.1 化学试剂
本研究使用的化学品均为分析纯级（99-100%），大部分购自Sigma-Aldrich（德国Schnelldorf），其他试剂购自中国商业渠道。酵母转化（基因组整合）采用醋酸锂方案，包含聚乙二醇（PEG）溶液、10%二甲基亚砜（DMSO）、鲑鱼精子DNA溶液（ssDNA）、10%十二烷基硫酸钠（SDS）和醋酸锂混合物。
用于表征所有工程生物传感器的主要化学物质包括：苯甲酸盐（EC编号：208-534-8，CAS编号：532-32-1）、水杨酸盐（EC编号：204-317-7，CAS编号：119-36-8）、丙酮酸盐（EC编号：204-024-4，CAS编号：113-24-6）、无水硫酸铜451657 MSDS（EC编号：231-847-6，CAS编号：7758-98-7）。蒽（EC编号：204-371-1，CAS编号：120-12-7）用于使用哈茨木霉菌株asemoJ（KY488463）进行烃代谢测试，而废机油（来自中国天津当地汽车修理厂的废弃物）作为复杂烃混合物环境样品使用。
细菌细胞（大肠杆菌DH5α菌株，Life Technology，18263-012）在Luria Bertani（LB）肉汤和2%琼脂平板上培养。转化后的细菌细胞在补充氨苄青霉素（EC编号：200-708-1，CAS编号：69-52-3）的LB培养基中生长。MarR型酵母在合成完全培养基（SDC溶液）中表征，该培养基含2%葡萄糖、6.7 g/L酵母氮碱（YNB w/o AAs）、2 g/L氨基酸混合物及适量比例的所有必需营养素。PdhR型酵母在Bushnell Hass（BH）合成肉汤M350中表征，该培养基仅含必需的微量元素和宏量元素，如硫酸镁（0.20 g/L）、氯化钙（0.20 g/L）、磷酸二氢钾（1.00 g/L）、磷酸氢二钾（1.00 g/L）、硝酸铵（1.00 g/L）和氯化铁（1.00 g/L），不含任何碳源。该培养基最终pH为7.0 ± 0.2，调节至4.5 ± 0.2以适应酵母生长。特定表征时补充特定碳源。酵母提取物蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基也用于酵母细胞培养。所有液体培养基均补充2%琼脂制备固体平板培养基。
【数据】化学品纯度：99-100%；SDC培养基：2%葡萄糖、6.7 g/L YNB、2 g/L AA混合物；BH培养基：硫酸镁0.20 g/L、氯化钙0.20 g/L、磷酸二氢钾1.00 g/L、磷酸氢二钾1.00 g/L、硝酸铵1.00 g/L、氯化铁1.00 g/L；BH培养基pH：7.0 ± 0.2（调至4.5 ± 0.2）；琼脂：2%
2.2 质粒构建
本研究实现的输出（荧光）生成转录单元（TU）包含一个合成启动子，其中MarR（marOp）或PdhR（pdhOp）操纵子序列被插入酿酒酵母组成型CYC1启动子（Hahn等，1985）的已知序列中，该启动子去除了两个UAS（上游激活序列），因此称为pCYC1min（最小CYC1启动子）。酵母增强型绿色荧光蛋白（yEGFP）（Sheff和Thorn，2004）置于合成启动子下游，后接一个短合成终止子Tsynth6（Curran等，2015）。每个电路包含第二个转录单元，用于表达靶向yEGFP基因上游合成启动子的细菌阻遏蛋白MarR（多抗生素抗性受体）或PdhR（丙酮酸脱氢酶复合物调节因子）。
两种阻遏蛋白由Genewiz公司（中国苏州）合成并进行酵母密码子优化。此外，它们与核定位序列（NLS）和HIS标签融合。在DNA水平上，它们两侧为较强的ADH1启动子（pADH1）和CYC1终止子（CYC1t——见图1）。选择MarR和PdhR是因为它们在酿酒酵母中是正交阻遏蛋白，其转录效应可通过有机酸结合来控制。MarR是大肠杆菌marAB操纵子的阻遏因子（George和Levy，1983；Cohen等，1989），当与苯甲酸盐或水杨酸盐结合时无法与DNA结合。PdhR来自枯草芽孢杆菌，是另一种被丙酮酸抑制的阻遏因子（Quail等，1994；Haydon和Guest，1991）。
因此，本研究利用MarR和PdhR工程化酵母细胞，用于检测环境样品/溶液中的推定渗透性有机酸，以及跟踪/调节碳化合物代谢或微生物烃降解。本研究基于图1所示的转录单元（TU）工程化酵母生物传感器（YBB）。MarR在酿酒酵母细胞中表达，构建能够响应苯甲酸盐和水杨酸盐的生物传感器，而PdhR用于特异性检测丙酮酸和监测碳化合物代谢。
每个DNA序列根据Green和Sambrook（2018）的方法，通过降落聚合酶链反应（PCR）从质粒中提取。为此，使用Q5 Hot-Start聚合酶（NEB-M0493S）。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检查，并使用AxiPrep DNA提取试剂盒（Axigen-AP-GX-250）洗脱。本研究构建的所有合成质粒使用两种骨架载体，即酵母整合穿梭载体pRSII405（https://www.addgene.org/35440/）和pRSII406（https://www.addgene.org/35442/），由Steven Haase馈赠（Chee和Haase，2012）。这些质粒列于补充表S1，连同Genewiz公司（中国苏州）制造的质粒。所有穿梭载体用Acc65I（NEB R0599S）和SacI（NEB-R0156S）酶切，而构建转录单元所需的所有DNA片段通过Gibson方法（Gibson，2009）整合到切开的骨架中。所有质粒在体外构建，然后通过热激（42°C，30秒）转化插入大肠杆菌DH5α菌株。转化后的细胞在含100 mg/mL氨苄青霉素的LB平板（细菌蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、NaCl 1%、琼脂1.5%）上37°C过夜培养。组装后的质粒通过Sanger测序验证序列正确性。
【数据】PCR酶：Q5 Hot-Start聚合酶（NEB-M0493S）；限制酶：Acc65I（NEB R0599S）、SacI（NEB-R0156S）；热激转化：42°C、30秒；LB平板：细菌蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、NaCl 1%、琼脂1.5%；氨苄青霉素：100 mg/mL；培养温度：37°C；培养时间：过夜
2.3 酵母菌株构建
本研究构建的所有质粒整合到酿酒酵母菌株CEN.PK2-1C（MATa; his3D1; leu2-3_112; ura3-52; trp1-289; MAL2-8c; SUC2）的基因组中，该菌株由天津大学元英进教授惠赠。进行酵母整合时，质粒用适当的限制酶线性化：BstEII（NEB-R0162L）在表达MarR或PdhR的质粒的LEU2标记内切割，StuI（NEB-R0187V）在表达yEGFP的质粒的URA3标记内切割。质粒基因组整合按照Gietz和Woods（2002）描述的标准醋酸锂方案进行。
转化后的酵母细胞在含2%琼脂和2%葡萄糖的选择性合成培养基平板上（分别缺乏亮氨酸或尿嘧啶）30°C培养约48小时。所有选定的菌落在SDC（含MarR的转化子）或BH培养基（含PdhR的转化子）中生长24小时。基础荧光（即在无任何诱导物的情况下）使用配备Tecan i-control 1.11.1.0程序的TECAN NanoQuant Infinite M200机器测量。yEGFP激发和发射波长分别设置为476和512 nm（Sheff和Thorn，2004）。同时从1:100稀释样品（OD600-1:100）测量吸光度，平均细胞荧光强度水平⟨FI⟩计算为：
⟨FI⟩ = 样品(FIT/(100 × OD600-1:100)) − 背景(FIT/(100 × OD600-1:100))
其中FIT是酶标仪检测的总荧光强度；样品为工程菌株，背景为CEN.PK2-1C菌株。在无诱导物条件下表现出低而稳定荧光的菌株被选择用于进一步的流式细胞术表征。本研究构建的所有酵母菌株见表S3。
【数据】酵母菌株：CEN.PK2-1C；线性化酶：BstEII（NEB-R0162L，LEU2标记）、StuI（NEB-R0187V，URA3标记）；转化方法：醋酸锂方案；培养温度：30°C；培养时间：约48小时（平板）、24小时（液体）；yEGFP激发波长：476 nm；发射波长：512 nm；稀释倍数：1:100
2.4 流式细胞术
选定的工程酵母菌株根据以下方法进行表征。
【数据】原文未详述
研究结果
3.1 工程酵母生物传感器对化学诱导的响应
本研究构建的基于转录的酵母生物传感器采用来自细菌细胞的正交转录因子蛋白。MarR型菌株检测渗透性有机酸（苯甲酸盐和水杨酸盐），而携带PdhR的菌株感知丙酮酸。所有菌株在对应化学物质存在时均表现出相对于无化学物质溶液显著增强的荧光（见图2及图S1-8）。
仅表达yEGFP而无MarR的菌株，即byMM1001（pCYC1min_marOp-yEGFP-Tsynth6）和byMM1002（pCYC1min_2xmarOp-yEGFP-Tsynth6），达到的荧光水平（分别为645.91 ± 78.97和988.43 ± 121.94 A.U.）低于合成生物学中常用的组成型酵母启动子（见表S2）。因此，pCYC1min_marOp和pCYC1min_2xmarOp均可视为中等弱合成启动子。
完整生物传感器在无任何诱导物的情况下，显示了MarR施加的强效阻遏：对含单操纵子的启动子（菌株byMM1159）阻遏率达81.72%，对含两个marOp的启动子（byMM1161——见图2A-F）阻遏率高达90.70%。两种MarR型生物传感器（byMM1159和byMM1161）对苯甲酸盐（图2A和B）、水杨酸盐（图2C和D）或两者的混合物（图2E和F）均表现出相似的荧光模式，其特征是在极低浓度（0.2至20 fM）下突然增加，在200 μM至1 mM诱导物浓度之间下降。
在总共96次诱导中，生物传感器在84种情况下（87.5%）正常工作——即荧光信号在统计学上显著不同于无化学物质时的信号。12次不可靠诱导中至少有11次与平均荧光明显高于未诱导状态相关，但这些数值的误差过大。
在苯甲酸盐诱导下，最高平均荧光水平在64 nM（316.28 A.U.，单marOp）和20 fM（284.25 A.U.，2xmarOp）处检测到。这分别对应于未阻遏启动子（byMM1001和byMM1002）信号的49%和29%，重要的是，相对于无苯甲酸盐状态分别代表2.68倍和3.09倍的增益。值得注意的是，仅0.2 fM苯甲酸盐即可在byMM1159和byMM1161中保证1.90倍和2.40倍的增益。仅两次测量未显示与无苯甲酸盐状态的显著差异（20 fM和2.05 pM，均在pCYC1_marOp上）。有趣的是，byMM1159在0.2 fM和102 pM至40 μM浓度范围内表达的荧光无显著增加。类似地，byMM1161在0.2 fM至200 μM区间内显示相当水平的荧光（见图2A和B）。
关于对水杨酸盐的响应（图2C和D），两种构型均在40 μM浓度达到最大平均荧光表达，远高于苯甲酸盐所需浓度。然而，单marOp构型在0.2 fM至40 μM之间无统计学显著差异，而在5 mM化学物质浓度下不工作。相比之下，2xmarOp在水杨酸盐的任何浓度下均工作，从2.05 pM至200 μM无统计学显著差异。与苯甲酸盐诱导相比，在水杨酸盐存在下，2xmarOp构型（byMM1161）表达最高荧光：319.74 A.U.，对应于开放电路（即无MarR的电路）的32%，相对于未诱导电路为3.48倍增益。单marOp（byMM1159）返回280.36 A.U.（byMM1001荧光的43%，相对于无输入为2.37倍增益）。当仅使用0.2 fM水杨酸盐时再次检测到显著的荧光增加：marOp和2xmarOp分别对应1.83倍和2.53倍增益。总体而言，含两个marOp的生物传感器构型似乎对水杨酸盐反应最强。
用苯甲酸盐和水杨酸盐混合物诱导两种MarR依赖性生物传感器时（图2E和F），最大荧光水平相对于使用单一化学物质没有急剧变化。与苯甲酸盐情况类似，marOp表达最高荧光（304.5 A.U.，即开放电路的47%，相对于无化学物质为2.58倍增益），而2xmarOp不超过279.44 A.U.（28%，3.04倍增益）。marOp仅需2.05 pM的两种化学物质即可达到最佳性能，而2xmarOp需要更高浓度：1.6 μM。苯甲酸盐和水杨酸盐的混合诱导产生了两个独特结果：1）marOp的最高荧光不由宽浓度区间共享，而仅属于单一浓度（而在2xmarOp情况下，0.32 μM至40 μM之间的荧光水平在统计学上相同）；2）2xmarOp未能对0.2 fM的两种化学物质浓度做出适当响应。生物传感器在20 fM时开始工作，相对于无两种化学物质状态显示2.24倍增益。为完整性起见，应注意marOp在0.2 fM苯甲酸盐和水杨酸盐浓度下返回2.03倍增益，在20 fM时增加2.13倍。
总体而言，这三种诱导产生了两种模式：1）最高荧光与开放电路荧光之比（恢复因子）在marOp生物传感器中始终较高（因为marOp开放电路荧光仅为2xmarOp的65%）；2）在化学物质存在下生物传感器的荧光增益性能（ON/OFF比）在每个2xmarOp构型中均高于3，在marOp电路中介于2.38至2.68之间。
考虑到2倍荧光增益作为任何数字电路的最小工作阈值（Rodríguez-Serrano和Hsing，2021；Yu和Marchisio，2021；Zhang和Marchisio，2022），本研究获得的ON/OFF比允许声称每个生物传感器都以可靠方式工作——只要输入浓度不是特别高，即高达200 μM。重要的是，含2xmarOp的生物传感器在苯甲酸盐（2.40）或水杨酸盐（2.53）存在下仅0.2 fM时即显示出显著的ON/OFF比，在两种化学物质暴露下20 fM时为2.24。相比之下，基于marOp的生物传感器仅在两种化学物质存在下（ON/OFF = 2.03）在0.2 fM时超过2倍阈值，在单独苯甲酸盐（1.90）和水杨酸盐（1.83）时非常接近该阈值。将两种化学物质浓度仅增加至20 fM时，每个marOp生物传感器均显示高于2倍的增益（苯甲酸盐：2.03；水杨酸盐：2.10；苯甲酸盐和水杨酸盐混合物：2.13）。
可以得出结论，MarR型生物传感器可以可靠地检测环境中极低含量的苯甲酸盐和水杨酸盐，即从20 fM至200 μM。
分析了两个携带PdhR型生物传感器的菌株（byMM1207和byMM1208），该传感器由两个转录单元组成：pADH1-PdhR-CYC1t和pCYC1min_pdhOp-yEGFP-Tsynth6（见图2G和H）。byMM1197（pCYC1min_pdhOp-yEGFP-Tsynth6）中的启动子被证明相当弱，类似于含marOp的启动子，因为其返回的荧光等于878.00 ± 143.60 A.U.。PdhR被证明是强阻遏因子，因为未诱导菌株byMM1207和byMM1208的荧光分别降至158.05 ± 20.21和206.03 ± 22.50 A.U.。这些值相对于byMM1197对应82.00%（byMM1207）和76.53%（byMM1208）的荧光降低。与MarR型生物传感器类似，byMM1208对仅0.2 fM丙酮酸即响应，荧光增加2.12倍，而byMM1207敏感性较低（1.45倍增益）。丙酮酸诱导的荧光水平高于MarR型传感器上的测量值。
【数据】byMM1001荧光：645.91 ± 78.97 A.U.；byMM1002荧光：988.43 ± 121.94 A.U.；MarR阻遏率：81.72%（单marOp）、90.70%（2xmarOp）；苯甲酸盐最高荧光：316.28 A.U.（64 nM，单marOp）、284.25 A.U.（20 fM，2xmarOp）；苯甲酸盐增益：2.68倍（单marOp）、3.09倍（2xmarOp）；0.2 fM苯甲酸盐增益：1.90倍（byMM1159）、2.40倍（byMM1161）；水杨酸盐最高荧光：319.74 A.U.（2xmarOp，40 μM）、280.36 A.U.（单marOp）；水杨酸盐增益：3.48倍（2xmarOp）、2.37倍（单marOp）；混合诱导最高荧光：304.5 A.U.（marOp）、279.44 A.U.（2xmarOp）；混合诱导增益：2.58倍（marOp）、3.04倍（2xmarOp）；byMM1197荧光：878.00 ± 143.60 A.U.；byMM1207未诱导荧光：158.05 ± 20.21 A.U.；byMM1208未诱导荧光：206.03 ± 22.50 A.U.；PdhR阻遏率：82.00%（byMM1207）、76.53%（byMM1208）；0.2 fM丙酮酸增益：2.12倍（byMM1208）、1.45倍（byMM1207）
讨论与解读
本研究工程化了可检测不同浓度渗透性有机酸（苯甲酸盐和水杨酸盐）和丙酮酸的酵母生物传感器。这些传感器基于来自细菌细胞的转录因子蛋白（MarR和PdhR），对目标化学物质表现出高灵敏度。MarR是负责抑制MarRAB操纵子的基因，通过其作为同源二聚体与启动子区域内两个回文DNA区域（S1和S2位点）的相互作用实现阻遏。当结合配体（如甲萘醌、胡桃醌、2,4-二硝基苯酚、水杨酸钠或苯甲酸盐）后，MarR无法再靶向DNA。
MarR型酵母生物传感器设计为响应苯甲酸盐和水杨酸盐表达yEGFP，而PdhR型生物传感器设计为响应丙酮酸。通过3-sigma方法计算的检测限（LOD）表明，工程细胞可可靠检测飞摩尔量级的分析物浓度。检测范围跨越多个数量级，根据统计学分析（双尾Welch's t检验）和LOD值确定。此外，研究还使用三种生物传感器监测复杂烃代谢过程。
编译者解读
本研究巧妙地利用细菌天然存在的变构转录因子作为传感元件，在酵母中构建了模块化的代谢物检测平台。方法上的亮点在于采用双操纵子配置（2xmarOp）显著提升了传感器的ON/OFF比和检测灵敏度，且将检测限推进到飞摩尔级别。从合成生物学应用角度看，该策略具有良好的可扩展性——理论上可替换不同特异性的转录因子来扩展检测谱系。然而，部分浓度区间内荧光响应的非单调性（如高浓度下的信号下降）提示实际应用时需谨慎设定检测窗口。将传感器应用于真实环境样品（废机油）和微生物降解体系（哈茨木霉-蒽共培养）的验证，展示了从实验室到实际场景转化的可行性。
参考来源
Asemoloye, M.D. Synthetic metabolic transducers in Saccharomyces cerevisiae as sensors for aromatic permeant acids and bioreporters of hydrocarbon metabolism. Biosensors and Bioelectronics, 2023. DOI: 10.1016/j.bios.2022.114897
DOI: 10.1016/j.bios.2022.114897