来源：Directed evolution of glutamate decarboxylase B for enhancing its enzyme activity towards nearly neutral pHs based on error-prone PCR（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
谷氨酸脱羧酶（GAD）催化L-谷氨酸转化为γ-氨基丁酸（GABA）并消耗一个H⁺，但天然GAD仅在pH 3.8–5.0范围内有活性，近中性条件（pH>5.0）下即失活。本研究通过易错PCR对大肠杆菌GadB进行定向进化，结合基于溴百里酚蓝颜色变化的高通量筛选，获得双位点突变体GadBD304G/F433L。该突变体在pH 5.8和6.6下的酶活分别提升935.90%和984.31%。分子对接显示突变体与底物形成更多氢键、结合能更低，C末端远离活性位点，从而拓宽了适用pH范围。
研究背景
GABA是一种四碳非蛋白氨基酸，分子式C₄H₉NO₂，广泛存在于动物、植物和微生物中。与蛋白氨基酸不同，GABA的氨基位于γ-碳而非α-碳，因此不参与蛋白质合成。GABA首次在马铃薯块茎中被发现，1950年Robert和Frankel发现哺乳动物脑组织可产生并积累GABA。GABA不仅是植物代谢产物，还作为信号分子参与代谢调控。目前GABA被认为是人中枢神经系统中最重要的抑制性神经递质，可用于治疗抑郁症、阿尔茨海默病和自闭症谱系障碍等精神疾病。GABA还能促进发育中的胰岛细胞分化为β细胞而非α细胞，同时抑制β细胞凋亡，从而降低血糖，为治愈因胰岛β细胞缺失引发的I型糖尿病提供了可能。此外，GABA还具有预防失眠、抗高血压、抗癌、抗炎和抗癫痫等重要生理功能。
GAD是GABA合成途径中的关键酶，催化谷氨酸或谷氨酸钠的不可逆α-脱羧反应生成GABA。目前对微生物GAD的研究主要集中在寻找新基因资源和分子修饰以提高酶催化活性，而针对近中性pH下提升该酶活性的研究较少。本研究的创新点在于通过定向进化拓宽大肠杆菌来源GadB的适用pH范围。已有一些通过定点突变对Gad进行分子修饰的研究，但据作者所知，这是首次通过随机突变对大肠杆菌GadB进行改造。
研究方法
2.1 菌株与质粒
实验中使用的所有菌株和质粒列于表1。大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌K12和大肠杆菌DH5α购自美国Invitrogen公司。大肠杆菌BL21(DE3)作为目标基因表达的起始菌株，大肠杆菌DH5α作为重组质粒扩增的宿主细胞，大肠杆菌K12作为目标基因扩增和随机突变的起始菌株。重组质粒pETDuet-1-gadB(WT)和pETDuet-1-gadB(RM)以pETDuet-1质粒为载体构建。除非另有说明，大肠杆菌菌株在Luria-Bertani（LB）培养基（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 7.4）中培养，于37 °C摇瓶中增殖。本研究所用引物序列见表2。限制性内切酶、DNA聚合酶和T4 DNA连接酶购自日本Takara公司。氨苄青霉素（Amp）和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）购自美国BBI公司。Sanprep质粒小提试剂盒、胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、Ni-NTA（His标签）预装重力柱和葡聚糖脱盐重力柱购自上海生工生物工程有限公司。L-谷氨酸钠（l-MSG）、甲醇、乙腈、乙酸钠、磷酸二氢钾和2,4-二硝基氟苯购自麦克林公司。Fastpure凝胶DNA提取试剂盒购自诺唯赞生物科技有限公司。
【数据】培养基：LB（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 7.4）；培养温度：37°C；菌株：E. coli BL21(DE3)、K12、DH5α；质粒载体：pETDuet-1
2.2 易错PCR扩增与突变文库构建
以大肠杆菌K12为模板，设计含BamHI酶切位点的上游引物BF和含NotI酶切位点的下游引物BR。在常规PCR反应体系中加入Mn²⁺进行易错扩增。易错PCR反应体系包括：1 μL BF、1 μL BR、5 μL 5 × PCR缓冲液、2 μL 10 × dNTP混合物、5 μL 5 mM MnCl₂、1 μL rTaq和35 μL ddH₂O。易错PCR程序为：95 °C变性5 min；30个循环的95 °C变性30 s、62 °C退火30 s、72 °C延伸90 s；最后72 °C延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后用Fastpure凝胶DNA提取试剂盒纯化。纯化的易错PCR产物用BamHI和NotI限制性内切酶在37 °C双酶切4 h，连接至经BamHI-NotI消化的pETDuet-1质粒载体中。连接产物通过热激法转化入大肠杆菌BL21(DE3)，构建随机突变文库[34]。同时构建野生型对照菌株大肠杆菌BL21(DE3)/pETDuet-1-gadB(WT)。
【数据】PCR体系：1 μL BF + 1 μL BR + 5 μL 5×缓冲液 + 2 μL 10×dNTP + 5 μL 5 mM MnCl₂ + 1 μL rTaq + 35 μL ddH₂O；PCR程序：95°C 5 min；30循环（95°C 30 s，62°C 30 s，72°C 90 s）；72°C 10 min；酶切：BamHI/NotI，37°C，4 h
2.3 诱导表达与突变文库高通量筛选
参照已建立的脂氧合酶突变体高通量筛选（HTS）方法[35]，从含100 μg/mL Amp的LB平板上挑取单克隆大肠杆菌BL21(DE3)/pETDuet-1-gadB(RM)，接种至深孔96孔板的单个孔中，每孔含600 μL LB液体培养基。同时接种大肠杆菌BL21(DE3)/pETDuet-1-gadB(WT)作为阳性对照。在37 °C、200 rpm条件下培养12 h后，取50 μL培养物接种至含600 μL新鲜LB液体培养基的1.5 mL离心管中。重组菌在37 °C、200 rpm培养3 h后，加入IPTG至终浓度0.1 mM，于30 °C、200 rpm继续培养24 h。细胞在4 °C、8000 r/min离心10 min收集，然后用150 μL含1.5 mg/mL溶菌酶的磷酸盐缓冲液（pH = 6.0）重悬。样品在37 °C孵育30 min，冻融3次以实现细胞破碎。4000 r/min离心10 min后，上清即为粗酶液。在96孔板中，每孔加入200 μL 0.01 M磷酸盐缓冲液（含0.05 g/L溴百里酚蓝、1 mM PLP、100 mM l-MSG溶液，pH = 6.0），于45 °C保温10 min。每孔加入10 μL粗酶液，在45 °C反应30 min，观察每孔颜色变化。溴百里酚蓝在pH 6.0–7.6范围内颜色由黄色变为绿色再变为蓝色。若指示剂颜色由黄色变为绿色或蓝色，表明该酶在近中性pH下仍具有GAD活性。同时，酶催化活性越高，指示剂颜色越深。
【数据】筛选体系：96孔板，600 μL LB/孔；IPTG终浓度：0.1 mM；诱导条件：30°C，200 rpm，24 h；溶菌酶浓度：1.5 mg/mL；缓冲液pH：6.0；溴百里酚蓝：0.05 g/L；PLP：1 mM；l-MSG：100 mM；反应条件：45°C，30 min；离心：8000 r/min，10 min，4°C
2.4 酶活测定
取50 μL适当稀释的酶液加入500 μL预热至45 °C的底物溶液（含1 mM PLP、100 mM l-MSG的0.2 M磷酸盐缓冲液，pH = 6.0）中。快速混匀后，在45 °C反应10 min，然后迅速将样品放入沸水浴中10 min终止反应。通过高效液相色谱（HPLC）测定反应生成的GABA含量，以确定突变酶的活性[36]。GABA测定方法：取100 μL反应混合物转移至1.5 mL离心管中，加入200 μL 1 M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH 10.0），随后加入100 μL 80 g/L的丹磺酰氯丙酮溶液，再加入600 μL蒸馏水形成1 mL反应体系。样品在80 °C水浴中孵育40 min进行衍生化。之后加入100 μL 10%乙酸终止反应。溶液在12,000 ×g离心5 min，上清经0.22 μm滤膜过滤[38]。样品采用梯度洗脱分离。操作条件如下：色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse Plus C18（4.6 × 250 mm，5 μm）；紫外检测波长254 nm；柱温30 °C；进样量15 μL；流动相流速1 mL/min。流动相A由四氢呋喃:甲醇:50 mM乙酸钠（用冰乙酸调至pH 6.2）[5:75:420，v/v]组成，流动相B为甲醇。以相同条件下野生型GAD的反应作为对照。一个GAD活性单位（U）定义为在反应条件下每分钟生成1 μg GABA所需的酶量。
【数据】反应体系：50 μL酶液 + 500 μL底物（0.2 M磷酸盐缓冲液，1 mM PLP，100 mM l-MSG，pH 6.0）；反应条件：45°C，10 min；衍生化：80°C，40 min；色谱柱：C18（4.6 × 250 mm，5 μm）；检测波长：254 nm；柱温：30°C；进样量：15 μL；流速：1 mL/min
2.5 野生型与突变酶的表达与纯化
初筛获得的突变菌株和野生型菌株分别接种至10 mL LB液体培养基中，在200 r/min、37 °C条件下培养12 h。培养物按1.0%接种量接种至50 mL LB培养基中，相同条件下培养至OD₆₀₀达到0.6–0.8。随后加入终浓度0.1 mM的IPTG，温度调至30 °C诱导表达24 h。培养物在8000 r/min离心10 min，收集细胞并用0.01 M磷酸盐缓冲液重悬，然后在冰浴中进行超声破碎。样品在4 °C、4000 r/min离心10 min，收集上清作为粗酶液。由于重组质粒pETDuet-1-gadB在N端表达含6 × His标签的蛋白，因此可使用Ni-NTA（His标签）预装重力柱纯化野生型和突变酶。首先取1 mL粗酶液与等体积的结合/洗涤缓冲液（10 mM咪唑，pH 7.9–8.1）混合，上样至Ni-NTA重力柱，以去除不含6 × His标签的其他蛋白。然后用2 mL洗脱缓冲液（250 mM咪唑，pH 7.9–8.1）洗脱目标蛋白。
【数据】接种量：1.0%；诱导OD₆₀₀：0.6–0.8；IPTG终浓度：0.1 mM；诱导条件：30°C，24 h；离心：8000 r/min，10 min；结合/洗涤缓冲液：10 mM咪唑，pH 7.9–8.1；洗脱缓冲液：250 mM咪唑，pH 7.9–8.1
研究结果
3.1 突变文库构建与高通量筛选
基于溴百里酚蓝指示剂的颜色变化，在大量随机突变体中通过初筛获得了在pH = 6.0下具有高催化活性的突变体GadBD304G/F433L。初筛过程中指示剂的颜色变化如图1A所示。刚加入酶液时，反应液颜色为黄色，野生型酶和随机突变体均相同。在45 °C反应30 min后，8号突变体的反应液变为绿色，而其他突变体和野生型酶的颜色仍保持原来的黄色。进一步诱导表达大肠杆菌BL21(DE3)/pETDuet-1-gadBD304G/F433L和大肠杆菌BL21(DE3)/pETDuet-1-gadB(WT)以测定谷氨酸脱羧酶活性。GadBD304G/F433L的活性比野生型酶GadB(WT)高6.6倍（图1B）。将大肠杆菌BL21(DE3)/pETDuet-1-gadBD304G/F433L和大肠杆菌BL21(DE3)/pETDuet-1-gadB(WT)的质粒送上海生工生物工程有限公司测序，测序结果通过NCBI网站Blast比对分析，结果显示pETDuet-1-gadB(WT)的测序结果与数据库中目标基因序列具有100%同源性，而pETDuet-1-gadBD304G/F433L产生了7个点突变位点，导致2个氨基酸替换（D304G和F433L）。
【数据】筛选pH：6.0；反应条件：45°C，30 min；活性提升：6.6倍；突变位点：7个点突变，2个氨基酸替换（D304G，F433L）
3.2 酶的表达与纯化
通过超声破碎获得粗酶液。GadB(WT)和GadBD304G/F433L经镍柱纯化后脱盐，然后用SDS-PAGE分析（图2）。泳道1、2和3分别为大肠杆菌BL21(DE3)/pETDuet-1、大肠杆菌BL21(DE3)/pETDuet-1-gadB(WT)和大肠杆菌BL21(DE3)/pETDuet-1-gadBD304G/F433L的破碎上清液。泳道4和5分别为GadB(WT)和GadBD304G/F433L的纯化产物。电泳图中重组菌株表达的蛋白分子量与GadB蛋白一致，约为52.6 kDa，纯化后获得的单一条带大小符合预期。
【数据】蛋白分子量：约52.6 kDa；纯化方式：Ni-NTA重力柱
3.3 酶促反应最适pH
酶促反应最适pH测定结果如图3a所示。野生型酶的最适pH为3.4，突变体的最适pH为4.2。两种酶在pH > 4.2时酶活均急剧下降，但突变体的酶活仍显著高于野生型。在pH 4.2时，GadBD304G/F433L的催化活性比GadB(WT)高30.81%。随着pH升高，这一优势更加明显。突变酶在pH 5.0时酶活比野生型提高175.53%，当pH升至5.8和6.6时，提升幅度分别达到935.90%和984.31%。这表明GadBD304G/F433L的有效pH催化范围显著向中性偏移，且催化活性提高。
【数据】野生型最适pH：3.4；突变体最适pH：4.2；pH 4.2活性提升：30.81%；pH 5.0活性提升：175.53%；pH 5.8活性提升：935.90%；pH 6.6活性提升：984.31%
3.4 酶促反应最适温度
将纯酶液与pH 4.2的底物溶液充分混合，在不同温度（20–85 °C）下测定GAD活性，结果如图3b所示。野生型和突变酶的催化活性均随温度升高而增加，最适反应温度均为55 °C，而温度高于65 °C时酶活急剧下降。推测GAD蛋白在65–75 °C发生变性，酶的空间结构被破坏，催化活性丧失。
【数据】温度范围：20–85°C；最适温度：55°C（野生型和突变体均为）；失活温度：>65°C
3.5 突变酶的pH稳定性
GadBD304G/F433L的pH稳定性在pH 3.0、4.2和6.0下测定，结果如图3c所示。酶活随反应时间延长逐渐下降。在pH = 4.2条件下反应25 min后，GadBD304G/F433L的剩余酶活为初始酶活的60.77%，而在pH 6.0和3.0下反应25 min后，几乎全部酶活丧失。可以看出，pH对GadBD304G/F433L的酶活影响很大。
【数据】pH稳定性测试条件：pH 3.0、4.2、6.0；pH 4.2反应25 min剩余酶活：60.77%；pH 6.0和3.0反应25 min：几乎完全失活
3.6 突变酶的温度稳定性
突变酶的温度稳定性测定结果如图3d所示。反应25 min后，各温度下的剩余酶活均降至初始酶活的50%左右。其中，65 °C时剩余酶活最高，为50.02%。可以看出，不同温度对突变酶稳定性的影响差异较大。
【数据】反应时间：25 min；65°C剩余酶活：50.02%；其余温度：约50%
3.7 突变序列分析与结构预测
为探究GadBD304G/F433L酶活提高的原因，构建了蛋白质三维结构模型并进行了分子对接模拟。首先根据基因测序结果获得GadBD304G/F433L的氨基酸序列，在SWISS-MODEL中根据蛋白质一级结构进行同源建模构建空间结构，结果如图4所示。预测结果显示，GadBD304G/F433L的三维结构由6个相同的蛋白单体组成六聚体结构，如图4a所示，其蛋白单体的结构如图4b所示。GadB活性位点存在多个保守氨基酸，包括Phe63、Ser127、Thr212、Asp243、Ala245、His275、Lys276和Arg422[41]。辅因子PLP与Lys276和His275结合形成希夫碱结构，PLP的吡啶环位于Gln163附近，而Gln163对底物结合起重要作用。大肠杆菌GadB在中性条件下失活的原因是PLP-Lys276希夫碱与His465连接形成稳定的醛亚胺结构，导致活性位点被C末端锁定[42]。
在近中性条件下，将底物l-MSG分别与GadB-WT和GadBD304G/F433L的B链进行分子对接。如图5a和b的蛋白表面模型所示，l-MSG成功进入野生型和突变酶的活性口袋。在图5c中，l-MSG与GadB-WT的Ser126、Ser127、Gln163和His275形成5个氢键，结合能为−8.24248 kJ/mol。在图5d中，l-MSG与GadBD304G/F433L的Ser126、Gln163、Ser273、His275和Thr466形成7个氢键，结合能为−9.24664 kJ/mol。因此可以推断，底物进入了野生型和突变酶的活性口袋，并与酶处于良好的结合状态。基于分子对接结果可以推断，突变体GadBD304G/F433L的C末端比野生型酶的C末端离活性位点更远，这使突变酶的适用pH范围向近中性扩展。底物能以更深入的方式进入突变酶的活性位点，且残基Thr466参与了底物结合，有助于底物更精确地接触PLP-Lys276希夫碱结构，因此突变酶在近中性pH条件下的催化活性增强。
【数据】野生型氢键数：5个（Ser126、Ser127、Gln163、His275）；突变体氢键数：7个（Ser126、Gln163、Ser273、His275、Thr466）；野生型结合能：−8.24248 kJ/mol；突变体结合能：−9.24664 kJ/mol
3.8 动力学参数测定
动力学参数测定结果如表3所示。GadBD304G/F433L的K_m、k_cat和k_cat/K_m分别为47.42 mmol/L、126.96 min⁻¹和2.68 L/(min·mmol)，而GadB(WT)的相应值为65.57 mmol/L、90.26 min⁻¹和1.38 L/(min·mmol)。GadBD304G/F433L的K_m小于GadB(WT)，表明GadBD304G/F433L对底物l-MSG具有更好的亲和力。与GadB(WT)相比，GadBD304G/F433L的k_cat和k_cat/K_m均大幅提高。
【数据】突变体K_m：47.42 mmol/L；k_cat：126.96 min⁻¹；k_cat/K_m：2.68 L/(min·mmol)；野生型K_m：65.57 mmol/L；k_cat：90.26 min⁻¹；k_cat/K_m：1.38 L/(min·mmol)
讨论与解读
本研究的创新之处在于通过定向进化拓宽了大肠杆菌来源GadB的适用pH范围。已有一些通过定点突变对Gad进行分子修饰的研究，但据作者所知，这是首次通过随机突变对大肠杆菌GadB进行改造。研究成功获得了突变菌株大肠杆菌BL21(DE3)/pETDuet-1-gadBD304G/F433L，拓宽了pH适用范围并进一步提高了催化活性。通过易错PCR扩增，以pETDuet-1质粒为载体构建重组质粒并转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中。大量随机突变菌株经诱导表达、细胞破碎获得粗酶液后，在pH = 6.0下进行催化反应，利用溴百里酚蓝作为指示剂筛选出优良突变体GadBD304G/F433L。酶学性质研究显示，突变体在pH 5.8和6.6下的活性较野生型分别提升935.90%和984.31%，有效pH催化范围显著向中性偏移。分子对接结果表明，突变体与底物形成更多氢键，结合能更低，C末端远离活性位点，Thr466残基参与底物结合，这些因素共同促进了近中性pH下催化活性的提高。
编译者解读：该研究展示了定向进化在拓展工业酶pH适应性方面的实用价值。选择易错PCR而非定点突变，使筛选空间更大，无需预先了解酶的结构-功能关系，这对缺乏高分辨率结构的酶尤其适用。溴百里酚蓝指示剂筛选策略巧妙地将酶活转化为可视化颜色信号，实现了低成本高通量筛选。但需注意，突变体在pH 6.0和3.0下的稳定性较差，可能限制其在极端工业条件下的应用。未来可考虑结合理性设计对C末端区域进行进一步工程化改造，或通过固定化技术提高酶的稳定性。该工作为GABA的绿色生物制造提供了更宽pH窗口的酶工具，对食品和医药领域的应用具有直接推动意义。
参考来源
Guan F. Directed evolution of glutamate decarboxylase B for enhancing its enzyme activity towards nearly neutral pHs based on error-prone PCR. International Journal of Biological Macromolecules, 2025. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2024.139283
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2024.139283