来源：Biosensor-driven adaptive laboratory evolution and modular pathway engineering for high-level production of nicotinamide mononucleotide in yeast（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
烟酰胺单核苷酸（NMN）具有显著的生理功能，但微生物生产受限于胞内烟酰胺（NAM）池的不足。本研究通过半理性改造转录因子NadR，构建了NAM特异性生物传感器NadR-M6，并整合生长偶联选择平台与适应性实验室进化（ALE），使胞内NAM含量提升7.6倍至6.3 mg/g DCW。最终工程菌株N35在5-L生物反应器中胞内NMN滴度达2.6 g/L，含量为118.5 mg/g DCW，为酵母中烟酰胺衍生高价值代谢物的生物合成提供了新平台。
研究背景
NMN是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）生物合成的关键中间体，调控能量代谢、氧化还原稳态和信号转导。然而，严格的NAD+稳态和代谢周转通常使NAM维持在低水平，形成限制NMN高效转化的关键瓶颈。现有NMN生物合成研究聚焦于代谢途径重构、关键酶定向进化和胞外转运效率提升。例如，Gan等通过敲除竞争代谢分支基因、异源表达烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）和磷酸核糖焦磷酸激酶（PRS）在大肠杆菌中实现NMN的高滴度生产；在毕赤酵母中，半合成和从头合成途径结合BMpnuC转运蛋白可实现葡萄糖或乙醇向NMN的转化（分别为0.98 g/L和1.00 g/L）。系统扩展NAM池并提高其向NMN的转化效率，仍是工程化微生物细胞工厂的关键挑战。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养基
大肠杆菌JM109用于克隆，在Luria-Bertani（LB）培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中于37°C培养，采用液体培养或LB琼脂平板。酿酒酵母CEN.PK2-1C ΔKu70 ΔUra3 ΔLeu2（N01）作为生物传感器构建的基础菌株，在酵母蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）中于30°C培养。携带质粒的酿酒酵母菌株在30°C下培养于缺乏特定营养物的合成完全培养基或筛选培养基（SC-LEU：22 g/L葡萄糖、6.7 g/L无氨基酸酵母氮源碱（YNB）、2 g/L不含亮氨酸的完全补充混合物，pH 6.5）。本研究所用菌株、质粒和引物列于补充材料中。
【数据】LB培养基：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl；温度：37°C；YPD培养基：10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖；温度：30°C；SC-LEU培养基：22 g/L葡萄糖、6.7 g/L YNB、2 g/L CSM-Leu，pH 6.5
2.2 烟酰胺生物传感器的构建与优化
基于pESC-LEU质粒骨架，通过合成NadR、DNA结合位点（DBS）和sfGFP编码序列（GENEWIZ，苏州，中国），并采用重叠延伸PCR（OE-PCR）和Gibson Assembly（E2611；New England Biolabs，美国）组装，构建荧光偶联生物传感器。使用Infinite M200 PRO酶标仪（TECAN，瑞士）在激发/发射波长488/507 nm下测量相对荧光强度。为实现基于生长的高通量筛选，将原始生物传感器质粒中的sfGFP基因替换为从酿酒酵母PCR扩增的URA3编码序列，获得起始菌株pNR8。为优化选择严格性和生物传感器的动态响应，筛选了不同强度的启动子并对DBS进行梯度截短，生成一系列用于进一步优化的菌株（pNR9–17）。通过将各菌株在补充0–60 mM NAM的选择培养基（含1 g/L 5-氟乳清酸（5-FOA）的SC-LEU）中培养来评估生物传感器性能。使用常规分光光度计（Thermo Scientific，美国）在600 nm波长下测量光密度（OD600）监测细胞生长。
【数据】荧光测量：激发/发射波长488/507 nm；筛选培养基：SC-LEU + 1 g/L 5-FOA；NAM浓度范围：0–60 mM；检测波长：OD600
2.3 NadR突变体文库的构建
使用Stratagene GeneMorph II突变试剂盒通过易错PCR（ep-PCR）构建NadR随机突变文库。采用组合活性位点饱和测试（CAST）策略构建智能突变文库，使用KOD-Plus-Mutagenesis试剂盒以简并NNK密码子对每个靶位点密码子进行饱和突变。突变文库用于转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布于含100 mg/L氨苄青霉素的LB平板上进行筛选。纯化的质粒文库随后用于酵母转化（TIANGEN质粒提取试剂盒）。酵母转化子在SC-LEU培养基中过夜培养（30°C，220 rpm）。收集细胞后，在新鲜SC-LEU培养基中将初始OD600调至0.8。将细胞悬液分装至96孔板，每孔120 μL。实验组补充20 mM NAM，对照组加入无菌水。每个处理设置三个生物学重复。平板在30°C、400 rpm条件下培养24小时，随后使用酶标仪（Infinite M200 PRO；TECAN，瑞士）测量荧光强度。
【数据】ep-PCR试剂盒：Stratagene GeneMorph II；CAST策略：NNK简并密码子；氨苄青霉素浓度：100 mg/L；培养条件：30°C、220 rpm过夜；初始OD600：0.8；每孔体积：120 μL；NAM浓度：20 mM；培养条件：30°C、400 rpm、24 h
2.4 分子对接与分子动力学模拟
使用AlphaFold 2（https://github.com/deepmind/alphafold）预测NadR的三维结构。NAM配体结构从PubChem获得（CID: 936）。使用AutoDock Vina（通过UCSF Chimera界面管理）进行分子对接，预测NAM在NadR模型中的结合构象。对接前，在UCSF Chimera中制备NAM配体结构并进行能量最小化。使用PyMOL软件（https://pymol.org/2/）可视化和分析所有分子结构。进行分子动力学（MD）模拟以分析NadR-NAM相互作用。蛋白质体系使用Amber ff19SB力场制备，NAM配体使用GAFF2参数化，原子部分电荷通过基于B3LYP/def2-TZVP量子化学计算的RESP方法分配。复合物溶剂化于TIP3P水盒子（16 Å缓冲层）中，并用Na+/Cl−离子中和。体系经过标准平衡方案：能量最小化（最陡下降法后接共轭梯度法），在位置约束下从5 K逐步升温至303.15 K持续60 ps，并在NPT系综中进行压力平衡。随后在NPT条件（303.15 K，1 bar）下进行500 ns生产模拟，使用2 fs时间步长、SHAKE键约束和9.0 Å非键截断用于短程相互作用，长程静电相互作用使用PME方法模拟。所有模拟均使用GPU加速的Amber 24执行。使用CPPTRAJ进行轨迹分析，通过MM-GBSA方法计算结合自由能。
【数据】MD模拟：Amber ff19SB力场、GAFF2配体参数、TIP3P水盒子（16 Å缓冲）、升温5 K至303.15 K/60 ps、生产模拟500 ns/NPT/303.15 K/1 bar/2 fs步长/SHAKE约束/9.0 Å截断/PME；结合自由能：MM-GBSA方法
2.5 代谢网络重构
工程菌株构建使用CRISPR/Cas9介导的基因编辑系统，质粒和标记物消除采用URA3/5-FOA筛选标记系统。为增强流向NAM积累的生物合成通量，在亲本菌株pNR12中敲除了参与竞争代谢途径的五个基因，包括PNC1（YGL037C，编码烟酰胺酶）、URH1（YDR400W，编码烟酰胺核糖苷水解酶）、SDT1（YGL224C，编码核苷酸酶）、ISN1（YOR155C，编码IMP 5′-核苷酸酶）和NPY1（YGL067W，编码NAD+二磷酸酶）。所得五重敲除菌株命名为N06。随后，菌株N06在生物传感器引导选择下进行ALE以进一步增强NAM通量，获得进化菌株N26。为增强NMN生物合成，对菌株N26进行多模块代谢工程。过表达来自Chitinophaga pinensis的异源基因NAMPT和内源基因NRK1（YNL129W）以建立核心NMN合成模块。此外，为加强前体供应，以菌株N26为底盘，过表达核糖磷酸焦磷酸激酶亚基基因PRS2（YER099C）和PRS3（YHL011C），确保高通量NMN生产所需的磷酸核糖焦磷酸（PRPP）充足供应。另外，过表达编码NAD+合成酶的异源基因（nadE，来自大肠杆菌）和内源基因QNS1（YHR074W）以促进NAD+再生。最后，下调内源基因NMA2（YGR010W，编码烟酰胺单核苷酸腺苷酸转移酶）以最小化产物降解。通过逆转录定量实时PCR（RT-qPCR）分析确认最终工程菌株N35中这些靶基因的mRNA表达水平。
【数据】基因敲除：PNC1、URH1、SDT1、ISN1、NPY1（五重敲除→N06）；过表达基因：NAMPT（来自Chitinophaga pinensis）、NRK1、PRS2、PRS3、nadE（来自大肠杆菌）、QNS1；下调基因：NMA2；验证方法：RT-qPCR
2.6 常压室温等离子体诱变与EVOL细胞驱动的适应性实验室进化
通过常压室温等离子体（ARTP）诱变（120 W，10 L/min氦气流，2 mm距离，190 s暴露）生成携带生物传感器的菌株N06的突变文库。处理后，收集细胞并在5 mL SC-LEU培养基中于30°C复苏。随后，使用自动化微生物进化系统（EVOL cell；洛阳华清天目生物技术有限公司，中国）进行ALE。突变文库预培养至OD600约为2.0，以5%（v/v）接种量接种至筛选培养基。经过14天、7次传代轮的进化后，将培养物涂布于固体培养基。选择生长最快的菌落进行摇瓶验证。
【数据】ARTP参数：120 W、10 L/min氦气流、2 mm距离、190 s暴露；复苏：5 mL SC-LEU、30°C；预培养OD600：约2.0；接种量：5%（v/v）；进化时间：14天；传代轮数：7次
研究结果
3.1 结构引导的直系同源烟酰胺生物传感器工程与优化
NMN通过其代谢转化和细胞内稳态维持间接调控细胞能量代谢和氧化还原平衡。然而，内源NAM可用性有限和代谢分流限制了NAD+补救途径的通量。为实时监测这些生物合成通量并促进高产菌株开发，转录因子NadR被探索作为高通量筛选的生物传感元件。在无NAM条件下，转录抑制因子NadR采用非活性构象并从DBS解离，从而允许sfGFP表达。相反，NAM结合诱导NadR构象变化，使其转化为能够结合DBS的活性形式，从而抑制sfGFP表达（图1A）。NadR对烟酸（NA）的敏感性已被证实，鉴于其结构相似性，推测NadR也可能响应NAM。遗憾的是，pNR1菌株对20 mM NAM表现出弱响应，不适合后续高通量筛选（图1D）。
为增强NAM特异性和响应性，构建了靶向NadR配体结合结构域的ep-PCR随机突变文库。在配体结合口袋内鉴定出八个CAST靶点，分为四个不同的组合突变单元：位点A（E93/V104）、位点B（A119/F132）、位点C（I136/A142）和位点D（L144/H152），生成小型高效的突变文库用于优化（图1B）。经过多轮迭代筛选以获得有利突变体，进化途径产生了稳健的突变体pNR7（图1C）。值得注意的是，pNR7表现出显著提高的灵敏度（荧光强度为pNR1的5%）且对NA的响应可忽略不计（图1D），表明配体结合口袋的重建成功实现了直系同源识别特异性。机制结构分析表明，NadR-M6突变体的优化性能可归因于工程化的底物结合口袋（图1E）。具体而言，口袋底部的突变（E93Y、V104Y、F132Y和I136Y）协同增强局部芳香堆积和疏水相互作用，将配体与Q144之间的距离缩短至3.1 Å。H152M突变进一步强化了该疏水环境。MM/GBSA计算显示，NadR-M6的结合自由能（−31.3 kcal/mol）低于NadR-WT。根据MD模拟，NadR-M6的总均方根偏差（RMSD）低于NadR-WT，反映结构稳定性提高，而突变位点的均方根波动（RMSF）值增加提示局部构象灵活性增强。这种结构可塑性促进了对NAM结合的适应，从而放大变构抑制效应，与观察到的sfGFP抑制效率提高一致。
【数据】pNR7荧光强度：pNR1的5%；配体-Q144距离：3.1 Å；NadR-M6结合自由能：−31.3 kcal/mol；NAM响应浓度：20 mM
3.2 基于生长偶联生物传感器的可调高通量筛选平台构建
生长表型因其简单性和高通量能力而被广泛用作高通量筛选的输出信号。为增强所开发生物传感器的工业适用性，初始荧光报告基因被替换为基于URA3的负筛选系统。在该设计中，NAM水平不足导致URA3基因持续表达，从而将5-FOA转化为毒性代谢物5-氟尿嘧啶。相反，胞内NAM浓度升高抑制URA3表达，从而在含5-FOA的培养基中恢复细胞生长（图2A）。
为拓宽动态范围，对生物传感器组件进行了精确时间控制工程。pNR8–11菌株采用四种不同转录强度和诱导机制的启动子（PTEF、PCYC1、PGAL1和PGAL10）精确调控URA3转录。如图2B所示，pNR8–9在无NAM的5-FOA培养基中表现出快速致死，证明组成型URA3过表达。相比之下，pNR11表现出延迟致死，而pNR10通过诱导型PGAL1启动子实现精确的时间调控，建立了有效的时间依赖性选择系统。接下来，将截短的DBS序列分别引入pNR12–17菌株以微调选择压力（图2C）。结果表明，DBS截短长度显著影响URA3表达，完全致死发生在25–50 h内。值得注意的是，pNR16表现出最高的反选择效率，在16 h内达到50%的细胞致死率。因此，pNR16被确定为最优DNA结合元件，提供适度的选择压力同时产生清晰分化的表型。为评估NAM生物传感器辅助筛选平台的可靠性，在不同NAM浓度下表征了生物传感器菌株的生长表型。如图2D和补充材料所示，检测限从0.50 mM提高至0.05 mM，灵敏度提高10倍。细胞生长呈现明显的剂量依赖性响应，最终OD600和比生长速率与NAM浓度在60 mM以内呈正相关。值得注意的是，在60 mM NAM条件下生长速率增加约23.3倍。这些结果通过斑点试验得到证实，菌落形成随NAM浓度成比例增加（图2E）。该生长偶联生物传感器有效将胞内NAM浓度输入转化为可定量的生长输出，表现出最佳动态范围和灵敏度，为NAM生产菌株的高通量筛选提供了平台。
【数据】pNR16反选择效率：16 h内50%细胞致死率；完全致死时间：25–50 h；检测限：0.50 mM→0.05 mM（灵敏度提高10倍）；最大NAM响应浓度：60 mM；生长速率增加：约23.3倍（60 mM NAM）
3.3 生物传感器驱动的适应性实验室进化增强胞内烟酰胺通量
NAM的胞内稳态取决于其生物合成和消耗通量之间的平衡。为利用生长偶联优势对突变文库施加持续定向进化压力，将ARTP诱变的微生物文库在EVOL自动化培养系统中进行连续培养，从而促进高耐受性表型的快速获得（图3A）。鉴于NAM在微生物细胞内的快速代谢周转，敲除了竞争分支途径中的关键基因（PNC1、URH1、ISN1、SDT1和NPY1），以将通量导向NAD+补救途径（图3B）。
结果表明，菌株N03和N06的胞内NAM含量分别达到0.6和0.8 mg/g DCW，与亲本菌株N01相比分别提高2.6倍和3.7倍（图3C）。为进一步增强NAM通量，通过ARTP诱变构建突变文库，随后使用EVOL细胞培养系统进行连续培养。同时，为严格验证生物传感器驱动选择的必要性，进行了三个平行对照实验：（i）仅ARTP诱变后连续传代而不施加任何选择压力；（ii）施加选择压力连续传代但不进行ARTP预诱变；（iii）完整的ARTP+生物传感器-ALE组合。值得注意的是，仅完整的组合（iii）导致显著的NAM富集（图3D），而对照（i）和（ii）未能产生实质性改善。对于组合（iii），微生物生长在进化过程中受到严重抑制。
【数据】N03胞内NAM含量：0.6 mg/g DCW（N01的2.6倍）；N06胞内NAM含量：0.8 mg/g DCW（N01的3.7倍）；对照实验：3组平行；有效组合：ARTP+生物传感器-ALE
3.4 模块化代谢工程增强烟酰胺单核苷酸生产
基于进化菌株N26中NAM通量的增强，实施了多模块代谢工程策略以将扩大的NAM池转化为NMN，同时减弱下游NAD+消耗以平衡产物积累与细胞活力（图4A）。核心NMN合成模块通过过表达异源NAMPT（来自Chitinophaga pinensis）和内源NRK1建立。前体供应模块通过过表达PRS2和PRS3增强PRPP供应。NAD+再生模块通过过表达nadE（来自大肠杆菌）和QNS1实现。产物降解最小化通过下调NMA2实现。如图4B所示，各模块的逐步整合对NMN产量产生了积极影响。最终工程菌株N35在摇瓶水平表现出优异的NMN积累能力。
在5-L生物反应器中进行的补料分批发酵进一步验证了菌株N35的生产性能。如图5所示，菌株N26和N35的发酵结果显示了不同的生产特征。
菌株N35在5-L生物反应器中达到胞内NMN滴度2.6 g/L，含量为118.5 mg/g DCW。这一结果显著优于已报道的酵母系统，证明了生物传感器驱动进化与模块化代谢工程相结合的策略在NMN生产中的有效性。
【数据】菌株N35：5-L生物反应器、胞内NMN滴度2.6 g/L、含量118.5 mg/g DCW；发酵模式：补料分批
讨论与解读
本研究成功将转录抑制因子NadR工程化为对烟酰胺具有高度特异性响应的生物传感器。在此基础上，整合常压室温等离子体诱变和适应性实验室进化技术，建立了高效的高通量筛选平台，以获得具有优良烟酰胺生物合成能力的菌株。进一步对平台菌株进行工程化改造，通过系统代谢网络重构显著提高了烟酰胺单核苷酸的生产效率。该生物传感器驱动的进化平台通过生长偶联选择增强了胞内前体通量，作为理性设计的补充工具，为工程化酵母细胞工厂生产烟酰胺衍生物和其他NAD(P)H依赖性代谢物提供了稳健框架。
编译者解读：该研究的核心亮点在于将转录因子NadR的配体特异性重塑与生长偶联选择相结合，巧妙地将难以高通量检测的胞内代谢物浓度转化为可量化的生长表型。从合成生物学应用角度看，这种"传感器-进化-代谢工程"三位一体的策略具有良好可移植性——其生长偶联设计规避了荧光激活细胞分选等昂贵设备的依赖，适合工业场景推广。然而，NMN仍以胞内积累为主，分泌效率未在本文中充分讨论，这可能是后续产业化放大时需重点突破的瓶颈。此外，NadR-M6突变体的正交性为其他NAD+前体类似物的传感设计提供了结构参考。
参考来源
期刊：Bioresource Technology, 2026
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135203
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135203