来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
导语
G蛋白偶联受体CXCR4在肿瘤转移、免疫调控中扮演关键角色，是极具潜力的药物靶点。然而，传统膜蛋白药物筛选方法常受制于蛋白纯化困难和活性维持挑战。本文所解读的研究首次将无细胞蛋白合成技术与表面等离子体共振传感芯片原位制备相结合，直接在芯片表面合成功能性CXCR4膜蛋白，构建出高灵敏、免纯化的SPR生物传感器，并成功应用于靶向CXCR4的小分子药物筛选。该方法打通了从基因到功能筛选的快速通道，为膜蛋白药物发现提供了全新工具平台。
研究背景
CXCR4属于趋化因子受体亚家族，其唯一内源性配体CXCL12所介导的信号轴在造血干细胞归巢、肿瘤侵袭转移及HIV病毒入侵等过程中具有重要生物学意义。数十年来，针对CXCR4的拮抗剂研发一直是药物化学热点，AMD3100作为经典小分子阻断剂已于临床获批用于干细胞动员，而各类环肽、抗体及小分子候选药物亦在不断涌现。然而，高效且可靠的体外筛选体系仍严重缺乏。
当前CXCR4药物筛选主要依赖放射性配体竞争结合实验、基于工程细胞株的功能报告基因检测以及生物物理技术如表面等离子体共振（SPR）。放射性配体法存在安全隐患且操作复杂，细胞体系则难以排除胞内信号级联的非特异性干扰。SPR技术能够实时、无标记地监测分子间相互作用，但依赖于将靶标蛋白以高纯度、高活性状态固定在芯片表面。CXCR4为七次跨膜蛋白，其正确折叠和构象维持需要疏水脂质环境，脱离天然膜的纯化过程极易导致蛋白失活、聚集或结构扭曲，极大地限制了基于SPR的定向筛选应用。传统方法通常在去垢剂胶束中纯化受体，再通过亲和标签固定于芯片，步骤冗长且难以保证均一性。
无细胞蛋白合成系统（cell-free protein synthesis, CFPS）通过利用细胞粗提物或重组翻译机器在体外完成转录和翻译，可在数小时内将DNA模板直接转变为目标蛋白。近年来CFPS技术的一大突破在于能够兼容添加脂质体或纳米盘等膜模拟环境，实现膜蛋白的原位共翻译折叠，从而绕过细胞内表达、破膜和纯化的繁琐流程。将CFPS与SPR芯片表面化学偶联相结合，有望一步完成CXCR4的原位合成和定向固定，保持其天然构象并快速完成传感器构建。这正是本研究提出的创新策略。
研究方法
研究团队设计了一条“原位合成—定向锚定—实时分析”一体化的技术路线，具体包括如下关键步骤。
首先，芯片表面功能化处理。采用商品化羧甲基葡聚糖CM5芯片，通过EDC/NHS化学活化表面羧基，进而偶联链霉亲和素。利用链霉亲和素-生物素高亲和力作用定向捕获被生物素标记的抗CXCR4构象敏感单克隆抗体，构建生物素化抗体层。该抗体特异性识别CXCR4胞外第二环空间构象，不仅能作为受体的捕获探针，也确保了后续固定蛋白的取向均一性。同时，在抗体周围布满以PEG链连接的脂质分子，为跨膜区提供类膜支撑环境。
其次，设计线性DNA表达模板。以人源CXCR4编码序列为基础，5′端依次加入T7启动子、核糖体结合位点和N端Flag标签（便于检测），3′端融合生物素化受体肽序列（BioTag）和T7终止子。通过两步PCR扩增获得足量模板，并利用透析膜去除残留引物及短片断杂质。
核心创新在于无细胞蛋白合成与芯片原位固定同步进行。采用基于大肠杆菌提取物的CFPS体系，预先在反应液中外源添加预制纳米盘——由膜支架蛋白MSP1E3D1和磷脂DOPC/ POPC混合脂质组装而成的直径约10 nm的盘状纳米膜。将DNA模板、CFPS混合液和纳米盘按比例混匀后，直接注入已制备抗体的SPR流路通道。反应温度控制在30°C，持续振荡，通过优化镁离子浓度和氧化还原电位，使核糖体在翻译跨膜螺旋区时，新生多肽链能够直接折叠插入纳米盘的脂质双分子层中。C端BioTag在翻译完成后被大肠杆菌内源性生物素连接酶BirA直接生物素化，随即被芯片表面的链霉亲和素通过生物素-亲和素锚定，从而实现新合成受体蛋白在传感界面的特异性定向固定。整个合成与固定过程仅需2小时，随后用缓冲液冲洗去除CFPS残留物及游离组分。
传感芯片构建完成后，即进入SPR筛选流程。通过Biacore T200系统实时监测共振信号变化。首先证实CXCR4在芯片上的原位合成与固定效果；采用抗Flag抗体和多浓度梯度CXCL12进行亲和力验证。之后，对一系列已知结构的小分子候选物进行顺序筛选，包括AMD3100及其衍生物，采用“结合—解离—再生”的循环程序，再生条件用甘氨酸-HCl（pH 2.5）温和处理，以不破坏蛋白构象为限。所有信号扣除参比通道非特异性吸附，并以稳态亲和力模型或动力学模型进行拟合。
研究结果
研究团队通过多项数据证实了基于CFPS原位构建CXCR4-SPR传感器的可行性与优越性能。
表面构建的实时监测显示，在注入CFPS反应混合液后，SPR信号在初期30分钟内缓慢上升，随后在60–120分钟阶段进入快速增长平台，最大响应值达到约1200 RU，与此形成鲜明对比的是不含DNA模板或缺少纳米盘的对照组仅产生不足100 RU的背景结合。这表明CXCR4的合成依赖于翻译体系与纳米盘的共组装，且新生受体能够成功被抗体捕获并稳定固定。
采用抗Flag抗体在芯片上进行脉冲注射，所得结合水平与初始固定量高度相关，验证了N端Flag标签的可及性以及受体朝向一致。以CXCL12为分析物进行动力学分析，测定平衡解离常数KD为2.3 ± 0.4 nM，这一数值与文献报道活细胞表面CXCR4的亲和力（KD常在1–5 nM范围内）高度吻合，有力地表明原位合成的受体呈现天然活性构象。
随后，对靶向CXCR4的临床在研及文献报道的小分子拮抗剂进行了系统筛选。结果显示，AMD3100与CXCR4的结合呈双位点饱和曲线，通过“一高一低”两个亲和力位点模型拟合，高亲和力位点的KD为 12 nM，低亲和力位点KD为 350 nM，与其已知的变构调节特性相符。新型环肽类化合物CTCE-9908结合响应能力约弱于AMD3100一个数量级，KD为 85 nM。进一步测试的六个新合成小分子衍生物中，化合物X4-117呈现出最突出的亲和力，KD为 7.8 nM，且结合信号呈现快速结合-慢速解离特征，解离半衰期长达18分钟，显示出优于先导化合物的潜在成药性。
芯片的重复性和稳定性同样令人满意。经历20次连续的碱基小分子结合-酸再生循环后，CXCR4表面活性信号仅下降8.5%，基线漂移小于2 RU。在批次间重复实验中，以CXCL12为对照测定的KD值变异系数为9.7%。这些结果为该平台进入真实药物筛选工作流奠定了基础。
此外，研究人员利用该传感器进行了片段混合物筛选。将含有若干个分子量150–300 Da的片段库以混合池方式上样，经正相互叠筛和SPR确认，命中一个含噻吩并嘧啶骨架的新型骨架片段，该片段对CXCR4的亲和力达到微摩尔级别，相较于传统生化检测，显著缩短了初筛周期。
讨论与展望
本研究开创性地将无细胞蛋白合成技术与SPR传感器构建相融合，在芯片表面完成了膜蛋白的原位合成、折叠、插入纳米盘与定向固定，真正实现了“从基因到筛选”的全流程免纯化操作。核心技术突破在于双正交固定策略——C端生物素-链霉亲和素锚定与N端构象抗体捕获的协同，使七次跨膜蛋白能够以统一取向排列在传感器表面，最大程度保留了活性位点可及性和信号均一性。
这一策略为CXCR4药物筛选带来了多重优势。第一，彻底绕过了膜蛋白纯化的不确定性，避免因去垢剂选择、纯化标签和长时间操作造成的聚集变性；第二，纳米盘提供近似天然的磷脂双分子层环境，能够稳定CXCR4的空间构象，从而获得与细胞内亲和力高度一致的结果；第三，芯片可耐受多次分析再生，显著降低了大规模筛选的实验成本与靶标消耗。研究展示的原理验证性筛选已命中若干高亲和力先导化合物，验证了平台的实用精度。
当然，现阶段的CFPS-SPR传感器也存在局限。大肠杆菌体系缺少哺乳动物细胞复杂的翻译后修饰，如糖基化和部分脂质修饰，可能影响以糖链为识别表位的抗体或配体的结合特性。未来可尝试引入含微粒体膜的哺乳动物无细胞系统，以实现糖基化受体的原位合成。此外，纳米盘尺寸和脂质组成仍需进一步系统性优化，以适应不同种类的多重跨膜蛋白。技术上，与高通量阵列式SPR或SPR成像体系联用，则有望将片段筛选通量提升数个量级。
从更宏观的视角看，此项工作为“芯片上膜蛋白工厂”概念的落地提供了清晰的范例。该策略可扩展至趋化因子受体家族其他成员以及其他具挑战性的药物靶标（如离子通道、转运体），有望成为药物研发早期阶段的标准工具。结合自动化的CFPS微流控与SPR检测，将真正实现靶标蛋白“即用即合成”，极大压缩从靶标基因序列到筛选命中的时间窗口。
参考来源
> Xiaofei Wang, Yanting Wang, Hao Chen, Ningqi Xia, Jiayu Gu. In situ construction of an SPR biosensor using cell-free protein synthesis technology and its application in drug screening for CXCR4. *Journal of Pharmaceutical Analysis*, 2026, DOI: 10.1016/j.jpha.2026.101613.
DOI: 10.1016/j.jpha.2026.101613