来源：Unveiling mechanistic insights of inactivated Aspergillus niger spore by fishery-waste-derived chitosan via synchrotron radiation tomography（Carbohydrate Polymers）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
黑曲霉是导致侵袭性肺曲霉病的重要病原真菌，常规唑类药物的耐药性问题日益严峻。本研究首次利用同步辐射X射线显微成像技术，结合常规实验手段，在近天然状态下三维可视化观察了来源于虾壳废弃物的壳聚糖对黑曲霉的灭活过程。2.0 g L⁻¹壳聚糖在6小时内实现6.05-log的灭活效率，细胞体积从34.9 μm³骤降至6.5 μm³。该工作不仅鉴定出壳聚糖是一种有效的碳水化合物类抗真菌剂，更凸显了同步辐射成像在解析近天然条件下亚细胞抗菌机制方面的独特优势。
研究背景
侵袭性真菌感染每年影响多达300万人，死亡率居高不下。病原真菌同时造成严重的农业损失和食品安全风险。黑曲霉已被报道为COVID-19重症合并感染的重要病原体，在机械通气患者中死亡率接近50%；孢子吸入与哮喘、慢性肺病和曲霉病密切相关。在农业领域，黑曲霉是水果黑斑病的主要诱因，导致采后腐烂和产量损失。其遗传稳定性和环境适应性使其能在恶劣条件下持续存在。
传统三唑类杀菌剂（如泊沙康唑）仍是一线疗法，但日益增长的耐药性使临床管理复杂化并促进药物滥用。为此，研究者探索了多种替代策略，包括银纳米颗粒、氧化铜纳米颗粒、氧化铁纳米颗粒等金属衍生物。然而，这些方法各有局限。壳聚糖作为一种来源于渔业废弃物的天然多糖，因其生物相容性和抗菌活性受到关注，但其对黑曲霉的详细灭活机制尚不明确。
研究方法
2.1 虾壳来源壳聚糖的制备
废弃虾壳（南美白对虾，Litopenaeus vannamei）取自台湾台南市学甲区当地水产养殖场。虾壳经彻底清洗、煮沸15分钟，并用去离子水冲洗以去除表面杂质。清洗后的虾壳浸入99%丙酮中处理5分钟，然后在80°C下干燥过夜。干燥后的虾壳研磨成细粉供进一步处理。
甲壳素按照Matouri等人（2024）报道的方法从虾壳粉中提取，并稍作修改。该过程包括三个主要步骤：脱矿（DM）、脱蛋白（DP）和脱乙酰（DA）（图1）。DM步骤中，将50 g虾壳粉与9%（v/v）HCl以1:20（w/v）的固液比混合，在300 rpm下搅拌1小时，以去除碳酸钙和其他矿物质成分。悬浮液静置后，倾析上清液，沉淀物反复用去离子水冲洗至中性pH。DP步骤将脱矿材料用5%（w/v）NaOH在90°C下处理12小时，每2小时更换一次新鲜NaOH溶液以确保完全去除蛋白质。最后，所得甲壳素通过脱乙酰作用转化为壳聚糖：简要而言，甲壳素用50%（w/w）NaOH在80°C下处理48小时。所得壳聚糖用去离子水充分洗涤至pH达到6.50，用丙酮冲洗两次，并在50°C下干燥。最终产品在球磨机中于300 rpm研磨6小时，然后进行表征。
【数据】虾壳来源：南美白对虾；HCl浓度：9%（v/v）；固液比：1:20（w/v）；搅拌速度：300 rpm；脱矿时间：1h；NaOH浓度（脱蛋白）：5%（w/v）；脱蛋白温度：90°C；脱蛋白时间：12h；NaOH浓度（脱乙酰）：50%（w/w）；脱乙酰温度：80°C；脱乙酰时间：48h；最终pH：6.50；干燥温度：50°C；球磨转速：300 rpm；球磨时间：6h
2.2 表征
¹H NMR谱使用600 MHz NMR波谱仪（Agilent Technologies，美国）记录，方法参照Sánchez-Machado等人（2024）。样品溶解于CD₃COOD/D₂O（2%，v/v）混合溶剂体系中，在环境温度（298 K）下超声处理20分钟以确保完全溶解。乙酰度（DA%）和脱乙酰度（DD%）分别根据式（1）和式（2）计算。计算基于2.05 ppm处的积分峰面积（对应N-乙酰氨基葡萄糖单元的甲基（CH₃）质子）以及乙酰化和脱乙酰化葡萄糖胺单元H2至H6质子信号的组合积分。
(1) DA% = 2 × I(CH₃) / I(H2−H6) × 100
(2) DD% = 100 − DA%
壳聚糖的黏均分子量采用Wang等人（2022）描述的黏度法测定，并稍作调整。使用含有0.20 mol L⁻¹乙酸和0.20 mol L⁻¹氯化钠的溶剂体系配制浓度为0.10至0.50 g L⁻¹的壳聚糖溶液。各溶液的流出时间在25°C下用乌氏黏度计测量。特性黏度[η]通过将比浓黏度外推至零浓度获得。壳聚糖的黏均分子量（Mv）随后使用Mark–Houwink方程（式（3））计算，其中K（1.64 × 10⁻³⁰ × DD¹⁴）和α（−1.02 × 10⁻² × DD + 1.82）为常数（Qian等人，2023）。
(3) [η] = K × Mv^α
CTS表面形貌的微观结构使用SEM（JEOL-JSM7401F，日本）观察，放大倍数为10,000×，加速电压为3 kV。官能团通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR-4700，JASCO，日本）在4000至400 cm⁻¹光谱范围内以4 cm⁻¹分辨率进行估测。结晶性质使用高分辨率X射线衍射仪（Bruker，美国）获得，扫描速度为1 min⁻¹，2θ范围为5至80°。平均孔径、总孔体积和比表面积使用Micromeritics ASAP 2020吸附分析仪（Micromeritics Inc.，美国）测定。样品的热分解通过热重分析（TGA）使用热重分析仪（PerkinElmer Ltd.，Waltham，MA，美国）在氮气流速20 mL min⁻¹下进行，温度以10°C min⁻¹的速率从40°C升至800°C。
壳聚糖的生物相容性按照Chen等人（2023）描述的方法通过细胞培养和活力测定进行评估。配制不同浓度的壳聚糖，然后浸入4 mL培养基中。NIH-3T3成纤维细胞在50 mL细胞培养瓶中用CO₂培养箱在37°C、5% CO₂条件下培养。收获的细胞重悬于DMEM中，接种到96孔板中培养24小时。之后，每孔加入100 μL MTT溶液，摇动10分钟后在570 nm处测量吸光度以确定细胞活力（式（4））。NIH-3T3细胞培养24小时后进行荧光显微镜观察。细胞首先用荧光素（5 μg L⁻¹，Sigma–Aldrich）在室温下染色2小时，然后用PBS彻底洗涤。随后，细胞核用碘化丙啶（PI；5 μg L⁻¹，Sigma–Aldrich）复染10分钟，再用PBS洗涤。荧光图像使用Leica DM2000荧光显微镜拍摄。
(4) 细胞活力% = (OD样品 − OD空白) / (OD对照 − OD空白) × 100
黑曲霉的电泳迁移率（zeta电位）使用Zetasizer Nano Series ZSP（Malvern Instruments，德国）测量。CTS溶液（1.00 mg mL⁻¹）在25°C下配制，并在超声浴（40 kHz）中分散30分钟以确保完全溶解。对于微生物表面电荷分析，使用100 mL黑曲霉悬浮液（10⁸ CFU mL⁻¹）。Zeta电位测量在10⁻¹ M、10⁻² M、10⁻³ M高氯酸钠溶液中进行，pH用0.01 M HCl或0.01 M NaOH从2.0调节至12.0。所有测量均进行三次重复，结果以平均值±标准差（SD）表示。
【数据】NMR波谱仪：600 MHz；溶剂：CD₃COOD/D₂O（2%，v/v）；超声时间：20min；温度：298K；乙酸浓度：0.20 mol L⁻¹；NaCl浓度：0.20 mol L⁻¹；CTS浓度范围：0.10–0.50 g L⁻¹；测量温度：25°C；SEM放大倍数：10,000×；加速电压：3 kV；FTIR范围：4000–400 cm⁻¹；分辨率：4 cm⁻¹；XRD扫描速度：1 min⁻¹；2θ范围：5–80°；TGA氮气流速：20 mL min⁻¹；升温速率：10°C min⁻¹；温度范围：40–800°C；MTT测量波长：570nm；荧光素浓度：5 μg L⁻¹；PI浓度：5 μg L⁻¹；CTS溶液浓度：1.00 mg mL⁻¹；超声频率：40 kHz；超声时间：30min；A. niger悬浮液：10⁸ CFU mL⁻¹；NaClO₄浓度：10⁻¹、10⁻²、10⁻³ M；pH范围：2.0–12.0
2.3 抗菌活性
黑曲霉（ATCC 32073）购自生物资源收集与研究中心（BCRC；台湾食品工业发展研究所），按照Huang等人（2019）描述的方法培养。预处理流程如图1b所示。每次实验前新鲜制备含10⁸孢子mL⁻¹的黑曲霉悬浮液，并在100 mL无菌去离子水中稀释。在特定时间间隔，取出1 mL样品，进行系列稀释并培养以确定孢子数量。灭活过程中的活力评估中，在指定时间点收集等分试样并使用常规培养技术进行分析。所有测定均进行三次重复以确保可重复性。
【数据】菌株：A. niger ATCC 32073；孢子浓度：10⁸ spores mL⁻¹；稀释体积：100 mL无菌去离子水；取样量：1 mL；重复次数：3次
2.4 形貌和超微结构测量
黑曲霉的形貌变化使用扫描电子显微镜（JSM-6700F，JEOL，日本）在3 kV加速电压下观察。透射电子显微镜（JEM-1400，JEOL，日本）用于研究黑曲霉超微结构的细胞切片。样品制备方法和显微镜观察条件按照我们之前的研究（Tzeng等人，2021）进行。
【数据】SEM加速电压：3 kV；TEM型号：JEM-1400
2.5 三维断层扫描与数据重建
#### 2.5.1 透射X射线显微镜
该研究采用基于同步辐射的透射X射线显微镜，利用高分辨率2D和3D成像技术检查细胞。实验工作在台湾光源（位于台湾新竹的国家同步辐射研究中心）的BL01B1光束线上进行（图1d）。为在相位模式下获得最佳成像对比度，细菌标本经过详细的固定和染色处理。首先，样品在4°C下于5%戊二醛（溶于磷酸盐缓冲液PBS，pH 7.2）的1:1混合液中孵育过夜。
【数据】光束线：BL01B1，台湾光源；固定剂：5%戊二醛/PBS（pH 7.2）；固定温度：4°C；固定时间：过夜
研究结果
3.1 表征
提取的壳聚糖的化学结构通过¹H和¹³C NMR波谱阐明，如图2a-b所示。¹H NMR谱显示了脱乙酰化葡萄糖胺（GlcN）和残留N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）单元的特征信号，证实了该生物聚合物的部分脱乙酰性质。GlcN和GlcNAc的异头质子（H-1）分别在约4.80 ppm和4.56 ppm处观察到明显共振，反映了乙酰基存在引起的不同化学环境。脱乙酰单元中与氨基相邻的H-2质子在约3.16 ppm处共振。相比之下，其余环质子（H-3至H-6）由于显著信号重叠，在3.70至3.91 ppm之间呈现为卷积包络。此外，约2.05 ppm处的强单峰归属于乙酰氨基（–NHCOCH₃）的甲基质子，作为计算脱乙酰度的参考。该观察结果与Mi等人（2022）报道的研究一致。
¹³C NMR谱（图2b）进一步证实了提取壳聚糖的结构同一性，显示了多个可归属于吡喃葡萄糖骨架的特征共振。异头碳（C-1）的信号在约97.57 ppm处观察到，而环碳（C-2至C-5）在55.67至76.25 ppm范围内共振。羟甲基碳（C-6，–CH₂OH）对应的峰出现在58.80 ppm处。此外，残留乙酰化单元的存在通过归属于羰基碳（C=O）在176.82 ppm和乙酰氨基甲基碳（–CH₃）在21.99 ppm处的明显信号得到确认。该研究与Wang等人（2022）报道的甲壳类废弃物来源壳聚糖一致。特定碳观察到的微小信号分裂归因于乙酰胺部分内四极¹⁴N核的耦合影响。
综合而言，¹H和¹³C NMR分析验证了壳聚糖的成功提取，确认了β-(1→4)连接的吡喃葡萄糖骨架和部分脱乙酰化的保留。基于乙酰甲基质子与异头质子的积分面积比，提取的壳聚糖脱乙酰度计算约为87.67%，表明甲壳素有效转化为壳聚糖，同时保留了多糖骨架。
理化表征进一步显示特性黏度为10.96 dL g⁻¹，对应黏均分子量（Mv）约为102.10 kDa，与我们早期研究（Chen, Lin, et al., 2025; Chen, Weng, et al., 2025）的报道一致。SEM成像（图2c）显示不规则、多层、片状表面形貌，这种结构可能增强与真菌细胞壁的界面接触。FTIR光谱（图2d）鉴定了关键官能团：3282 cm⁻¹处宽的重叠OH和NH伸缩振动，2877 cm⁻¹处的CH伸缩振动，1649 cm⁻¹处的酰胺I（C=O伸缩），以及1027 cm⁻¹处糖苷键特征的C–O伸缩振动。这些归属与已有文献一致（Das等人，2024；Xiao等人，2023）。
XRD图谱（图2e）在2θ = 10.6°和20.1°处显示特征衍射峰，分别归属于（020）和（110）反射面。这些特征表明壳聚糖的半结晶性质，同时反映无定形和结晶域。值得注意的是，2θ ≈ 30°处特征方解石峰的缺失证实了矿物杂质的去除，验证了脱矿过程的有效性（Matouri等人，2024）。
氮气吸附-脱附分析（图2f）得出相对较低的比表面积（1.43 m² g⁻¹）和27.01 nm的平均孔径，表明介孔结构。低比表面积提示抗菌机制主要由电荷驱动的分子相互作用而非物理吸附能力主导。
热重分析（图2g）显示多阶段失重阶段。约100°C的失重归因于物理吸附和弱结合水分子的蒸发。约300°C处发生主要降解，失重约55 wt%，对应于壳聚糖多糖骨架的热降解和解聚（Xu等人，2021）。此外，600°C时残余质量低于25 wt%，表明无机灰分含量极低，进一步证实了提取壳聚糖的纯度。
在使用NIH-3T3成纤维细胞的细胞相容性测定中（图2h），浓度高达1 mg mL⁻¹时细胞活力超过90%。这证实了提取材料的低细胞毒性，与先前关于海洋来源壳聚糖的研究一致（Chaudhry等人，2021）。
【数据】脱乙酰度：87.67%；特性黏度：10.96 dL g⁻¹；黏均分子量：102.10 kDa；比表面积：1.43 m² g⁻¹；平均孔径：27.01 nm；FTIR特征峰：3282、2877、1649、1027 cm⁻¹；XRD衍射峰：2θ = 10.6°、20.1°；TGA主要降解温度：~300°C；600°C残余质量：<25 wt%；NIH-3T3细胞活力：>90%（1 mg mL⁻¹）
3.2 CTS对黑曲霉的灭活性能
CTS对黑曲霉的抗真菌活性在0.75至2.00 g L⁻¹浓度范围内进行评估（图S1，表S1）。灭活效率随剂量增加而提高，2.00 g L⁻¹处理2小时后达到98.15%。在此浓度下，CTS在6小时内诱导6.05-log的减少，对应99.999%的抑制率。这些结果确立了明确的浓度依赖性和时间依赖性抗真菌效应。
先前研究同样将壳聚糖的活性归因于质子化氨基（–NH₃⁺）与带负电的真菌膜之间的静电相互作用，从而破坏孢子萌发和菌丝生长（Mahmoudi等人，2025；Mohsen等人，2024）。
与其他消毒策略相比（表1），CTS表现出优越的性能。二氧化氯实现了快速灭活（30分钟内99.77%），但其应用受限于亚氯酸盐和氯酸盐等有毒消毒副产物的产生（Cao等人，2024）。基于过氧单硫酸盐的处理也显示出良好效果，但耐药性发展、毒性和经济可行性方面的担忧仍然存在（Chen, Lin, et al., 2025; Chen, Weng, et al., 2025; Wu等人，2024）。生物防治方法，如贝莱斯芽孢杆菌P11，有效抑制了真菌发育，但在较低孢子密度下需要24小时才能达到仅85%的灭活率（D'Elia Bellos等人，2025）。
综合来看，CTS兼具高效抗真菌活性和生物相容性及环境安全性，使其成为控制黑曲霉的优于现有化学和生物方法的替代方案。
【数据】CTS浓度范围：0.75–2.00 g L⁻¹；2h灭活效率：98.15%（2.00 g L⁻¹）；6h对数减少：6.05-log；抑制率：99.999%；ClO₂灭活率：99.77%（30 min）；B. velezensis P11灭活率：85%（24h）
3.3 二维和三维形貌结构
SEM分析提供了CTS暴露下黑曲霉孢子进行性结构损伤的直接二维证据（图3a-c）。0小时未经处理的孢子显示不均匀但完整的表面，保持特征球形形态且无破裂（图3a）。CTS处理2小时后，孢子表面明显吸附了颗粒，而孢子大体保持球形（图3b）。延长暴露至6小时导致明显变形、表面塌陷和孢子壁部分破裂（图3c）。
类似的形态损伤在先前抗真菌处理中已有报道，如冷大气等离子体（Wei等人，2024）、等离子体活化水（Song等人，2024）和太阳能/ClO₂体系（Cao等人，2024），支持表面完整性是真菌灭活的关键指标。
然而，基于电子束的显微镜需要脱水处理，化学固定可能引入结构伪影，且该技术固有地局限于真空腔内的二维投影，因为它依赖于在高真空条件下检测表面发射电子（Zhu等人，2023）。
为克服这些限制，基于同步辐射的透射X射...
【数据】处理时间点：0h、2h、6h；形态变化：完整球形→表面吸附颗粒→变形塌陷破裂
3.4 多模态成像揭示亚细胞损伤
透射电子显微镜（TEM）对超薄切片（60–100 nm）的观察显示，经OsO₄固定和乙酸铀酰及柠檬酸铅对比染色后，CTS处理的黑曲霉细胞内出现显著的亚细胞结构改变（图4a-c）。同步辐射软X射线显微镜（SXM）在−60°至+60°、步长1°的倾斜系列下获取单个细胞在0、2和6小时的图像（图4d-f），揭示了细胞内部结构的进行性破坏。
【数据】超薄切片厚度：60–100 nm；倾斜系列范围：−60°至+60°；步长：1°；时间点：0h、2h、6h
3.5 荧光显微镜与生物物理表征
荧光显微镜使用DAPI（蓝色）染色活细胞（图5a-c）和PI（红色）染色死细胞（图5d-f），在CTS处理后的选定时间点观察。真菌细胞死亡率的定量分析（图5g）与平板计数结果一致。原子力显微镜（AFM）测量进一步揭示了真菌细胞的机械性能恶化：细胞高度从4.55 nm降至1.90 nm，DMT模量从1.04 GPa降至0.33 GPa，表面粘附力从0.72 nN增至2.21 nN，表面粗糙度从3.51 nm增至13.03 nm。钾离子泄漏测定显示，细胞外K⁺浓度从0小时0.02 mg L⁻¹升至6小时0.69 mg L⁻¹，表明质子动力的破坏和膜相关功能的损伤。
【数据】细胞高度：4.55→1.90 nm；DMT模量：1.04→0.33 GPa；表面粘附力：0.72→2.21 nN；表面粗糙度：3.51→13.03 nm；K⁺浓度：0.02→0.69 mg L⁻¹（0→6h）
3.6 CTS对黑曲霉的灭活机制
基于上述多模态成像和生物物理表征结果，提出了CTS对黑曲霉的消毒机制（图6）：CTS上的质子化氨基（–NH₃⁺）与真菌表面带负电的基团（–COO⁻和–PO₄²⁻）发生静电相互作用，扰动细胞壁和膜完整性，促进K⁺泄漏和细胞死亡。
【数据】相互作用基团：–NH₃⁺与–COO⁻、–PO₄²⁻；K⁺泄漏：0.02→0.69 mg L⁻¹
讨论与解读
本研究证明CTS通过涉及结构和生物物理改变的多方面机制显著抑制黑曲霉孢子萌发。CTS对黑曲霉表现出明确的浓度依赖性（0.75–2.00 g L⁻¹）和时间依赖性（0–10小时）抑制效果，在2.00 g L⁻¹下6小时内实现高达6.05-log的减少。综合形态学和理化分析揭示，CTS处理诱导真菌细胞壁进行性变形，损害膜完整性，促进胞内成分泄漏，最终导致不可逆的细胞损伤和真菌死亡。
常规SEM和TEM确认了黑曲霉细胞的二维变形，而先进的同步辐射TXM和SXT提供了亚细胞重组的高分辨率三维可视化。这些同步辐射技术进一步揭示膜塌陷、细胞器收缩和内部区室化丧失是灭活的关键指标。离子泄漏分析进一步支持膜破坏，细胞外K⁺浓度从0小时0.02 mg L⁻¹增加至6小时0.69 mg L⁻¹，表明质子动力的破坏和膜相关功能的损伤。AFM测量通过揭示真菌细胞的显著机械性能恶化证实了这些发现：细胞高度从4.55 nm降至1.90 nm，DMT模量从1.04 GPa降至0.33 GPa。
编译者解读：该研究的方法学亮点在于将同步辐射TXM/SXT技术引入抗菌机制研究，实现了近天然状态下真菌灭活过程的亚细胞三维可视化——这是常规电子显微镜难以企及的。从合成生物学应用角度看，利用渔业废弃物制备高脱乙酰度（87.67%）壳聚糖的策略兼具成本效益和循环经济价值。6.05-log的灭活效率与低细胞毒性（>90%活力）的平衡使CTS成为有前景的食品防腐和临床抗真菌候选材料。然而，研究仍主要停留在体外表型描述层面，壳聚糖分子与真菌膜组分的精确分子识别机制、以及体内感染模型中的疗效验证，是后续转化研究的关键方向。
参考来源
Chen, Y.-C. (2026). Unveiling mechanistic insights of inactivated Aspergillus niger spore by fishery-waste-derived chitosan via synchrotron radiation tomography. Carbohydrate Polymers, 2026.
DOI: 10.1016/j.carbpol.2026.125335
DOI: 10.1016/j.carbpol.2026.125335