来源：CEN-Display: Construction and optimization of a surface display system in Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
酵母表面展示技术（YSD）是蛋白质工程与功能筛选的重要平台，但传统菌株的分泌途径蛋白降解和锚定蛋白的空间位阻常限制其效率。本研究以酿酒酵母CEN.PK2-1C为底盘，通过敲除液泡蛋白酶基因PEP4/PRB1和CAN1优化宿主，引入全新设计的刚性连接肽（>600 aa）降低位阻，系统评估八种GPI锚定蛋白，最终筛选出高效稳定的28_YI锚定蛋白。与传统Aga1-Aga2系统相比，α-半乳糖苷酶展示效率提升6倍，酶活性提高63.5%，并验证了对复杂酶BGL1和易降解纳米抗体VHH 7D12的广泛适用性。
研究背景
酵母表面展示技术由Boder和Wittrup于1997年首次报道，能将异源蛋白或肽段锚定在酵母细胞表面。与噬菌体和细菌展示系统相比，YSD利用真核细胞翻译后修饰机制，确保复杂蛋白的正确折叠和功能完整性。酵母细胞生长快、遗传操作简便、兼容流式细胞术，特别适合高通量文库构建、定向进化和功能筛选。然而，常用菌株分泌途径中的蛋白水解降解和锚定架构带来的空间位阻，限制了YSD的效率、稳定性和适用性。本研究针对这些问题，在酿酒酵母CEN.PK2-1C菌株上开发了高性能展示平台"CEN-Display"。
研究方法
2.1 菌株与培养基
大肠杆菌DH5α用于常规转化和质粒生产。细菌在37°C、200 rpm条件下于LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中培养，根据需要添加50 μg/mL相应抗生素。LB琼脂平板通过添加20 g/L琼脂制备。
酿酒酵母菌株CEN.PK2-1C（MATa, ura3-52, his3-Δ1, leu2-3,112, trp1-289, MAL2-8c, SUC2）及其衍生菌株用于本研究。野生型菌株在YPD培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、0.15 g/L色氨酸、20 g/L葡萄糖）上培养；展示菌株在添加2%葡萄糖的SC-URA合成完全培养基（1.5 g/L无氨基酸无硫酸铵酵母氮源、5 g/L硫酸铵、36 mg/L肌醇、2 g/L不含尿嘧啶的氨基酸混合物）中培养，或以2%半乳糖作为诱导剂和碳源。展示菌株在旋转滚筒中40 rpm、30°C过夜培养于含2%葡萄糖的SC-URA培养基中，随后转接至含2%半乳糖的SC-URA培养基中，于20°C诱导表面展示。添加2% Bacto™-琼脂（BD公司）制备琼脂平板。
【数据】菌株：E. coli DH5α、S. cerevisiae CEN.PK2-1C；培养基：LB、YPD、SC-URA；温度：37°C（细菌）、30°C（酵母培养）、20°C（诱导）；转速：200 rpm（细菌）、40 rpm（酵母）；抗生素浓度：50 μg/mL；琼脂：20 g/L；葡萄糖：2%；半乳糖：2%
2.2 质粒构建
本研究所有质粒通过T4 DNA连接酶介导的克隆或Gibson Assembly构建，并经Sanger测序验证（GENEWIZ，Azenta Life Sciences）。所用引物列于补充表3。基因组DNA提取采用标准苯酚-氯仿法。
锚定序列Sed1、Cwp2、Aga1、EGT2、Yps1通过PCR从CEN.PK2-1C基因组DNA扩增，Aga2从质粒pYD1扩增。两个异源锚定基因28_YI和6_KI分别从解脂耶氏酵母W29和乳酸克鲁维酵母GG799基因组扩增。编码α-GAL（MEL1）的基因从酿酒酵母AH109扩增，编码β-葡萄糖苷酶（BGL1）的基因从嗜纤维酵母扩增。606-aa连接肽序列和纳米抗体VHH 7D12经密码子优化后由GENEWIZ（Azenta Life Sciences）合成。详细基因序列信息见补充表4。
【数据】克隆方法：T4 DNA连接酶/Gibson Assembly；测序：Sanger测序；锚定基因来源：CEN.PK2-1C基因组、pYD1质粒、Y. lipolytica W29、K. lactis GG799；报告基因来源：S. cerevisiae AH109（α-GAL）、S. fibuligera（BGL1）；连接肽长度：606 aa
2.3 基因组修饰
PEP4、PRB1、CAN1和SED1基因缺失采用基于PCR的同源重组方法。含有lox71和lox66侧翼抗生素抗性盒的DNA片段从含抗生素抗性基因的质粒PCR扩增，引物带有70–90 bp与待删除ORF上下游区域同源的序列。胶纯化PCR片段的转化采用醋酸锂法。使用抗生素抗性标记转化的细胞首先涂布于非选择性YPD平板过夜生长，然后影印至含抗生素的YPD平板（PEP4缺失用200 µg/mL Geneticin，PRB1缺失用200 µg/mL Hygromycin，CAN1缺失用200 µg/mL Nourseothricin，SED1缺失用300 µg/mL Zeocin）。随后转化pSH47质粒，利用Cre-loxP位点特异性重组系统循环利用抗生素抗性标记，最后用1 mg/mL 5-FOA去除Cre质粒。
使用先前开发的δ整合（δ-INT）载体pLZ52，将多拷贝Aga1基因盒整合到基因组YARCdelta5 δ位点——酿酒酵母Ty1反转录转座子的337 bp长末端重复序列。δ整合质粒在酵母转化前用KasI/SalI线性化。整合DNA盒含有shBleMX6基因作为选择标记，其编码的蛋白赋予Zeocin抗性，可通过改变Zeocin浓度选择不同拷贝数的整合事件。δ整合转化的细胞先在YPD液体培养基中孵育6小时，然后涂布于非选择性YPD琼脂平板过夜生长。次日，细胞影印至含300、500、800、1000、1500 µg/mL Zeocin的YPD琼脂平板，30°C培养直至菌落出现。最终选择能在800 µg/mL Zeocin条件下生长的菌株进行后续实验。
【数据】同源臂长度：70–90 bp；抗生素浓度：200 µg/mL Geneticin（PEP4）、200 µg/mL Hygromycin（PRB1）、200 µg/mL Nourseothricin（CAN1）、300 µg/mL Zeocin（SED1）；5-FOA浓度：1 mg/mL；δ位点：YARCdelta5（337 bp LTR）；线性化酶：KasI/SalI；Zeocin筛选浓度：300–1500 µg/mL；孵育时间：6 h（液体）、过夜（平板）；温度：30°C
2.4 酶活性测定
α-半乳糖苷酶（α-GAL）活性通过测定对硝基苯基-α-D-半乳糖吡喃糖苷（pNP-α-Gal）水解为对硝基苯酚引起的400 nm吸光度增加来确定，使用商业检测试剂盒（BC2575，Solarbio）。收集1 mL OD600 = 1的培养物细胞（约1.5 × 10⁷个细胞），洗涤后重悬于100 μL提取缓冲液。反应通过依次向96孔板中添加25 μL试剂1、35 μL试剂2和10 μL样品启动。37°C孵育30分钟后，加入130 μL试剂3终止反应。室温孵育2分钟后在400 nm处测定吸光度。一个酶活性单位定义为每小时每10⁶个酵母细胞产生1 nmol对硝基苯酚。
β-葡萄糖苷酶（BGL1）活性使用对硝基苯基-β-D-葡萄糖吡喃糖苷（pNPG）水解测定，使用商业试剂盒（BC2560，Solarbio）。收集10 mL OD600 = 1的培养物细胞（约1.5 × 10⁷个细胞），洗涤后重悬于1000 μL试剂盒提取缓冲液。反应混合物通过在2 mL管中依次添加400 μL试剂1、500 μL试剂2和100 μL样品制备，涡旋混匀后37°C孵育30分钟。沸水浴5分钟终止反应，随后离心（8000 × g，4°C，5分钟）。上清液与1000 μL试剂3混合，室温孵育2分钟，在400 nm处测定吸光度。一个酶活性单位定义为每小时每10⁷个酵母细胞产生1 nmol对硝基苯酚。
【数据】α-GAL底物：pNP-α-Gal；BGL1底物：pNPG；检测波长：400 nm；反应温度：37°C；反应时间：30 min；细胞量：OD600=1（约1.5×10⁷ cells）；终止方式：α-GAL加130 μL试剂3，BGL1沸水浴5 min；BGL1离心条件：8000 × g，4°C，5 min；酶活单位：nmol对硝基苯酚/h/10⁶细胞（α-GAL）、nmol对硝基苯酚/h/10⁷细胞（BGL1）
2.5 流式细胞术分析
Split-GFP分析。 收集细胞，PBS洗涤两次，调整至OD600 = 1.0。取300 μL等分试样离心，沉淀重悬于等体积的20 μM GFP1-10蛋白中。30°C过夜孵育后，PBS洗涤两次，流式细胞术分析。
CoraLite®594偶联HA标签单克隆抗体分析。 细胞PBS洗涤两次，重悬至OD600 = 1.0。取300 μL等分试样离心沉淀，用含5%（w/v）BSA或5%（w/v）山羊血清的PBS室温封闭1小时。用含1%（w/v）BSA的PBS洗涤后，细胞与300 μL 1:500稀释的CoraLite®594偶联抗HA单克隆抗体（Proteintech, CL594-66006）室温孵育2小时或4°C过夜。PBS洗涤两次后，细胞重悬于300 μL PBS进行流式细胞术分析。
流式细胞术使用BD Fortessa X-20流式细胞仪（BD Biosciences，美国）进行，以量化表面展示效率。展示效率通过Split-GFP分析（Ex/Em = 488/530 nm）和CoraLite®594偶联HA抗体分析（Ex/Em = 594/615 nm）定量，缓冲液处理的细胞作为阴性对照。细胞在前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）信号上设门，以排除碎片和可能的细胞聚集体。每个样品记录100,000个事件，数据用FlowJo软件（版本10.8.1）分析。
【数据】GFP1-10浓度：20 μM；孵育条件：30°C过夜；抗体稀释度：1:500；封闭液：5% BSA或5%山羊血清；流式细胞仪：BD Fortessa X-20；检测通道：488/530 nm（Split-GFP）、594/615 nm（HA抗体）；事件数：100,000；分析软件：FlowJo 10.8.1
研究结果
3.1 CEN-Display系统的表征
为探索酿酒酵母CEN.PK2-1C作为表面展示底盘的潜力，我们构建了CEN-Display系统并对其性能进行了系统评估。首先，从亲本CEN.PK2-1C菌株出发，通过同源重组依次敲除PEP4、PRB1和CAN1基因，以减少分泌途径中的蛋白水解降解并增强分泌通量。该策略产生了优化底盘菌株LZy10，其展示蛋白的稳定性得到增强。为实现表面展示蛋白的可控表达，系统置于可诱导的GAL1启动子调控之下。采用广泛兼容的分泌信号肽MFα1pp，促进融合蛋白高效转运进入分泌途径。选择常用的GPI锚定细胞壁蛋白Sed1（T109–L338）作为锚定模块，α-半乳糖苷酶（α-GAL，EC:3.2.1.22）作为报告蛋白，定量评估表面展示性能（图1a）。
CEN-Display系统的性能通过两个互补指标评估：展示酶活性和展示效率。展示α-GAL活性基于pNP-α-Gal酶解为对硝基苯酚测定，产物在400 nm处分光光度法检测。为评估展示效率，将16个氨基酸的GFP11标签融合到目标蛋白N端，外源提供GFP1–10片段。通过Split-GFP自组装实现荧光重建，直接可视化表面定位蛋白。与流式细胞术联用时，该方法可实现展示效率的快速高通量定量。
在20°C诱导条件下，α-GAL_Sed1的展示酶活性和展示效率在72小时内持续监测。结果显示，表面展示性能（酶活性和展示效率）是动态而非静态的，表现为先快速增加，随后适度下降，最终随培养进程趋于稳定（图1b）。荧光显微镜进一步证实了成功的表面定位：与阴性对照相比，表达α-GAL_Sed1的酵母细胞显示出勾勒细胞周边的连续绿色荧光信号，与靶蛋白锚定到细胞壁一致（图1c）。酶学测定、流式细胞术定量和荧光显微镜一致证明了CEN-Display系统的稳定性、稳健性和可靠性。
【数据】诱导温度：20°C；监测时间：72 h；展示性能变化：先升后降再稳定；α-GAL_Sed1展示：荧光信号连续勾勒细胞边缘
3.2 提升表面展示效率
验证CEN-Display系统可靠性后，我们探索了几种通用优化策略以进一步提升表面展示性能。由于表面展示受限于酵母细胞壁中GPI锚定蛋白的丰度，提升展示效率主要依赖于增加细胞壁容纳异源蛋白的能力。使用底盘菌株LZy10，我们敲除了内源SED1基因，以减少对细胞壁锚定位点的竞争，从而增加基于Sed1锚定的有效整合。所得SED1敲除菌株（α-GAL_sed1Δ）与未敲除菌株相比，最大展示效率提高约1.5倍，且效率随时间的下降更缓慢，但展示酶活性未见显著改善（图2a和b）。
此外，已有研究报道，与较短锚定蛋白相比，较长的GPI-CWP通常表现出更优的表面展示性能。在N端展示系统中，GPI锚定信号序列位于GPI-CWP前体的C端。在内质网中，GPI转酰胺酶（GPI-T）首先切割C端疏水信号肽，随后催化GPI锚定共价连接到ω位点残基，从而完成GPI修饰。基于这一机制，我们假设GPI锚定信号上游的额外氨基酸序列可能起到类似分子间隔物或连接肽的作用，通过增加底物可及性来增强酶活性。
为验证这一假设，我们设计了一个由超过600个氨基酸的高度重复序列组成的刚性连接肽，并生成了219 aa、405 aa和606 aa的截短变体，以替代先前使用的17-aa GS连接肽。酶活性测定显示，随着连接肽长度增加，展示α-GAL活性呈阶梯式增强，同时高活性的维持时间显著延长（图2c）。值得注意的是，606-aa连接肽相比17-aa GS连接肽使展示酶活性提高约2.1倍。然而，过长的连接肽增加了代谢负担，导致细胞生长速率和展示效率略有下降（图2d）。
同时，在评估表面展示增强策略的过程中，我们观察到展示性能与酿酒酵母生长阶段之间存在显著的动态关系。为系统研究生理状态对展示结果的影响，我们改变了SED1敲除菌株的初始接种密度，并考察其对展示酶活性的影响。生长曲线分析显示，峰值展示酶活性和展示效率主要与酵母指数生长期相关。在该阶段，细胞快速生长和分裂，加上活跃的细胞壁生物合成，显著促进了GPI锚定蛋白的表达，导致展示酶活性和展示效率同步增加。在较低的初始接种密度下，酵母生长较慢，指数期延长，从而延长了高展示酶活性和展示效率的持续时间。相反，增加初始接种密度加速了细胞增殖，导致峰值酶活性提前到达，但高活性期缩短。进入稳定期后，随着细胞分裂减速和结构细胞壁蛋白合成减少，展示酶活性和展示效率均出现轻微下降后趋于稳定（图2e）。
这些发现共同表明，酿酒酵母中的表面展示效果是一个与细胞生理状态紧密耦合的动态参数。因此，依赖传统研究中常用的单时间点测量可能无法完整评估展示效率。实际应用中，采样策略应结合生长阶段动态和生物量积累进行优化，以实现最大展示性能。总之，表面展示的整体效果（主要体现在酶活性上）由展示效率、每个细胞展示蛋白的拷贝数和底物可及性共同决定，其中底物可及性主要受连接肽长度调控。
【数据】SED1敲除效果：最大展示效率提高约1.5倍；连接肽长度：17 aa、219 aa、405 aa、606 aa；606-aa连接肽提升酶活性：约2.1倍；展示性能与生长阶段：指数期最高，稳定期下降后稳定
3.3 不同GPI锚定蛋白的展示性能评估
为系统评估不同GPI锚定蛋白在CEN-Display系统中的表现，我们构建了基于多种锚定蛋白的展示载体，包括内源锚定蛋白Sed1、Cwp2、Aga1、EGT2、Yps1，以及异源锚定蛋白28_YI和6_KI（图3a）。在相同条件下比较各锚定蛋白的展示酶活性和展示效率。
结果显示，不同GPI锚定蛋白的展示性能存在显著差异。其中，28_YI锚定蛋白表现出最优的展示性能，其展示效率和酶活性均显著高于其他锚定蛋白。Aga1-Aga2作为传统锚定系统，其展示性能低于28_YI。基于28_YI锚定的CEN-Display系统，α-GAL展示效率较传统Aga1-Aga2系统提高约6倍，酶活性提高63.5%。
【数据】锚定蛋白数量：8种（Sed1、Cwp2、Aga1、EGT2、Yps1、Aga2、28_YI、6_KI）；28_YI vs Aga1-Aga2：展示效率提高6倍，酶活性提高63.5%
3.4 CEN-Display系统的普适性评估
为验证CEN-Display系统的广泛适用性，我们使用28_YI锚定蛋白展示了多种不同特性的目标蛋白。首先，验证了α-半乳糖苷酶（α-GAL）在CEN-Display系统中的表面展示效率（图4a）。随后，比较了使用28_YI锚定的β-葡萄糖苷酶（BGL1）的展示酶活性和展示效率（图4b）。BGL1是一种结构复杂的酶，其分子量较大，对展示系统的折叠能力和空间容纳性要求更高。
此外，还验证了易降解纳米抗体VHH 7D12的表面展示（图4c）。VHH 7D12分子量小，但对蛋白水解敏感，在传统展示系统中容易被降解。在CEN-Display系统中，VHH 7D12成功展示于细胞表面，表明该系统具备展示降解敏感蛋白的能力。这些结果共同表明，CEN-Display平台对复杂酶和易降解蛋白均表现出良好的兼容性和稳定性。
【数据】验证蛋白：α-GAL（EC:3.2.1.22）、BGL1（β-葡萄糖苷酶）、VHH 7D12（纳米抗体）；28_YI锚定：BGL1展示成功、VHH 7D12展示成功
讨论与解读
本研究开发了基于酿酒酵母CEN.PK2-1C底盘的新型单组分表面展示系统CEN-Display。通过系统评估多种GPI锚定蛋白的性能，并从多维策略提升表面展示效果，重点聚焦展示酶活性和展示效率两个指标。以Sed1为模型锚定蛋白，结合Split-GFP组装，建立了能可靠捕获展示动力学而非静态终点的定量动态分析方法。通过该框架，鉴定出来源于解脂耶氏酵母的异源GPI锚定蛋白28_YI为优异锚定蛋白，与传统Aga1-Aga2系统相比，展示效率和操作稳定性显著提升。值得注意的是，基于28_YI的CEN-Display实现了α-GAL展示效率约6倍的提升和酶活性63.5%的增强。此外，CEN-Display对大而结构复杂的酶（BGL1）和小而易降解的纳米抗体（VHH 7D12）均表现出良好的兼容性，凸显了其广泛的适用性和可扩展性。该工作为构建高效酵母展示平台提供了新底盘菌株、锚定策略和分析工具，为肽段、酶和抗体文库的高通量筛选奠定了方法学基础。
编译者解读： 本研究的核心价值在于将底盘工程与展示架构优化相结合——敲除液泡蛋白酶基因从源头减少目标蛋白降解，而设计超长刚性连接肽则巧妙利用GPI锚定机制中ω位点上游序列的空间间隔功能，这种"宿主—载体"协同优化策略值得借鉴。28_YI锚定蛋白的发现说明异源锚定蛋白可能比同源蛋白具有更优的展示性能，为后续锚定蛋白筛选提供了新方向。不过，606-aa连接肽带来的代谢负担提示，连接肽长度存在最优平衡点。该平台对纳米抗体的成功展示尤其值得关注，为酵母表面展示在抗体筛选和定向进化中的应用打开了更广阔的空间。未来若能进一步解析28_YI锚定蛋白的结构基础，将有助于理性设计更高效的展示模块。
参考来源
Li, Z. (2026). CEN-Display: Construction and optimization of a surface display system in Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135113
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135113