来源：Rediverting carbon flux in Clostridium ljungdahlii using CRISPR interference (CRISPRi)（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
合成气发酵为燃料和化学品的生物制造提供了可持续路径，但产乙酸菌Clostridium ljungdahlii缺乏有效的基因下调工具，制约了代谢工程改造。本研究开发了诱导型CRISPR干扰（CRISPRi）系统，实现多个靶基因超过94%的转录抑制。将该系统应用于3-羟基丁酸（3HB）生产菌株后，下调磷酸转乙酰酶（pta）使酶活降低97%、3HB滴度提高2.3倍；多重CRISPRi进一步将乙酸盐碳流降至25%，同步提升3HB产量。该系统为解析和调控C. ljungdahlii碳代谢提供了有力工具。
研究背景
合成气（CO、CO₂、H₂）发酵利用厌氧细菌将气态底物转化为燃料和化学品。这些底物可通过生物质气化可再生地获得，因此生物气转液（GTL）工艺代表了减少化石燃料依赖的可持续平台。然而，合成气发酵可获取的产品范围目前受到限制，原因之一是缺乏针对能代谢这些气体的微生物的成熟代谢工程工具。
Clostridium ljungdahlii是合成气发酵中颇具前景的平台菌株。2010年报道了其基因组序列和初步遗传工具，实现了低滴度丁醇生产；2013年出现了更稳健的遗传工具，包括多个具有兼容复制起点的质粒和同源重组敲除方案；2014年出现了第一个诱导型启动子及丁酸盐生产的代谢工程努力；基因组规模模型（GSM）的建立及其与时空组学数据的结合进一步推动了该领域发展。然而，缺乏可诱导的基因下调工具仍是限制代谢工程和通路解析的关键瓶颈。本研究旨在开发适用于C. ljungdahlii的诱导型CRISPRi系统，并应用于3HB生产菌株以考察碳通量重定向靶点。
研究方法
2.1 试剂
除非另有说明，所有化学试剂均以Sigma-Aldrich可获得的最高等级购买。LB、BACTO Agar和casamino acids购自Becton Dickinson。微量元素（MD-TMS）和维生素溶液（MD-VS）购自ATCC。
2.2 菌株与质粒
本研究所用菌株和质粒见表1。C. ljungdahlii PETC获自美国典型培养物保藏中心（ATCC #55383）。E. coli DH5α用于常规克隆，E. coli NEBExpress用于制备转化至C. ljungdahlii的质粒。两者均以感受态细胞形式购自NEB。pMTL模块化质粒系统（Heap et al., 2009）由Nigel Minton（诺丁汉大学）惠赠。质粒pdCas9-bacteria由Stanley Qi惠赠（Addgene #44249）。Clostridium acetobutylicum 824基因组DNA由Terry Papoutsakis（特拉华大学）惠赠。pAH2由Stephen Melville（弗吉尼亚理工大学）惠赠。pBbS2k-RFP由Jay Keasling惠赠（Addgene #35330）。R. eutropha由Anthony Sinskey（MIT）提供。质粒pJIR750ai购自Sigma-Aldrich。
【数据】菌株：C. ljungdahlii PETC（ATCC #55383）；E. coli DH5α、NEBExpress；质粒：pMTL系列、pdCas9-bacteria、pAH2、pBbS2k-RFP、pJIR750ai；来源：ATCC/NEB/Addgene/惠赠
2.3 克隆
3HB载体和CRISPRi载体构建所用引物分别见补充表1和补充表2，购自IDT。所有扩增均使用Q5聚合酶（NEB），所有扩增子在PCR纯化前均经DpnI消化。质粒构建使用Gibson Assembly（GA）Master Mix（NEB）。所有限制性内切酶购自NEB。组装好的载体转化至DH5α化学感受态细胞（NEB），经Sanger测序验证后再转化至NEBExpress（NEB）。具体克隆细节进一步描述于补充方法。
【数据】聚合酶：Q5（NEB）；组装：Gibson Assembly Master Mix（NEB）；测序验证：Sanger测序；转化宿主：DH5α→NEBExpress
2.4 细胞培养
E. coli在LB培养基中按标准程序培养，添加适当抗生素（氯霉素25 μg mL⁻¹；红霉素250 μg mL⁻¹）。C. ljungdahlii常规培养在YTF培养基（Leang et al., 2013）上厌氧进行（每升：酵母提取物10 g、Bacto胰蛋白胨16 g、NaCl 4 g、果糖5 g、刃天青0.5 mL 0.2%储备液、半胱氨酸-HCl 0.3 g），添加适当抗生素（甲砜霉素5 μg mL⁻¹；克拉霉素5 μg mL⁻¹）。生理实验和qRT-PCR分析中，细胞在PETC 1754培养基（每升：NH₄Cl 1 g、KCl 0.1 g、MgSO₄·7H₂O 0.2 g、NaCl 0.8 g、KH₂PO₄ 0.1 g、CaCl₂·2H₂O 20 mg、酵母提取物1 g、ATCC微量元素（MD-TMS）10 mL、ATCC维生素（MD-VS）10 mL、NaHCO₃ 2 g、刃天青0.5 mL 0.2%储备液、半胱氨酸-HCl 0.3 g）中培养，补充5 g L⁻¹果糖用于异养生长，或补充10 psig的80:20 H₂:CO₂顶空用于自养生长。细胞从中对数期种子培养物以2–5%（v/v）接种。C. ljungdahlii冷冻保藏通过将等体积培养物与50%（v/v）甘油在厌氧瓶中混合制备，储存于−80 °C。所有厌氧操作均在Coy厌氧培养箱中进行，气氛为5% H₂、10% CO₂、余量N₂。
【数据】E. coli培养基：LB（氯霉素25 μg mL⁻¹；红霉素250 μg mL⁻¹）；C. ljungdahlii培养基：YTF/ PETC 1754；抗生素：甲砜霉素5 μg mL⁻¹、克拉霉素5 μg mL⁻¹；异养碳源：果糖5 g L⁻¹；自养条件：10 psig 80:20 H₂:CO₂；接种量：2–5%（v/v）；保藏：50%甘油，−80 °C；厌氧气氛：5% H₂、10% CO₂、余量N₂
2.5 C. ljungdahlii转化
电转感受态细胞基本按Leang et al.（2013）所述制备。细胞在YTF培养基中至少传代两次，然后以2%（v/v）接种至200 mL含40 mM DL-苏氨酸（作为细胞壁弱化剂）的YTF中。过夜生长至OD为0.2–0.3后，细胞在冰上冷却30 min，然后7000 RCF离心10 min。细胞用冰冷的50 mL SMP缓冲液（272 mM蔗糖、1 mM MgCl₂、7 mM磷酸钠，pH 6.0）洗涤两次，重悬于180 μL SMP缓冲液中，加入20 μL DMSO。25 μL等分试样转移至预冷的Eppendorf管中，在−80 °C下储存至多一个月。除细胞生长外的所有步骤均在厌氧培养箱（5% H₂、20% CO₂、余量N₂，Coy Labs）中进行。电穿孔时，感受态细胞等分试样在冰上解冻，加入1–5 μg质粒后转移至1 mm电转杯。细胞以单指数脉冲（0.625 kV、600 Ω、25 μF）电击，立即加入1 mL预热YTF。细胞在Hungate管中10倍稀释至预热YTF培养基，37 °C恢复9–12 h，然后10倍稀释至含相关抗生素的预热YTF培养基中（参照Straub et al., 2014）。成功转化以3–5天后出现稳健生长为标志，与无质粒电击的阴性对照比较。为分离单菌落，取不同稀释度的1 mL复苏培养物与24 mL含1%琼脂的YTF混合，倒入培养皿。
【数据】感受态制备：40 mM DL-苏氨酸，OD 0.2–0.3，冰浴30 min，7000 RCF离心10 min；SMP缓冲液：272 mM蔗糖、1 mM MgCl₂、7 mM磷酸钠，pH 6.0；电转参数：0.625 kV、600 Ω、25 μF；质粒量：1–5 μg；恢复：37 °C、9–12 h；菌落分离：1%琼脂YTF
2.6 产物定量
胞外代谢物使用Agilent 1200 HPLC系统配G1362A RID检测器分析，以14 mM硫酸等度洗脱（0.7 mL min⁻¹，50 °C），通过BioRad Aminex HPX-87H离子交换柱（300 mm × 7.8 mm）。取500 μL培养物经0.2 μm针头过滤器过滤至HPLC进样瓶，进样10 μL。产物身份和浓度通过与纯化合物生成的标准曲线比对确认。
【数据】HPLC：Agilent 1200 + G1362A RID；色谱柱：BioRad Aminex HPX-87H（300 mm × 7.8 mm）；流动相：14 mM硫酸，0.7 mL min⁻¹，50 °C；进样量：10 μL；样品量：500 μL
2.7 分数摩尔产率计算
乙酸盐、乙醇和3HB的分数摩尔产率（FMY）计算为目标分子滴度除以所有代谢物总滴度（mM），按各产物碳数加权。例如3HB：FMY = 4[3HB] / (2[Acetate] + 2[Ethanol] + 4[3HB])。
【数据】FMY公式：FMY = 4[3HB]/(2[Acetate] + 2[Ethanol] + 4[3HB])；碳数加权：乙酸盐2、乙醇2、3HB 4
2.8 dCas9表达验证
细胞裂解和蛋白变性通过将细胞沉淀在Laemmli缓冲液中于热循环仪煮沸10 min实现。10–45 μL上样至4–20%预制SDS凝胶（BioRad），150 V电泳约1小时分离。dCas9表达通过Western blot检测，一抗为多克隆兔抗CRISPR-Cas9（AbCam，#ab204448），二抗为HRP偶联山羊抗兔（SantaCruz Biotechnology，#sc2030）。检测使用Western Lightning ECL底物（PerkinElmer），以Sony A5相机成像。
【数据】煮沸：Laemmli缓冲液，10 min；上样量：10–45 μL；凝胶：4–20%预制SDS凝胶；电泳：150 V，约1 h；抗体：Anti-CRISPR-Cas9（AbCam #ab204448）、HRP-山羊抗兔（SantaCruz #sc2030）
2.9 RNA提取与qRT-PCR定量
RNA提取时，将1 mL培养物（约OD600 0.4–1.0）与2 mL RNA-Protect（Qiagen）混合，室温3250 RCF离心15 min收集。细胞沉淀储存于−80 °C直至提取。沉淀重悬于100 μL溶菌酶/TE缓冲液（20 mg/mL溶菌酶、10 mM Tris、1 mM EDTA，pH 8），涡旋10 s，37 °C孵育10 min，期间频繁混匀。随后使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）提取RNA，NanoDrop定量，−80 °C储存不超过一个月再进行cDNA合成。qRT-PCR使用QuantiTect Reverse Transcription（Qiagen）和RT2 SYBR Green qPCR Master Mix（Qiagen），按制造商指南操作。CRISPRi菌株RT-PCR分析所用引物见补充表3。反应在96孔PCR板（VWR）中进行，以BioRad Microseal B密封。每个生物学重复设3个技术重复和1个"minus RT"对照。qPCR循环在BioRad iCycler上用iQ3软件运行。原始数据在BioRad iQ5中分析以确定Ct值；Ct值通过对目的基因线性DNA片段生成的对数标准曲线量化为拷贝数/pg总RNA。这些线性片段包含完整目的基因，通过PCR生成、凝胶电泳纯化、NanoDrop定量。标准曲线允许计算qPCR引物效率，通常大于90%。每次qPCR反应循环后生成熔解曲线，以确保引物对靶标序列的特异性。
【数据】样品量：1 mL培养物（OD600 0.4–1.0）+ 2 mL RNA-Protect；离心：3250 RCF、15 min、室温；裂解：100 μL溶菌酶/TE（20 mg/mL溶菌酶、10 mM Tris、1 mM EDTA，pH 8），37 °C、10 min；提取：RNeasy Mini Kit；qRT-PCR：QuantiTect RT + RT2 SYBR Green；重复：3技术重复 + 1 minus RT对照；引物效率：>90%
研究结果
3.1 3HB质粒的初步筛选与优化
本研究中探索的3HB生物合成途径如图1a所示。表达不同途径酶组合的合成操纵子被构建并置于乳糖诱导型启动子pbgaL（Banerjee et al., 2014; Hartman et al., 2011）控制下，生成质粒p3HB100、p3HB130和p3HB160（表1）。p3HB100表达来自Ralstonia eutropha的NADPH依赖性3-羟基丁酰-CoA脱氢酶以及来自Clostridium acetobutylicum的ptb和buk，因此应产生R-对映体。p3HB130和p3HB160均表达来自C. acetobutylicum的NADH依赖性3-羟基丁酰-CoA脱氢酶和来自E. coli的硫酯酶tesB，因此产生(S)-3HB。两者的差异在于乙酰-CoA缩合所用的硫解酶：p3HB130使用来自R. eutropha的phaA基因，而p3HB160编码来自C. acetobutylicum的硫解酶thl。三个质粒均转化至C. ljungdahlii，在PETC培养基中生长，于早期指数期（OD600 0.3–0.4）用20 mM乳糖诱导，之后跟踪OD和产物生成直至生长停止（图1b）。携带空载体对照（pAH2）的细胞未产生可检测的3HB，而所有其他菌株均产生少量3HB，范围为0.8 mM（p3HB160）至2.7 mM（p3HB130）。这代表最大分数摩尔产率（FMY，见2.7节）为0.15，即发酵产物中总碳的15%。大部分碳通量流向天然产物乙酸盐和乙醇。
为合理改进3HB生产，接下来分析了最佳生产菌株（p3HB130）中异源基因的密码子使用偏好。总体而言，来自R. eutropha和E. coli的基因优先使用C. ljungdahlii中的稀有密码子，而来自C. acetobutylicum的基因适应良好。对R. eutropha phaA的样本分析（补充图1）清晰显示编码序列起始附近存在大量稀有密码子，这被认为会导致翻译效率降低（Quax et al., 2015）。为克服与密码子使用偏好差相关的表达障碍，合成了phaA和tesB的密码子优化变体，然后与来自C. acetobutylicum的hbd组装。利用基因合成同时编码此前已证明在C. ljungdahlii中有效的核糖体结合位点和5′间隔区序列（Ueki et al., 2014）（补充表4）。所得质粒（p3HB131）包含与p3HB130相同的基因，但密码子使用和RBS序列经过优化。携带p3HB131的菌株与携带p3HB130的菌株表现相似，滴度略有增加但分数摩尔产率无显著改善（图1b）。这表明原始构建体中次优的密码子适应和RBS序列要么不严重阻碍phaA和tesB的表达，要么对应的酶并非3HB生产的限速步骤。
最后，将p3HB131的乳糖诱导型启动子替换为C. ljungdahlii组成型pta启动子（Ueki et al., 2014），生成质粒pCL2pta3HB131。携带该质粒的菌株产生了迄今为止最高的3HB水平——4.2 mM，FMY为0.25（图1b）。
【数据】3HB滴度：p3HB160为0.8 mM、p3HB130为2.7 mM、pCL2pta3HB131为4.2 mM；最大FMY：0.15（15%）；优化后FMY：0.25；诱导条件：20 mM乳糖，OD600 0.3–0.4；启动子：pbgaL（乳糖诱导）/pta（组成型）
3.2 C. ljungdahlii CRISPRi系统的设计与评估
由于至此测试的所有菌株均产生大量乙醇和乙酸盐，研究寻求一种简单策略来下调与这些代谢物产生相关的基因，以将通量转向3HB。因此着手为C. ljungdahlii开发CRISPRi系统。CRISPRi需要两个组分：作为转录阻断物的失活Cas9（dCas9），以及将核酸酶引导至基因组靶位点的单向导RNA（sgRNA）（Qi et al., 2013）。由于部分靶向下调的基因可能是必需的，研究寻求通过诱导型启动子实现严格控制。因此将来自Streptococcus pyogenes的dCas9克隆至乳糖诱导型pAH2中，带有三种不同的RBS序列，生成pdCas9A-C，并通过Western Blot检测诱导表达。所有构建体中均检测到全长dCas9（图2b），且强度随乳糖浓度升高而增加。携带pdCas9B的细胞表达水平最高，因此选择该菌株用于实施完整CRISPRi系统。
研究认为sgRNA表达的理想启动子应小、组成型、具有明确的转录起始位点，以便在不显著增加质粒大小的前提下实现多个sgRNA的多重化。遗憾的是，C. ljungdahlii中缺乏充分表征的组成型启动子。因此选择使用工程启动子P4，该启动子已在近缘生物Clostridium cellulolyticum中成功用于sgRNA表达（Xu et al., 2015）。为便于多重化，sgRNA表达构建体采用BioBricks启发的策略设计（Canton et al., 2008），使用XhoI、SalI和XbaI酶（图2a）。在此设计中，多个sgRNA片段可通过将XhoI-XbaI片段连接到以SalI-XbaI打开的现有构建体中而逐步组装，产生融合的XhoI-SalI位点并允许多轮迭代。合成了针对C. ljungdahlii磷酸转乙酰酶（pta）的N20区域sgRNA构建体（补充表5），克隆至pdCas9B中P4启动子下游，生成pdCas9B-sgRNA-pta。N20序列通过搜索非模板链上最接近编码序列起始处的PAM位点（NGG）来选择，且与基因组其他区域无相似性。sgRNA的表达通过对晚期指数期细胞进行RT-PCR定性评估（图2c）。预期条带仅在携带pdCas9B-sgRNA-pta的细胞中出现，且仅在逆转录酶处理后出现，确认了sgRNA的表达。
在验证CRISPRi系统两个组分均成功表达后，接下来考察完整系统是否能介导C. ljungdahlii基因的敲低。选择了三个在碳通量和能量保存中具有推定作用的靶基因：pta、adhE1和aor2（图1a）。pta编码磷酸转乙酰酶，催化乙酰-CoA转化为乙酰磷酸，这是从中心中间体乙酰-CoA到乙酸盐两步反应的第一步。adhE1编码双功能醇/醛脱氢酶，已证明在异养条件下对乙醇生产有贡献（Leang et al., 2013）。aor2编码醛铁氧还蛋白氧化还原酶。作为C. ljungdahlii中两个aor基因之一，aor2在异养条件下表达最高（Nagarajan et al., 2013）。该酶催化乙醛和乙酸盐之间的铁氧还蛋白依赖性互变。在自养条件和高乙酸盐浓度下，它被认为将乙酸盐还原为乙醛，作为乙醇生物合成的第一步，以规避乙酸盐相关的毒性（Mock et al., 2015）。重要的是，这是唯一支持ATP保存的自养乙醇生产途径（Mock et al., 2015）。在异养条件下，乙醛热力学有利地氧化为乙酸盐可能代表另一种不依赖pta的乙酸盐生产模式，且仍与能量保存偶联：这些条件下产生的还原型铁氧还蛋白可在Rnf复合物处以NAD为电子受体重新氧化，产生质子动力和约0.5 ATP（Schuchmann and Müller, 2014）。这三个基因编码的酶被认为在各种条件下承载高通量，因此调控其表达的能力既有基础研究意义也有应用价值。
【数据】dCas9来源：S. pyogenes；启动子：乳糖诱导型pAH2（3种RBS变体）；sgRNA启动子：P4（工程启动子）；克隆策略：BioBricks（XhoI/SalI/XbaI）；靶基因：pta、adhE1、aor2；PAM位点：NGG（非模板链）
图3展示了来自C. acetobutylicum的ATc响应启动子在C. ljungdahlii中实现诱导型下调的能力。重新设计的dCas9表达盒使用了为C. acetobutylicum工程化的p2tetO1启动子（Dong et al., 2012）。通过葡萄糖醛酸酶报告基因评估pbgaL和p2tetO1启动子的表达特性，验证了该诱导系统的功能。
【数据】启动子：p2tetO1（ATc诱导）；报告基因：葡萄糖醛酸酶；诱导剂：ATc（脱水四环素）
3.3 pta下调在异养条件下提高3HB滴度和产率
将CRISPRi系统应用于3HB生产菌株后，考察了pta下调对产物分布的影响。携带3HB质粒pCL2pta3HB131和pMTLdCas9或pMTLdCas9-pta的C. ljungdahlii菌株在YTF培养基中培养，有或无诱导条件下分析发酵产物分布和3HB滴度（图4）。结果表明，pta下调导致3HB滴度和产率在异养条件下显著提高。
【数据】培养基：YTF；菌株：pCL2pta3HB131 + pMTLdCas9/pMTLdCas9-pta；诱导条件：有/无诱导；检测指标：发酵产物分布、3HB滴度
3.4 多重CRISPRi对3HB生产的影响
进一步考察多重CRISPRi的效果。携带3HB质粒pCL2pta3HB131和多种CRISPRi质粒的C. ljungdahlii菌株在YTF培养基中培养，分析发酵产物分布和3HB滴度（图5）。蓝色代表乙酸盐，橙色代表乙醇，绿色代表3HB。多重CRISPRi实现了多个基因的同步下调，并允许对异养条件下乙酸盐生产进行详细解析。
【数据】培养基：YTF；菌株：pCL2pta3HB131 + 多种CRISPRi质粒；产物标记：蓝=乙酸盐、橙=乙醇、绿=3HB
3.5 pta下调不能改善自养条件下的3HB生产
考察了自养条件下pta下调的效果。携带pCL2pta3HB131和pMTLdCas9-PTA（蓝色）或pCL2pta3HB131和pMTLdCas9（黑色）的C. ljungdahlii在诱导（实线、圆圈）或不诱导（虚线、三角形）条件下，以10 ng mL⁻¹ ATc处理，跟踪生长和产物滴度的时间过程（图6）。结果显示，与异养条件不同，自养条件下pta下调并未改善3HB生产。
【数据】诱导剂：10 ng mL⁻¹ ATc；条件：诱导（实线/圆圈）vs 不诱导（虚线/三角形）；菌株：pCL2pta3HB131 + pMTLdCas9-PTA（蓝）/pMTLdCas9（黑）；检测指标：生长曲线、产物滴度时间过程
讨论与解读
本研究将CRISPRi系统引入C. ljungdahlii，实现了多个推定参与能量代谢的基因的高水平抑制。通过将dCas9置于严格调控的ptet启动子控制下进一步优化系统，实现了诱导型下调，这有望用于实现动态调控或研究必需基因。在3HB工程菌株中下调pta在异养条件下显著提高了滴度和产率，但在自养条件下未观察到改善，表明削弱乙酸盐生产的能力依赖于细胞的能量状态。sgRNA多重化允许同时下调多个基因，并对异养条件下的乙酸盐生产进行了详细解析。本系统将持续推动C. ljungdahlii的代谢工程研究和碳/能量代谢复杂性解析。
编译者解读
本研究的关键价值在于为C. ljungdahlii提供了可诱导、可多重化的CRISPRi工具，填补了该菌株基因下调工具的空白。方法上，采用BioBricks策略实现sgRNA模块化组装，为多靶点调控提供了便利；通过启动子替换实现诱导型控制，兼顾了必需基因干扰的安全性。值得注意的是，pta下调在异养与自养条件下的效果差异提示了能量状态对代谢改造效果的决定性影响——这提醒合成生物学研究者，通路改造策略必须考虑宿主生理背景。局限在于3HB绝对滴度仍偏低，且乙酸盐分流未能完全消除，后续可结合启动子工程与发酵工艺优化进一步提升。
参考来源
Woolston, B. M. (2018). Rediverting carbon flux in Clostridium ljungdahlii using CRISPR interference (CRISPRi). Metabolic Engineering, 2018.
DOI: 10.1016/j.ymben.2018.06.006
DOI: 10.1016/j.ymben.2018.06.006