来源：The key role of Cytochrome P450 and ALDH in citrus flavor (+)-valencene biotransformation to (+)-nootkatone with Yarrowia lipolytica D21173（Food and Bioproducts Processing）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
(+)-圆柚酮是一种高价值的倍半萜化合物，广泛应用于食品风味、香精香料、农业和医药领域。本研究以解脂耶氏酵母D21173为宿主，通过基因敲除技术系统解析了CYP450（基因2911）和ALDH（基因0658）在(+)-缬草烯生物转化生成(+)-圆柚酮过程中的关键调控作用。研究发现这两个基因不仅参与菌株生长调控和环境胁迫应答，更是(+)-缬草烯向(+)-圆柚酮转化的核心酶系。敲除基因0658后(+)-圆柚酮产量降至203.89 mg/L，而敲除基因2911后产量仅20.51 mg/L，证实了两个基因在该生物转化途径中的不可或缺性。
研究背景
倍半萜是一类含有15个碳原子的天然化合物，广泛存在于植物精油中并具有多种生物活性。(+)-圆柚酮作为一种天然倍半萜，存在于葡萄柚、香根草、益智和阿拉斯加黄柏等多种植物中，具有强烈的葡萄柚香气，被广泛应用于香精香料行业。此外，(+)-圆柚酮还具有抗炎、抗肿瘤、抗菌、杀虫和神经保护等多种生物活性，已被美国FDA批准为“食品级”调味剂，并被美国环保署确认为新型驱虫活性成分。
(+)-缬草烯是合成高价值化合物(+)-圆柚酮的前体物质，价格相对低廉，存在于柑橘类植物的果汁和精油中，易于自然氧化。然而，天然植物中(+)-圆柚酮含量极低，提取1 kg(+)-圆柚酮约需400,000 kg葡萄柚。化学法从(+)-缬草烯合成(+)-圆柚酮存在诸多局限。因此，利用微生物细胞工厂实现高效生物转化成为研究热点。解脂耶氏酵母作为公认安全（GRAS）的产油酵母，具有良好的疏水性底物耐受性和强大的蛋白表达能力，是构建萜类化合物生物转化平台的理想宿主。
研究方法
2.1 材料与试剂
本研究所用的解脂耶氏酵母（SHBCC D21173）购自上海瑞楚生物科技有限公司（中国上海）。大肠杆菌Trans1-T1购自北京全式金生物技术有限公司。(+)-缬草烯（>70.0%）、(-)-缬草烯（>70.0%）和(+)-圆柚酮（>97.0%）均购自Sigma化学公司（美国密苏里州圣路易斯）和TCI（日本东京）。TOPO-Blunt质粒（购自全式金）含有氨苄青霉素抗性基因AmpR，用于构建基础载体。PJK质粒为整合型质粒（适用于酵母），用于扩增NTC抗性基因。载体构建所用酶包括Q5高保真DNA聚合酶、Takara限制性内切酶、2×Taq Plus Master Mix Ⅱ（Dye Plus）酶和Thermo快速内切酶，均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。克隆试剂盒购自上海ELISA生物技术有限公司（中国上海）。山梨醇溶液（CC203–100 mL）购自Cool Labo Bio公司。氯仿、异戊醇、异丙醇和无水乙醇购自国药集团化学试剂有限公司（中国北京）。YPD培养基用于解脂耶氏酵母D21173的生长和发酵。本实验构建的所有工程菌株和质粒见表2。
【数据】菌株：解脂耶氏酵母SHBCC D21173、大肠杆菌Trans1-T1；底物：(+)-缬草烯（>70.0%）、(-)-缬草烯（>70.0%）、(+)-圆柚酮（>97.0%）；质粒：TOPO-Blunt（含AmpR）、PJK（含NTCR）；培养基：YPD
2.2 关键基因的生物信息学分析
基因2911和基因0658的氨基酸序列来源于解脂耶氏酵母D21173的基因组数据（该基因组数据已上传至DDBJ/ENA/GenBank，登录号为JAHSPI000000000）。蛋白质的理化性质通过在线程序PROPARAM进行预测分析。蛋白质二级结构通过在线程序SOPMA进行预测分析。蛋白质三级结构通过在线程序Swiss-Model进行预测分析（Ma et al., 2022）。蛋白质保守结构域通过NCBI的保守结构域数据库（Conserved Domain Database）进行分析。Prot Scale在线工具用于分析基因编码蛋白的亲水性和疏水性。TMHMM在线工具用于预测基因编码蛋白的跨膜区。Netnglyc和Netoglyc在线工具分别用于预测两个基因编码蛋白的N-糖基化位点和O-糖基化位点。NetPhos在线工具用于预测这些基因的磷酸化位点（Yu et al., 2022）。
【数据】预测工具：PROPARAM、SOPMA、Swiss-Model、NCBI CDD、Prot Scale、TMHMM、Netnglyc、Netoglyc、NetPhos；基因组登录号：JAHSPI000000000
2.3 解脂耶氏酵母D21173的培养
解脂耶氏酵母D21173培养2–5天制备孢子悬浮液，孢子悬浮液浓度调整为10⁶–10⁷个孢子/mL。取约1 mL孢子悬浮液接种于50 mL YPD培养基中，在32℃、150 rpm条件下培养36小时。随后，向培养基中加入920 mg/L的(+)-缬草烯（0.22 µm过滤灭菌），分别转化12小时、24小时和36小时（Li et al., 2023; Li et al., 2021b）。
【数据】接种量：1 mL孢子悬液/50 mL YPD；孢子浓度：10⁶–10⁷孢子/mL；温度：32℃；转速：150 rpm；培养时间：36h；底物浓度：920 mg/L(+)-缬草烯；转化时间：12h、24h、36h
2.4 基因敲除载体的构建
从解脂耶氏酵母D21173中扩增关键基因（基因0658和基因2911）。使用提取的基因组DNA进行PCR分析以验证阳性转化子。PCR扩增体系为：Q5高保真DNA聚合酶0.5 µL、Q5 Buffer 10 µL、引物2 µL、dNTP（10 mmol/L）2 µL、H₂O 32.5 µL、模板（1 ng/µL质粒，基因组100 ng/µL）1 µL。PCR扩增程序：98℃ 30秒；98℃ 10秒、53℃ 20秒、72℃ 30秒（5个循环）；98℃ 10秒、60℃ 20秒、72℃ 60秒（30个循环）；72℃ 5分钟；12℃ 1分钟。重组产物转化至大肠杆菌感受态细胞中，涂布于含100 µg/mL氨苄青霉素的平板，37℃培养。挑取克隆并通过PCR鉴定。使用BamHI内切酶酶切TOPO-Blunt-Δ2911和TOPO-Blunt-Δ0658载体骨架。将扩增片段与酶切后的TOPO-Blunt-Δ2911和TOPO-Blunt-Δ0658载体骨架进行重组连接，组装体系在50℃反应20分钟。通过电泳判断最终载体TOPO-Blunt-Δ2911-NTCR和TOPO-Blunt-Δ0658-NTCR的构建是否成功。
【数据】PCR体系：Q5聚合酶0.5µL、Q5 Buffer 10µL、引物2µL、dNTP 2µL（10mmol/L）、H₂O 32.5µL、模板1µL；PCR程序：98℃ 30s；98℃ 10s/53℃ 20s/72℃ 30s×5循环；98℃ 10s/60℃ 20s/72℃ 60s×30循环；72℃ 5min；12℃ 1min；氨苄青霉素浓度：100µg/mL；酶切：BamHI；重组连接：50℃ 20min
2.5 基因敲除菌株的验证
从NTC抗性平板上挑取解脂耶氏酵母D21173的单菌落，在新的NTC抗性平板上进行第二次筛选。转化工程菌株在含诺尔丝菌素（0.1 mg/L）的YPD平板上进行筛选。单克隆挑选后扩大培养，分别在同源臂外围和NTC片段外围设计引物。以解脂耶氏酵母D21173基因组DNA为模板进行PCR扩增和测序。从Yarrowia lipolytica-Δ2911-NTCR和Yarrowia lipolytica-Δ0658-NTCR菌株中提取DNA并片段化，在Illumina平台上进行测序，并与野生型菌株的基因组进行比较。
【数据】筛选抗生素：诺尔丝菌素（NTC）0.1 mg/L；测序平台：Illumina
2.6 不同时期解脂耶氏酵母D21173中基因2911和基因0658的实时荧光定量PCR（qRT-PCR）
使用RNA提取试剂盒（南京诺唯赞，中国）提取解脂耶氏酵母D21173的总RNA。通过A260/A280比值和琼脂糖凝胶电泳测定分离RNA的纯度和浓度。将总RNA逆转录为cDNA，并在qTOWER 2.2上进行qRT-PCR实验。PCR程序参照先前报道的方法（Livak and Schmittgen, 2001; Yang et al., 2022）。用于基因表达分析的引物序列见表S1。
【数据】RNA提取试剂盒：Vazyme；仪器：qTOWER 2.2；检测指标：A260/A280比值
2.7 重组解脂耶氏酵母D21173生长曲线的测定
将约1.0 mL孢子悬浮液加入50 mL发酵培养基中，在32℃、150 rpm条件下培养。野生型解脂耶氏酵母D21173、Yarrowia lipolytica-Δ2911-NTCR和Yarrowia lipolytica-Δ0658-NTCR在YPD培养基中稀释至OD600 = 0.2。使用酶标仪每4小时测定一次OD600，持续72小时，绘制生长曲线（Wang et al., 2021）。菌株用磷酸盐缓冲液（pH 7.0）洗涤三次，10,000 g离心10分钟。同时，将离心后获得的菌丝体冷冻干燥以去除残余水分，然后精确称重以确定干生物量。计算野生型解脂耶氏酵母D21173、Yarrowia lipolytica-Δ2911-NTCR和Yarrowia lipolytica-Δ0658-NTCR菌株的比生长速率（μ）、代时（T）和生物量得率（Y）（Zhao et al., 2021）。每个实验重复三次，计算平均值±标准差。
μ = (ln Xt − ln X₀) / (t − t₀)
T = ln(2) / μ
Y = (Xt − X₀) / (t − t₀)
其中Xt表示时间t（小时）时的生物量，X₀表示时间t₀（小时）时的生物量。
【数据】初始OD600：0.2；温度：32℃；转速：150rpm；测定间隔：每4h；总时长：72h；离心：10,000g，10min；缓冲液：磷酸盐缓冲液pH 7.0
2.8 基因敲除对解脂耶氏酵母D21173生长状态、离子耐受性和活性氧胁迫的影响
制备基因敲除菌株和野生型解脂耶氏酵母D21173的孢子悬浮液，浓度为10⁶–10⁷个孢子/mL。在YPD培养基中加入不同浓度的FeSO₄、MgSO₄、NaCl、KCl、CuCl₂、CaCl₂和H₂O₂。取200 μL（1.0×10⁶孢子/mL）野生型菌株、Yarrowia lipolytica-Δ2911-NTCR和Yarrowia lipolytica-Δ0658-NTCR菌株的孢子悬浮液涂布于YPD培养基上，32℃培养5天。收集菌株，10,000 g离心10分钟，冷冻干燥并称重。实验重复三次。以YPD培养条件下野生型和基因敲除菌株的重量作为空白对照，计算各菌株在离子胁迫条件下的相对抑制率。
相对抑制率 =（YPD中各菌株重量 − 胁迫条件下各菌株重量）/ YPD中各菌株重量 × 100%
【数据】孢子浓度：10⁶–10⁷孢子/mL；涂布量：200μL（1.0×10⁶孢子/mL）；温度：32℃；培养时间：5d；离心：10,000g，10min；胁迫条件：FeSO₄、MgSO₄、NaCl、KCl、CuCl₂、CaCl₂、H₂O₂
2.9 SPME/GC-MS定量分析(+)-圆柚酮
生物转化产物通过固相微萃取/气相色谱-质谱联用（SPME/GC-MS）检测（Li et al., 2022b）。取约5 mL样品置于20 mL萃取瓶中，置于40℃加热磁力搅拌器上。使用50/30 μm二乙烯基苯/碳氧烷/聚二甲基硅氧烷纤维（Supelco, Belfonte, PA, USA）萃取样品。
【数据】样品量：5mL；萃取瓶：20mL；温度：40℃；萃取纤维：50/30μm DVB/CAR/PDMS
研究结果
3.1 CYP450和ALDH的生物信息学分析
从解脂耶氏酵母D21173基因组测序中获取CYP450和ALDH（由基因2911和基因0658编码）的氨基酸序列，并分析其理化性质（表3）。结果显示，ALDH包含572个氨基酸，数量最多的氨基酸为丙氨酸（Ala）（56个，占9.8%）。该蛋白的负电荷残基总数为66，正电荷残基总数为60，原子总数为8802。该蛋白在酵母中的半衰期超过20小时，不稳定指数为32.84。脂肪族氨基酸指数为76.07，总平均亲水性为−0.299。
CYP450蛋白包含513个氨基酸，分子量约为58632.18 Da，理论等电点（PI）约为7.63，数量最多的氨基酸为亮氨酸（Leu）（52个，占10.1%）。该蛋白的负电荷残基总数为60，正电荷残基总数为61，原子总数为8250。该蛋白为稳定蛋白，在酵母中的半衰期超过20小时，不稳定指数为35.34。脂肪族氨基酸指数为88.03，总平均亲水性为−0.215。
蛋白质的二级结构通常包括α-螺旋、β-转角和无规卷曲。延伸链主要位于相对的α-螺旋和无规卷曲之间。ALDH二级结构预测显示其含有44.23%的α-螺旋、12.06%的延伸链、5.42%的β-转角和38.29%的无规卷曲。CYP450二级结构预测显示其含有44.44%的α-螺旋、38.60%的无规卷曲、13.06%的延伸链和3.90%的β-转角（表4）。
此外，根据三维结构预测图，ALDH含有大量α-螺旋和无规卷曲，这与之前的二级结构预测结果一致（图1A）。CYP450的三维结构预测图显示该蛋白含有大量α-螺旋、无规卷曲和延伸链结构，β-转角较少（图1B）。
保守结构域被定义为进化中的重复单元，其范围可以通过分子进化中的序列和结构分析来确定。ALDH具有三个保守结构域（图S1A）。NAD(P)+依赖性乙醛脱氢酶超家族（ALDH-SF）可以将多种脂肪族和芳香族醛氧化为羧酸（Coitinho et al., 2016），在解毒过程中发挥重要作用，可以降低底物对细胞的毒性（Yoval-Sánchez et al., 2020）。该酶具有三个结构域：NAD(P)+辅因子结合结构域、催化结构域和桥接结构域（Riveros-Rosas et al., 2019）。细胞色素P450也具有两个保守结构域（图S1B）。细胞色素P450（CYP）超家族是含有血红素的蛋白超家族，催化多种内源性和外源性不同结构化合物的各种氧化反应（Omura, 2010）。CYPs还具有多种氧化还原伴侣，如真核细胞色素P450氧化还原酶、细菌/线粒体铁氧还蛋白还原酶和铁氧还蛋白伴侣（Bak et al., 2011）。
真核蛋白中的磷酸化位点通常包括丝氨酸（S）、苏氨酸（T）和酪氨酸（Y）。ALDH共有54个潜在磷酸化位点，其中24个为潜在丝氨酸磷酸化位点。S-66位点得分最高（0.992），表明该位点最可能被蛋白激酶UNSP磷酸化（图1C）。CYP450所有潜在磷酸化位点中，有22个潜在丝氨酸磷酸化位点，其中S-152位点得分最高（0.996），最可能被蛋白激酶UNSP磷酸化（图1D）。
在亲水性和疏水性分析中，正值表示疏水性，负值表示亲水性。ALDH多肽链中第461位氨基酸得分最高（2.100），表明该氨基酸疏水性最强。第91位得分最低（−2.889），表明该位置亲水性最强，编码蛋白为亲水性蛋白（图1E）。CYP450多肽链中第12位氨基酸得分最高（3.033），表明该位点氨基酸疏水性最强；第419位得分最低（−2.778），表明该位点亲水性最强，CYP450蛋白为亲水性蛋白（图1F）。
研究发现ALDH没有跨膜区，跨膜螺旋中氨基酸的预期数量为4.8（图1G）。蛋白前60个氨基酸中跨膜螺旋的预期氨基酸数仅为0.00291，因此推测其可能不是跨膜蛋白（或没有信号肽），这与信号肽预测结果一致（Li et al., 2012）。CYP450的跨膜螺旋数为1，跨膜螺旋中氨基酸预期数为19.57，蛋白前60个氨基酸中跨膜螺旋的预期氨基酸数为18.94（图1H），推测其可能是跨膜蛋白（或有信号肽）。
糖基化是最丰富和最多样化的翻译后修饰，在分泌、糖蛋白代谢、蛋白质折叠和免疫等生物学过程中发挥重要作用（Yang and Han, 2017）。ALDH中有三个可能的N-糖基化位点，包括N-30、N-217和N-380，其中N-30的最大预测得分为0.6368，N-123的预测得分未超过0.5的阈值（图1I）。CYP450中有两个潜在N-糖基化位点，包括N-247（0.5462）和N-504（0.5593）（图1J）。此外，O-糖蛋白组的扩展视图有助于探索位点特异性O-糖基化如何调控蛋白质功能。ALDH中有七个O-糖基化位点，包括O-4（0.843516）、O-6（0.811205）、O-15（0.757612）、O-18（0.654948）和O-20（0.793946）。CYP450的O-糖基化位点预测数为6个，包括O-118（0.522207）、O-384（0.613464）、O-385（0.645852）、O-434（0.794724）和O-435（0.001）。
通过生物信息学分析并与本地BLAST解脂耶氏酵母D21173基因组比对，发现CYP450和ALDH具有独特的基因序列和结构特征，可为(+)-圆柚酮的生产提供新的酶资源。
【数据】ALDH：572个氨基酸，Ala 56个（9.8%），负电荷残基66，正电荷残基60，原子8802，半衰期>20h（酵母），不稳定指数32.84，脂肪族氨基酸指数76.07，总平均亲水性−0.299；CYP450：513个氨基酸，分子量58632.18Da，pI 7.63，Leu 52个（10.1%），负电荷残基60，正电荷残基61，原子8250，半衰期>20h（酵母），不稳定指数35.34，脂肪族氨基酸指数88.03，总平均亲水性−0.215；ALDH二级结构：α-螺旋44.23%、延伸链12.06%、β-转角5.42%、无规卷曲38.29%；CYP450二级结构：α-螺旋44.44%、无规卷曲38.60%、延伸链13.06%、β-转角3.90%；ALDH磷酸化位点：54个（S-66得分0.992）；CYP450磷酸化位点：22个丝氨酸位点（S-152得分0.996）；ALDH疏水性最高位点：461位（2.100），亲水性最强位点：91位（−2.889）；CYP450疏水性最高位点：12位（3.033），亲水性最强位点：419位（−2.778）；ALDH跨膜螺旋预期氨基酸数：4.8，前60位中仅0.00291；CYP450跨膜螺旋数：1，预期氨基酸数19.57，前60位中18.94；ALDH N-糖基化位点：N-30（0.6368）、N-217、N-380；CYP450 N-糖基化位点：N-247（0.5462）、N-504（0.5593）；ALDH O-糖基化位点：7个（O-4 0.843516、O-6 0.811205、O-15 0.757612、O-18 0.654948、O-20 0.793946）；CYP450 O-糖基化位点：6个（O-118 0.522207、O-384 0.613464、O-385 0.645852、O-434 0.794724、O-435 0.001）
3.2 解脂耶氏酵母D21173中CYP450和ALDH基因敲除
为研究CYP450和ALDH酶在(+)-缬草烯生物转化生成(+)-圆柚酮代谢过程中的作用，通过同源重组在解脂耶氏酵母D21173中构建了基因2911和基因0658敲除菌株。研究发现，在非缺陷型解脂耶氏酵母D21173的基因敲除实验中，筛选抗性基因是关键步骤。选择标记是赋予对特定抗生素抗性的基因，通常用于选择已经发生同源重组以破坏目标基因的细胞。本研究使用NTC构建基因敲除菌株（图2A）。
基因2911和基因0658的上下同源臂扩增片段分别为676 bp、667 bp、565 bp和608 bp（图2B）。扩增的2911F1/R2片段长度为1343 bp，扩增的0658F1/R2片段长度为1173 bp（图2C）。随后构建并验证了敲除载体TOPO-Blunt-Δ2911和TOPO-Blunt-Δ0658（图S2A和图S2B）。NTCR的扩增片段长度为1173 bp（图S2C）。将NTC的PCR扩增产物连接到TOPO-Blunt-Δ2911和TOPO-Blunt-Δ0658载体骨架上。
【数据】同源臂长度：gene2911上臂676bp、下臂667bp；gene0658上臂565bp、下臂608bp；2911F1/R2片段：1343bp；0658F1/R2片段：1173bp；NTCR片段：1173bp
3.3 基因0658和基因2911在不同时期的表达分析
通过qRT-PCR分析了基因0658和基因2911在解脂耶氏酵母D21173不同时期的基因表达情况（图3A）。结果显示了两个基因在不同培养时间点的表达动态变化。
3.4 基因敲除对菌株生长的影响
测定了野生型、TOPO-Blunt-Δ2911-NTCR和TOPO-Blunt-Δ0658-NTCR菌株的生长曲线（图3B）和生物量（图3C）。基因敲除菌株与野生型菌株在生长特性上表现出显著差异，表明CYP450和ALDH参与了解脂耶氏酵母D21173的生长调控。
【数据】培养条件：32℃、150rpm；测定时间：72h；间隔：4h
3.5 基因敲除对离子胁迫和氧化胁迫适应性的影响
研究了基因0658和基因2911对解脂耶氏酵母D21173环境适应性的影响，包括对不同离子胁迫（图4A-F）和H₂O₂氧化胁迫（图4G）的响应。结果显示，CYP450和ALDH参与调控解脂耶氏酵母D21173对各种环境胁迫的响应，包括不同的离子胁迫和氧化胁迫。
当Fe²⁺浓度为15 mmol/L时，野生型菌株的最大相对抑制率为68.61%，Yarrowia lipolytica-Δ0658-NTCR菌株为74.87%，Yarrowia lipolytica-Δ2911-NTCR菌株为81.93%。当暴露于30 mmol/L H₂O₂时，三个菌株的相对抑制值分别为：野生型21.91%，Yarrowia lipolytica-Δ0658-NTCR为37.13%，Yarrowia lipolytica-Δ2911-NTCR为37.67%。
【数据】Fe²⁺ 15mmol/L时相对抑制率：野生型68.61%、Δ0658菌株74.87%、Δ2911菌株81.93%；H₂O₂ 30mmol/L时相对抑制率：野生型21.91%、Δ0658菌株37.13%、Δ2911菌株37.67%；显著性：P<0.05，P<0.01，P<0.001；n=3
3.6 基因敲除菌株转化(+)-缬草烯生成(+)-圆柚酮的能力
通过SPME/GC-MS定量分析了不同基因敲除菌株转化(+)-缬草烯生成(+)-圆柚酮的含量（图5A）。结果显示，Yarrowia lipolytica-Δ0658-NTCR菌株转化的(+)-圆柚酮含量为203.89 mg/L（P < 0.05），Yarrowia lipolytica-Δ2911-NTCR菌株转化的(+)-圆柚酮含量为20.51 mg/L（P < 0.001），表明基因2911（CYP450）和基因0658（ALDH）参与调控(+)-缬草烯向(+)-圆柚酮的生物转化过程。
同时测定了不同菌株粗酶液转化(+)-缬草烯（图5B）和(-)-缬草烯（图5C）的酶活性。结果显示基因敲除菌株的粗酶液转化能力显著降低，进一步证实了CYP450和ALDH在该生物转化过程中的关键作用。
【数据】Δ0658菌株(+)-圆柚酮产量：203.89mg/L（P<0.05）；Δ2911菌株(+)-圆柚酮产量：20.51mg/L（P<0.001）；显著性：P<0.05，P<0.01，P<0.001
讨论与解读
本研究通过基因敲除技术系统揭示了解脂耶氏酵母D21173中细胞色素P450（基因2911）和ALDH（基因0658）在(+)-缬草烯生物转化生成(+)-圆柚酮过程中的关键作用。生物信息学分析表明，CYP450含有513个氨基酸，ALDH含有572个氨基酸，两者均为亲水性蛋白，且CYP450可能为跨膜蛋白而ALDH无跨膜区。两个基因均参与调控菌株生长、离子稳态维持、活性氧水平调节和氧化胁迫响应。基因敲除实验证实，敲除基因0658后(+)-圆柚酮产量为203.89 mg/L，敲除基因2911后产量仅20.51 mg/L，与野生型相比均显著降低。这是首次使用基因缺失技术（以NTC为抗性基因）研究解脂耶氏酵母D21173中CYP450和ALDH在(+)-缬草烯生物转化生成(+)-圆柚酮中的关键功能。
编译者解读
本研究采用NTC抗性标记的基因敲除策略，巧妙规避了非缺陷型解脂耶氏酵母中筛选标记匮乏的瓶颈，为工业菌株的基因功能解析提供了可借鉴的方法学范式。双基因敲除与生物转化表型联动的实验设计，清晰锁定了CYP450和ALDH在(+)-缬草烯两步氧化途径中的不可替代性。值得注意的是，ALDH敲除菌株仍保留203.89 mg/L的转化能力，暗示可能存在其他醛脱氢酶同工酶的补偿效应——这为后续多基因协同改造预留了空间。未来若能将CYP450与ALDH在解脂耶氏酵母中过表达并优化电子传递链配套，有望进一步提升(+)-圆柚酮的工业化生产效价。
参考来源
Li X. The key role of Cytochrome P450 and ALDH in citrus flavor (+)-valencene biotransformation to (+)-nootkatone with Yarrowia lipolytica D21173. Food and Bioproducts Processing, 2025. DOI: 10.1016/j.fbp.2025.09.010
DOI: 10.1016/j.fbp.2025.09.010