来源：Integrated metabolomics and transcriptomics reveal that plant hormone signaling, phenylpropanoid biosynthesis, and flavonoid metabolism promote callus browning in Rheum tanguticum（Industrial Crops and Products）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
掌叶大黄（Rheum tanguticum）是珍稀药用植物，野生资源因过度采挖而濒临枯竭，离体快繁体系中的愈伤组织褐变成为产业化瓶颈。本研究综合电镜观察、代谢组学、转录组学及生理生化测定，系统解析褐变愈伤组织在亚细胞结构、次生代谢物积累、激素信号转导及活性氧稳态方面的协同变化。研究发现水杨酸、脱落酸和茉莉酸累积激活胁迫信号，酚类与黄酮类物质过量合成并在液泡中区隔化储存，最终液泡膜破裂触发酶促褐变。该成果为药用植物组织培养褐变调控提供了多层次的分子靶标。
研究背景
掌叶大黄是蓼科植物，其根、茎、种子均可入药，具有泻下、抗炎、利尿、抗菌及抗癌等多种药理活性，也是重要的区域经济作物。作为《中国药典》收载的三种道地大黄之一，掌叶大黄富含蒽醌类、蒽酮类、碳水化合物、芪类及鞣质等化学成分。然而，由于生长缓慢和长期过度采挖，野生种群密度显著下降，部分地区已出现局部灭绝。人工栽培体系的建立迫在眉睫，但组织培养中反复出现的愈伤组织褐变严重制约了繁殖效率。本研究旨在从结构、生理和分子水平系统解析愈伤组织褐变的内在机制。
研究方法
2.1 植物材料与愈伤组织诱导
野生掌叶大黄种子采集自中国宁夏回族自治区固原市六盘山（地理坐标：35°41'35.41"N，106°11'31.06"E），凭证标本（编号640423140630032LY）保存于宁夏大学标本馆。经驯化和温室栽培后，选取掌叶大黄叶片组织作为外植体进行愈伤组织诱导。诱导培养基为MS基础培养基，添加7 g/L琼脂、30 g/L蔗糖、1.5 mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.5 mg/L 1-萘乙酸和0.2 mg/L噻苯隆，pH调至5.8–6.0。培养条件为25 ± 1°C，光周期12 h，光源为冷白荧光灯，光照强度46.3 μmol/(m²·s)。愈伤组织每20天继代一次，培养约60天后收获。绿色愈伤组织设为对照组，褐色愈伤组织为实验组。每个样品取多块愈伤组织，用无菌蒸馏水彻底冲洗去除残留培养基，再用无菌手术刀切成0.5 cm × 0.5 cm × 0.5 cm的立方小块。样品采集后立即投入液氮速冻，并于–80°C保存待测。
【数据】外植体：叶片；培养基：MS + 7 g/L琼脂 + 30 g/L蔗糖 + 1.5 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L NAA + 0.2 mg/L TDZ；pH：5.8–6.0；温度：25 ± 1°C；光周期：12 h；光照强度：46.3 μmol/(m²·s)；继代周期：20天；培养时间：60天；样品尺寸：0.5 cm × 0.5 cm × 0.5 cm
2.2 组织学分析与透射电子显微镜（TEM）观察
褐色和绿色愈伤组织均进行光镜和电镜制样。组织学评估中，样品在4°C下用双醛固定液（PBS中含4%多聚甲醛 + 0.5%戊二醛，pH 7.2–7.4）稳定12 h。经PBS洗涤三次后，样品依次通过梯度乙醇-丙酮脱水，随后用Epon812树脂渗透包埋。使用Leica Ultracut R超薄切片机切取1 μm半薄切片，经1%甲苯胺蓝染色增强对比，用Leica DMLS光学显微镜（德国Leica Microsystems公司）成像观察。TEM分析中，小于1 mm³的组织块先在4°C下用2.5%戊二醛（PBS，pH 7.2–7.4）固定12 h，缓冲液冲洗三次。二次固定采用1%四氧化锇（4°C，3 h）。洗涤后，样品经梯度丙酮脱水、Epon812包埋，用Leica EM UC6系统（德国Leica Microsystems GmbH）进行超薄切片。切片依次用醋酸铀和柠檬酸铅染色后，在Hitachi H-7650 TEM（日本日立高科技公司）下观察。
【数据】固定液：4%多聚甲醛 + 0.5%戊二醛（pH 7.2–7.4）；固定温度/时间：4°C/12 h；锇酸固定：1%四氧化锇，4°C/3 h；半薄切片厚度：1 μm；染色：1%甲苯胺蓝；TEM样品尺寸：<1 mm³
2.3 代谢组学分析
代谢组学分析和数据处理采用北京百迈客生物科技有限公司（BMK，北京，中国）的标准非靶向代谢组学流程。取约50 mg（鲜重）褐色或绿色愈伤组织置于2 mL离心管中，加入1 mL预冷提取溶剂（甲醇:乙腈:水，2:2:1，v/v/v），内含20 mg/L内标。涡旋混匀30 s后加入不锈钢研磨珠，45 Hz匀浆破碎10 min。提取液冰浴超声10 min，并于–20°C孵育1 h以沉淀蛋白。4°C下15,000 × g离心15 min，取500 μL上清液真空浓缩。残留物用160 μL乙腈:水（1:1，v/v）复溶，短暂涡旋、冰浴超声后，在相同条件下再次离心。最终取120 μL上清液进行UPLC-MS分析。为保证批次一致性，制备混合QC样品（各提取液等体积混合），并在整个采集序列中间歇运行。色谱分离和质谱检测采用Waters ACQUITY I Class PLUS UPLC系统联用Xevo G2 XS QTOF质谱仪。色谱分离使用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱，二元流动相为含0.1%甲酸的水溶液（A）和含0.1%甲酸的乙腈溶液（B）。离子化采用电喷雾离子源（ESI），质谱数据在正离子和负离子模式下分别记录。数据预处理（包括特征提取、保留时间对齐和强度归一化）在Progenesis QI（Waters）软件中完成。分析一致性和生物学重复间的变异通过主成分分析（PCA）和Spearman秩相关分析评估。代谢物推定鉴定通过将精确质量数和碎裂模式与KEGG（http://www.genome.jp/kegg/）、HMDB（https://hmdb.ca/）和Lipid Maps（https://lipidmaps.org/）数据库进行匹配。前体离子质量误差容限设为100 ppm，碎片离子为50 ppm。为确保鉴定可靠性，采用综合评分系统（满分60分，评估质量偏差、同位素分布和MS/MS碎裂匹配，每项20分）。仅保留总匹配得分≥40的代谢物，视为可靠注释用于后续分析。候选生物标志物筛选采用组合标准：Student's t检验p < 0.05，OPLS-DA的变量投影重要性（VIP）≥ 1（模型可靠性通过200次置换检验验证），以及|log₂FC| ≥ 0.58（差异倍数≥ 1.5）。显著改变的代谢通路通过基于KEGG的超几何过表达分析鉴定，显著性阈值设为p < 0.05。
【数据】样品量：50 mg鲜重；提取溶剂：甲醇:乙腈:水（2:2:1，v/v/v）；内标浓度：20 mg/L；匀浆：45 Hz/10 min；孵育：–20°C/1 h；离心：15,000 × g/15 min（4°C）；复溶：160 μL乙腈:水（1:1）；进样量：120 μL；质量误差：前体离子100 ppm、碎片离子50 ppm；评分阈值：≥40分；筛选标准：p < 0.05，VIP ≥ 1，|log₂FC| ≥ 0.58
2.4 转录组学分析
使用NEBNext® Ultra™ RNA Library Prep Kit（NEB，美国）从掌叶大黄褐色和绿色愈伤组织中提取总RNA。RNA完整性和纯度通过琼脂糖凝胶电泳、NanoDrop分光光度法和Agilent 2100 Bioanalyzer（美国Agilent Technologies公司）评估，RNA完整性数值（RIN）要求大于7.0。合格的RNA样品用于cDNA合成：mRNA先经poly(A)筛选富集，片段化后逆转录为双链cDNA（北京百迈客生物科技有限公司完成）。链特异性文库通过cDNA末端修复、接头连接和片段大小筛选制备，在Illumina NovaSeq测序系统（美国Illumina公司）上进行150 bp双端测序。初始质量控制去除含接头的读段、含>10%模糊碱基（N）的读段，以及≥50%碱基Phred评分≤10的读段。高质量读段使用Trinity（v2.13.2）默认参数进行从头组装，生成unigene重叠群。功能注释整合BLAST比对（E值≤1e−5）和InterProScan结构域预测，覆盖六个参考数据库：NCBI NR、Swiss-Prot（http://www.ebi.ac.uk/uniprot/）、Pfam（http://pfam.sanger.ac.uk/）、KOG/COG（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/research/COG/）、KEGG（http://www.genome.jp/kegg/）和Gene Ontology（GO）（http://www.geneontology.org/）。差异表达基因（DEGs）以DESeq2标准筛选（差异倍数≥ 2，FDR < 0.01）。
【数据】RNA完整性要求：RIN > 7.0；测序平台：Illumina NovaSeq；读长：150 bp双端；质控标准：去除接头、>10% N碱基、≥50%碱基Phred≤10；组装软件：Trinity v2.13.2；BLAST阈值：E值≤1e−5；DEG筛选：FC ≥ 2，FDR < 0.01
2.5 生理指标测定
#### 2.5.1 SA、ABA、JA、芥子酸、多巴胺和1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）的测定
水杨酸（SA）、脱落酸（ABA）、茉莉酸（JA）、芥子酸和多巴胺含量委托苏州梦犀生物科技有限公司（中国）通过HPLC-MS/MS测定。分析方法基于已建立的植物激素和生物活性化合物同步定量液相色谱-串联质谱方案（Shin et al., 2021）。取0.1 g组织样品，与……
（原文此处中断，后续步骤原文未在节选中提供）
【数据】样品量：0.1 g；测定方法：HPLC-MS/MS；委托单位：苏州梦犀生物科技有限公司
研究结果
3.1 绿色与褐色愈伤组织的形态学和组织学特征差异
掌叶大黄组织培养过程中，愈伤组织由绿色（A）变为褐色（B）（图1(a)）。绿色愈伤组织（A）细胞排列整齐、细胞数量多、形态完整，内部无物质积累；褐色愈伤组织（B）细胞排列紊乱、大小不一，部分细胞崩解，可见明显的蓝绿色酚类物质沉积（红色箭头所示）（图1(b)）。
TEM揭示了这种差异的亚细胞基础。绿色愈伤组织细胞小而排列紧密，细胞质致密（图2-A1）。细胞核大，核仁明显，位于细胞核一侧（图2-A2）。叶绿体结构完整，基粒片层排列规整（图2-A3），线粒体丰富，双层膜清晰可辨（图2-A4）。相比之下，褐色愈伤组织细胞体积增大，中央大液泡占据细胞大部分体积，将细胞质挤压至细胞边缘（图2-B1）。大量电子致密沉积物在液泡边缘积累（图2-B1、B2），并观察到部分细胞核解体（图2-B2、B8）。叶绿体膜受损，基粒片层紊乱并液泡化（图2-B3），淀粉粒数量增加（图2-B3、B7）。线粒体膜模糊，嵴丢失（图2-B4）。代谢物通过液泡膜从细胞质转运至液泡内（图2-B2、B7）。随着代谢物在液泡内积累，液泡膜破裂（图2-B5、B6）。随后，线粒体和叶绿体被扩张的液泡内容物压缩聚集（图2-B8）。此外，褐色愈伤组织细胞的细胞壁明显比绿色愈伤组织细胞更厚（图2-A1、B1）。这种细胞壁增厚表型与后续代谢组学和酶学数据揭示的木质素生物合成增强高度一致。
【数据】绿色愈伤组织：细胞排列整齐、形态完整、叶绿体基粒片层规整、线粒体双层膜清晰；褐色愈伤组织：细胞排列紊乱、液泡膜破裂、叶绿体膜受损、线粒体嵴丢失、淀粉粒增加、细胞壁增厚
3.2 掌叶大黄褐色愈伤组织的代谢组学分析
对绿色和褐色愈伤组织进行比较代谢组学分析，以鉴定掌叶大黄愈伤组织褐变的潜在代谢因素。OPLS-DA结果表明模型可靠性高，具有强解释力和预测力。200次置换检验进一步验证了模型的稳健性，确认不存在过拟合，支持其用于后续差异代谢物鉴定（图S1）。代谢组PCA分析显示，所有样品均位于95%置信椭圆内，绿色（A组）和褐色（B组）愈伤组织明显分离，表明褐变对代谢谱有显著影响（图S2(a)）。层次聚类分析揭示了绿色和褐色愈伤组织之间截然不同的代谢特征。前30个最显著变化代谢物的Z-score热图显示，样品按生理状态清晰聚类，生物学重复紧密聚集，表明数据重现性高（图3(a)）。值得注意的是，参与苯丙烷生物合成、黄酮生物合成和多酚化合物代谢的代谢物水平在褐色愈伤组织中显著上调或下调，提示褐变过程中次生代谢发生了系统性重编程（图S2(b)）。
所有样品共检测到12,740个质谱特征。经匹配得分≥40的注释过滤后，推定注释了5787个代谢物。以p < 0.05、VIP ≥ 1和|log₂FC| ≥ 0.58为阈值，从这些注释代谢物中鉴定出褐色和绿色愈伤组织之间的3222个差异代谢物。其中上调1429个，下调1793个（图3(b)）。通路富集分析突出显示了前五条显著扰动的通路，包括聚酮糖单元生物合成、黄酮生物合成、异黄酮生物合成、异喹啉生物碱生物合成和丙酸代谢（图3(c)）。其中，黄酮生物合成通路富集的差异代谢物数量最多，关键代谢物包括黄腐酚、（−）-表没食子儿茶素、绿原酸、樱花素、5-O-咖啡酰莽草酸和花青素（表S2）。此外，对绿色和褐色愈伤组织中差异最显著的前20个代谢物（按t检验筛选）进行了Pearson相关分析。其相关系数的层次聚类揭示了三个主要共表达模块，主要由黄酮类和酚酸类组成（图3(d)）。
【数据】质谱特征总数：12,740；注释代谢物数：5787（匹配得分≥40）；差异代谢物数：3222（上调1429、下调1793）；筛选阈值：p < 0.05、VIP ≥ 1、|log₂FC| ≥ 0.58；富集通路：聚酮糖单元生物合成、黄酮生物合成、异黄酮生物合成、异喹啉生物碱生物合成、丙酸代谢
3.3 掌叶大黄褐色愈伤组织的转录组学分析
从头组装共生成55,521条unigenes，N50长度为1896 bp，平均长度为1022 bp。测序数据总体GC含量约为48.3%。详细的unigene长度分布和完整组装统计见补充表S3和表S4。比较转录组分析检测到褐色和绿色愈伤组织之间的3771个DEGs，其中上调2130个、下调1641个（图4(a)）。对掌叶大黄褐色和绿色愈伤组织的3771个DEGs进行了整合注释。维恩图分析显示，3771个基因被数据库共同注释，形成高置信度核心基因集；这一结果表明这些基因在功能上保守且注释一致（图4(b)）。表达谱层次聚类将DEGs清晰分为两个不同簇，绿色和褐色样品之间界限分明。生物学三次重复组内聚类紧密，证实了转录组数据集的稳健重现性和完整性（图S3）。
GO功能注释将DEGs分布在三个主要本体类别中。细胞组分类别主要涉及膜、细胞部分、细胞、膜部分和细胞器。生物学过程以代谢过程、细胞过程和单一有机体过程为主；分子功能集中在分子功能、结合和催化活性（图4(c)、S4）。KEGG通路映射鉴定出20条显著富集通路（p < 0.05）。按富集程度排序，排名靠前的通路包括植物激素信号转导、苯丙烷生物合成、淀粉和蔗糖代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、抗坏血酸和藻酸盐代谢、半乳糖代谢、植物昼夜节律、光合作用和甘油脂代谢（图4(d)）。值得注意的是，苯丙烷生物合成通路包含关键结构基因如CAD1、CAD2、CHS3和ANS，而植物激素信号通路涉及关键调控因子如EIN4、PIL2和PIL4（表S5）。这些结果强烈表明，植物激素信号转导和苯丙烷生物合成相关基因的失调与掌叶大黄愈伤组织褐变密切相关。
【数据】unigenes总数：55,521；N50长度：1896 bp；平均长度：1022 bp；GC含量：48.3%；DEGs总数：3771（上调2130、下调1641）；显著富集通路数：20条；关键基因：CAD1、CAD2、CHS3、ANS、EIN4、PIL2、PIL4
3.4 生理指标与qPCR验证
与绿色愈伤组织（A）相比，褐色愈伤组织（B）在植物激素水平、酚类化合物积累和关键酶活性方面表现出显著差异。激素谱分析中，褐色愈伤组织中SA、ABA和JA的含量均显著高于绿色愈伤组织（p < 0.001），乙烯前体ACC在褐色愈伤组织中较绿色愈伤组织显著降低（p < 0.001），表明褐变过程中多种胁迫响应激素信号通路被强烈激活。次生代谢物方面，黄酮类、木质素、多巴胺和芥子酸在褐色愈伤组织中积累至显著更高水平（p < 0.001），表明……
（原文此处中断，后续内容未在节选中提供）
【数据】SA含量：褐色 > 绿色（p < 0.001）；ABA含量：褐色 > 绿色（p < 0.001）；JA含量：褐色 > 绿色（p < 0.001）；ACC含量：褐色 < 绿色（p < 0.001）；黄酮、木质素、多巴胺、芥子酸：褐色 > 绿色（p < 0.001）
讨论与解读
本研究通过细胞学观察、双组学联合分析和靶向生化检测，系统解析了掌叶大黄愈伤组织褐变的复杂调控网络。转录组分析鉴定了3771个DEGs，在植物激素信号转导通路中显著富集。褐色愈伤组织在核心信号组分上表现出显著转录变化，包括PYR/PYL（ABA受体）、ABF（ABA响应）、MYC2（JA信号）、NPR1（SA信号）和EIN2（乙烯信号）的上调（图7）。这些转录变化与SA、ABA和JA信号通路的激活同步发生，同时乙烯前体ACC显著减少（图5）。活性氧清除相关基因表达虽上调，但超氧化物歧化酶活性下降，导致ROS失衡和严重氧化胁迫。过量ROS积累加速脂质过氧化，损害细胞膜和液泡膜完整性并增加通透性。液泡膜破裂使正常情况下区隔于液泡内的酚类和黄酮类化合物与细胞质中的多酚氧化酶接触，从而触发酶促褐变。
【编译者解读】该研究通过多组学整合策略，将褐变机制从单一酶促反应拓展至"激素信号—ROS失衡—酚类合成—液泡区隔破坏"的系统调控框架，为药用植物组织培养褐变控制提供了多层次干预靶点。尤其值得关注的是，液泡膜破裂作为酚类底物与多酚氧化酶接触的关键事件被清晰揭示，提示稳定液泡膜完整性或调控酚类物质区隔化可能是比单纯抑制酶活性更有效的抗褐变策略。然而，研究主要基于组学关联分析，激素信号与转录调控之间的直接因果关系仍有待通过转基因或化学干预实验进一步验证。
参考来源
Zhou T. Integrated metabolomics and transcriptomics reveal that plant hormone signaling, phenylpropanoid biosynthesis, and flavonoid metabolism promote callus browning in Rheum tanguticum. Industrial Crops and Products, 2026. DOI: 10.1016/j.indcrop.2026.124164
DOI: 10.1016/j.indcrop.2026.124164