来源：A plug-and-play cytochrome P450 system enables de novo biosynthesis of 2-phenylethanol derivatives（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
芳香族化合物微生物合成常受限于多步代谢途径的复杂性。本研究构建了基于细胞色素P450BM3的即插即用系统，通过结构引导的定向进化获得高区域选择性和对映选择性的酶突变体，并在解脂耶氏酵母中实现(R)-苯乙醇二醇与酪醇的从头合成。5升生物反应器中(R)-PED产量达12.4 g/L，为迄今报道最高水平。该系统还首次实现红景天苷在该酵母中的生物合成，并意外发现糖基转移酶的混杂活性，2-苯乙醇-β-D-吡喃葡萄糖苷产量达13.0 g/L。
研究背景
2-苯乙醇（2-PE）是芳香醇代表物，因优雅玫瑰香气广泛用于香精、化妆品和食品工业。2-PE衍生物具有抗氧化、抗菌等多种药理活性，其结构修饰位点包括苯环、羟基和乙基链三个关键位置。苯乙醇二醇（PED）、酪醇和羟基酪醇等羟基化衍生物备受关注——对映体纯(R)-PED是合成(R)-去甲氟西汀、β-内酰胺抗生素等药物的关键手性砌块，酪醇则因广谱生物活性在制药工业广泛应用。目前这些化合物主要依赖化学合成，缺乏高效、特异的生物催化路线。本研究旨在开发可移植的P450氧化催化平台，实现2-PE衍生物的绿色生物制造。
研究方法
2.1 材料
异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG，>99%）、卡那霉素硫酸盐（>99%）和氨苄青霉素钠购自生工（中国上海）。胰蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖和不含氨基酸的酵母氮碱购自OXOID（中国上海）。NaCl、K₂HPO₄、KH₂PO₄均为市售。Primer STAR Max DNA聚合酶和限制酶Dpn I购自Takara（中国上海）。T5核酸外切酶购自New England Biolabs（Beverley, MA）。质粒小提纯化试剂盒和DNA清洁/提取试剂盒购自Genemark（Omega Biotek Inc., Georgia, USA）。DNA多片段组装使用Uniclone一步无缝克隆试剂盒（Genesand，中国北京）。寡核苷酸引物合成、基因合成和DNA测序由Genecreate（中国武汉）完成。其他化学品均为化学纯市售产品。
【数据】IPTG纯度：>99%；卡那霉素纯度：>99%；培养基组分：见正文
2.2 质粒、菌株与培养基
所有菌株和质粒列于表1和表S1。大肠杆菌JM109用于构建重组质粒，大肠杆菌BL21(DE3)用于P450BM3酶进化。大肠杆菌在37°C下于液体或固体Luria-Bertani（LB）培养基（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl）中培养。突变体筛选使用Terrific-Broth（TB）培养基。卡那霉素和氨苄青霉素使用终浓度为50 μg/mL。IPTG诱导蛋白表达终浓度为0.2 mM。解脂耶氏酵母Po1fΔKu70（Leu⁻，Ura⁻）为亲本底盘。补充酵母氮碱（YNB）培养基（6.7 g/L酵母氮碱、10 g/L葡萄糖、15 g/L Bacto琼脂，不含亮氨酸和尿嘧啶）用于转化子筛选。解脂耶氏酵母在复合培养基酵母蛋白胨葡萄糖（YPD）（20 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖）中培养。YP培养基含20 g/L胰蛋白胨和10 g/L酵母提取物，用于摇瓶发酵，葡萄糖浓度另行指定。
【数据】LB培养基：5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl；卡那霉素/氨苄青霉素：50 μg/mL；IPTG：0.2 mM；YNB：6.7 g/L酵母氮碱、10 g/L葡萄糖、15 g/L Bacto琼脂；YPD：20 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖；YP：20 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物；培养温度：37°C（大肠杆菌）
2.3 诱变与筛选
所有突变均基于PCR的NNK诱变产生，PCR扩增的目标DNA片段经Dpn I消化后用T5核酸外切酶组装。目标突变体组装产物转化至化学感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞。从转化平板挑取单菌落至含400 μL液体LB培养基（含卡那霉素）的96孔板中，37°C、900 rpm培养10小时。取200 μL种子培养物转移至含800 μL液体TB培养基（含卡那霉素和IPTG）的96孔深孔板中，25°C、900 rpm过夜培养，剩余培养物于−80°C备份保存。随后，诱导培养物离心收集细胞，4°C、4000 rpm离心10分钟。细胞用预冷100 mM磷酸钾缓冲液（pH 8.0）洗涤两次，重悬于96孔板中，加入400 μL反应混合物，含100 mM磷酸钾缓冲液（pH 8.0）、5%（w/v）葡萄糖和10 mM 2-苯乙醇。平板于25°C、800 rpm过夜反应。反应结束后，向反应混合物中加入等体积含十二烷的色谱级乙酸乙酯终止反应。所得溶液4000 rpm离心10分钟，有机相转移至1.5 mL Eppendorf管进行GC分析。性能优异的克隆进一步测序确认突变。所用引物列于表S2。
【数据】NNK诱变；培养条件：37°C、900 rpm、10 h（LB）；25°C、900 rpm、过夜（TB）；反应体系：100 mM磷酸钾缓冲液（pH 8.0）、5%葡萄糖、10 mM 2-PE；反应条件：25°C、800 rpm、过夜；离心：4°C、4000 rpm、10 min
2.4 蛋白表达与纯化
P450BM3酶分别接种至4 mL含卡那霉素的LB培养基中，37°C、220 rpm过夜培养。将4 mL过夜培养物转移至100 mL摇瓶中的50 mL含卡那霉素的TB培养基中。37°C、220 rpm继续培养2~3小时至OD₆₀₀达0.6~0.8，然后加入IPTG至终浓度0.2 mM，温度降至25°C。表达20小时后，6000 rpm、4°C离心10分钟收集细胞。细胞沉淀保存于−80°C直至进一步处理。细胞沉淀经超声破碎，破碎过程中管子置于冰浴中。收集裂解液，8000 rpm、4°C离心30分钟，所得棕红色上清液用0.45 μm滤膜过滤除菌。裂解液上样至镍亲和柱（GE Healthcare），用含500 mM NaCl和50 mM磷酸盐缓冲液（pH 8.0）的10~250 mM咪唑溶液洗脱。收集流穿液中的蛋白并浓缩，然后用Amicon Ultra离心过滤器（截留分子量50 kDa）脱盐并浓缩至终体积1 mL，液氮速冻后保存于−80°C。酶经SDS-PAGE分析。使用前取等分试样室温解冻，通过CO差光谱分析测定酶浓度（Zhou et al., 2019）。
【数据】诱导条件：IPTG 0.2 mM、25°C、20 h；离心：6000 rpm、4°C、10 min；裂解液离心：8000 rpm、4°C、30 min；咪唑洗脱：10~250 mM；超滤截留：50 kDa
2.5 2-苯乙醇羟基化动力学参数测定
测定P450BM3突变体的Kₘ和k_cat值。所有测定在2 mL Eppendorf管中进行，反应体系500 μL 100 mM磷酸钾缓冲液（pH 8.0），适配振荡加热（30°C、900 rpm）。反应混合物含0.5 μM P450BM3突变体、2 mM NADPH、5%（w/v）葡萄糖、1 U/mL GDH、5%甘油（w/v）及不同浓度2-苯乙醇（1 mM、2 mM、4 mM、5 mM、6 mM、8 mM、10 mM、15 mM、20 mM、30 mM和40 mM）。30°C、900 rpm反应30分钟后，加入等体积含十二烷的色谱级乙酸乙酯终止反应。所得溶液4000 rpm离心10分钟，有机相用于GC分析。反应至少重复三次。使用GraphPad Prism 8.0软件（La-Jolla, CA, USA）以双曲线拟合绘制底物消耗速率对相应底物浓度的曲线，确定动力学曲线、Kₘ和k_cat。转化数（TON）计算：反应混合物（总体积2.5 mL）含10 mM 2-苯乙醇、0.5 μM酶、1 mM NADP⁺、5%甘油和5%葡萄糖，溶于100 mM磷酸钾缓冲液（pH 8.0）。三个平行反应分别在50 mL摇瓶中于30°C、220 rpm进行。孵育18小时后，取500 μL样品，用含3 mM正十二烷（内标）的500 μL乙酸乙酯萃取。产物浓度通过气相色谱测定，TON计算为三次重复的羟基化产物平均浓度除以初始酶浓度。
【数据】反应体系：0.5 μM酶、2 mM NADPH、5%葡萄糖、1 U/mL GDH、5%甘油；2-PE浓度梯度：1~40 mM；反应条件：30°C、900 rpm、30 min；TON测定：10 mM 2-PE、0.5 μM酶、1 mM NADP⁺、30°C、220 rpm、18 h
2.6 2-苯乙醇转化为羟基化衍生物
构建的表达突变体的大肠杆菌细胞接种至3 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37°C培养6-8小时。取500 μL预培养物转移至50 mL含卡那霉素（50 μg/mL）的TB培养基中。细胞于37°C、220 rpm培养至OD₆₀₀约0.6~0.8，然后加入IPTG诱导。细胞继续在25°C生长14-16小时。培养结束后，5000g、4°C离心10分钟收集细胞，用磷酸钾缓冲液（100 mM，pH 8.0）洗涤两次，作为后续生物转化的催化剂。对于表达P450BM3 WT及其突变体的静息细胞转化2-苯乙醇为羟基化衍生物：将20 OD₆₀₀表达P450BM3 WT和P450BM3突变体的大肠杆菌细胞悬浮于5 mL含5%（w/v）葡萄糖的磷酸钾缓冲液（100 mM，pH 8.0）中，加入底物2-苯乙醇至终浓度10 mM。反应在30°C、220 rpm下进行。
【数据】预培养：37°C、6-8 h；诱导：OD₆₀₀ 0.6~0.8、IPTG、25°C、14-16 h；离心：5000g、4°C、10 min；静息细胞转化：20 OD₆₀₀细胞、5 mL缓冲液、5%葡萄糖、10 mM 2-PE、30°C、220 rpm
研究结果
3.1 工程化P450BM3实现2-PE选择性羟基化
根据羟基化位置和立体化学，2-苯乙醇（2-PE）可转化为五种可能产物：2-羟基苯乙醇（2-HPE）、(S)-苯乙醇二醇（(S)-PED）、(R)-苯乙醇二醇（(R)-PED）、3-羟基苯乙醇（3-HPE）和酪醇（图1）。我们首先评估了野生型P450BM3（WT）对2-PE的羟基化能力。使用携带P450BM3 WT的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在10 mM 2-PE条件下进行生物转化6小时。气相色谱（GC）分析结果显示，2-PE在邻位被羟基化生成2-HPE（图S1和S2），这与甲苯邻二甲苯单加氧酶催化反应生成三种产物不同（Notomista et al., 2011）。产物浓度仅达0.02 g/L，底物转化率12.9%。转化率和产物多样性均明显不足。因此，工程化P450BM3以获得高化学选择性、区域选择性和立体选择性的突变体，对高效生产2-PE特定羟基化衍生物十分必要。
已有报道指出P450BM3中A82残基在控制区域和立体选择性羟基化中发挥重要作用（Li et al., 2016a; Peng et al., 2022）。为使P450BM3催化2-PE羟基化的产物谱多样化，我们首先构建了A82NNK饱和突变文库。如预期，96孔板文库筛选发现三种新羟基化产物(R)-PED、(S)-PED和酪醇，但未检测到3-HPE（表S3）。其中A82F突变体表现最佳。在10 mM 2-PE全细胞生物转化中，A82F使底物转化率较野生型提高6.1倍，对(R)-PED的区域选择性为78.4%（表S4）。这些结果证实修饰P450BM3关键残基可同时改变产物谱和催化活性。
接下来，鉴于(R)-PED和酪醇具有高实用价值，我们旨在进一步提高对这些化合物的活性。A328残基位于酶的结合口袋中，与增强活性相关（Fansher et al., 2024; Zhou et al., 2019）。因此我们基于A82F在328位构建并筛选了饱和突变文库。双突变体A82F/A328N在区域选择性和活性方面优于其他突变体（表S5）。全细胞生物转化显示，A82F/A328N实现了100%区域选择性和对映选择性，2-PE催化转化数（TON）为7100，产生(R)-PED的区域选择性>99%，ee值100%（图2B和S3）。此外，2-PE在6小时内完全转化为(R)-PED（图2C）。与A82F相比，双突变体的区域选择性和对映选择性显著提高。据我们所知，这是首个直接从2-PE高效生产(R)-PED的系统。
此外，我们发现双突变体A82F/A328L（M2）以86%的区域选择性产生酪醇，但底物转化率降低。为提高区域选择性和活性，我们以M2为亲本模板进行进一步诱变。位于B′-螺旋的L75和V78残基被选为突变靶点，基于其突变可增强羟基化活性的报道（Fansher et al., 2024）。分别构建了L75和V78位点饱和突变文库，鉴定出三突变体A82F/A328L/V78E（M3）。该突变体实现98%区域选择性，TON为2758——选择性较M2提高15.3%，TON提高100%，尽管酪醇产量略有下降（图2D和E）。为进一步提升催化效率，我们靶向底物通道残基R47和Y51，其与活性提高相关（Carmichael and Wong, 2001; Li et al., 2022）。在M3基础上构建了两个位点的组合饱和突变文库。所得五突变体A82F/A328L/V78E/R47F/Y51F（M4）表现出>99%区域选择性，TON为5181，6小时内产生0.48 g/L酪醇（图2D、E和S4）。与A82F相比，这些数值分别提高9.3倍、17.2倍和13.7倍。与已报道的ToMO突变体（E103G/F176I和E103G/F176T，可转化>50%的0.24 g/L 2-PE）相比，M4显示出显著更高的转化速率（k_cat = 116.7 min⁻¹ vs 28.2–42.6 min⁻¹；表S6，图S6）（Notomista et al., 2011）。此外，P450BM3是单条多肽，而ToMO是多组分复合物，在生物制造中部署更为困难（Cafaro et al., 2002）。因此，突变体M4是从2-PE生产酪醇的更高效、更实用的系统。
【数据】WT产物：2-HPE，0.02 g/L，转化率12.9%；A82F：转化率提高6.1倍，(R)-PED区域选择性78.4%；A82F/A328N：100%区域/对映选择性，TON 7100，>99%区域选择性，100% ee，6 h完全转化；M3：98%区域选择性，TON 2758；M4：>99%区域选择性，TON 5181，0.48 g/L酪醇（6 h）；k_cat：116.7 min⁻¹（M4）vs 28.2–42.6 min⁻¹（ToMO突变体）
3.2 P450BM3突变体选择性羟基化2-PE的分子基础
突变体A82F/A328N对(R)-PED表现出>99%对映选择性，而突变体M4（A82F/A328L/V78E/R47F/Y51F）对酪醇生产表现出高区域选择性。为阐明这些不同催化行为的分子基础，进行了蛋白质结构预测、分子对接和分子动力学（MD）模拟。与野生型P450BM3相比，A82F突变缩小了活性位点尺寸（553.9 ų），并增加其疏水性，增强其与小疏水性底物的效率（图3A）。
对P450BM3突变体的后续对接分析提供了进一步见解。在A82F/A328N突变体中，A328N突变可与2-PE形成氢键，使底物略微垂直于血红素排列，结合能为6.27 kcal/mol（图3B）。2-PE苯环与T438、A264和A82F残基之间的额外疏水相互作用进一步有助于底物稳定（图3C）。这使得C2原子距反应性血红素氧3.7 Å，解释了(R)-PED的专一性产生。为评估该结合模式的动态稳定性，使用YASARA软件结合AMBER 14力场对每个突变体进行了100 ns全原子MD模拟。MD轨迹确认了对接鉴定的关键相互作用在生理条件下保持稳定。具体而言，在A82F/A328N突变体中，A328N与2-PE之间的氢键得以维持，平均供体-受体距离为3.23 ± 0.29 Å（图3F，d2），C2原子与血红素氧之间的距离在平均值3.67 ± 0.24 Å附近波动（图3F，d1），支持有利于(R)-PED形成的近攻击构象。
相比之下，对于M4突变体，底物的苯基直接延伸至三价铁-氧中心，将C6位氢原子置于铁-氧部分附近，结合能为5.7 kcal/mol，充分表明2-PE在A82F/A328N突变体中结合更牢固（图3D）。这种构型可能由V78E突变促进，该突变与底物的羟基形成氢键。此外，与F87的π-π堆积相互作用有助于稳定底物的苯环（图3E）。底物C6原子与血红素氧之间3.6 Å的距离有利于形成适于酪醇生成的近攻击构象。该突变体的MD模拟表明，V78E与底物羟基形成的氢键稳定维持在3.1 ± 0.36 Å（图3G，d4），而C6-血红素氧距离在模拟过程中平均为3.76 ± 0.26 Å（图3G，d3）。显然，M4在MD中的有效攻击构象远不如A82F/A328N，这完全印证了M4产物浓度仅为A82F/A328N一半的实验结果。此外，两个极性残基Arg47和Tyr51被苯丙氨酸取代，显著增加了活性口袋入口处的疏水性，促进2-苯乙醇进入。
【数据】A82F突变体活性位点：553.9 ų；A82F/A328N结合能：6.27 kcal/mol；C2-血红素氧距离：3.7 Å（对接）、3.67 ± 0.24 Å（MD）；A328N-2-PE氢键距离：3.23 ± 0.29 Å；M4结合能：5.7 kcal/mol；C6-血红素氧距离：3.6 Å（对接）、3.76 ± 0.26 Å（MD）；V78E-底物氢键距离：3.1 ± 0.36 Å；MD模拟：100 ns，AMBER 14力场
讨论与解读
合成生物学旨在通过酶表达的精准调控重编程微生物代谢以生产化学品。然而，一个基本约束仍然存在：酶本身的固有催化特性。许多天然或工程酶仅在狭窄条件下发挥最佳功能，限制了它们在不同微生物宿主之间的可转移性，阻碍了真正"即插即用"合成生物学的发展。此外，许多有价值化学品的生物合成途径在自然界中不存在，或因缺乏高效特异的催化剂而极其复杂。理性酶设计和定向进化的进展正直接解决这一瓶颈，通过创造新型生物催化功能，实现从头途径构建和复杂合成路线的简化。代谢工程驱动的稳健微生物底盘平行发展为提供所需细胞框架。然而，将先进酶模块无缝整合到这些优化宿主中以构建稳定、高性能的细胞工厂仍然是一个重大挑战。本研究通过开发P450驱动的即插即用平台弥合了这一差距。
编译者解读：本研究展示了酶工程与菌株工程协同设计的典范——先通过结构引导的定向进化获得高选择性P450突变体，再在解脂耶氏酵母中构建高效2-PE合成底盘，实现功能模块的即插即用。5升反应器中12.4 g/L (R)-PED和13.0 g/L 2-PE-葡萄糖苷的产量代表了芳香族化合物微生物合成的显著进展。值得注意的是，意外发现的糖基转移酶混杂活性提示了酶功能拓展的广阔空间。该平台的可扩展性和适应性为其他高价值芳香族化合物的绿色生物制造提供了可借鉴范式，但酶在工业条件下的长期稳定性及下游分离成本仍是产业化需考量的因素。
参考来源
Wu, Y. (2026). A plug-and-play cytochrome P450 system enables de novo biosynthesis of 2-phenylethanol derivatives. Metabolic Engineering. DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102493
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102493