来源：High-level secretory expression of recombinant type III human-like collagen α1 in Pichia pastoris via multilevel systematic optimization（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
胶原蛋白是动物体内含量最丰富的结构蛋白，在食品、材料、化工和医药领域应用广泛。本研究针对毕赤酵母表达重组人源III型胶原蛋白α1（hlCOLIII）产量不足的问题，从基因拷贝数、分子伴侣共表达、AOX1启动子转录调控和翻译效率四个层面进行系统优化，最终构建的高效表达菌株在5 L发酵罐中产量达到10.3 g/L，较初始表达水平提高44.8倍。研究还证实了hlCOLIII具有良好的抗氧化能力和促细胞增殖、迁移、黏附等生物活性，为其在生物医药材料领域的应用奠定了基础。
研究背景
胶原蛋白占动物总蛋白的30%，广泛分布于各类组织和器官中。胶原分子通过自组装形成纤维状和微纤维结构，其基本单元是由三条平行α链组成的三螺旋结构，其中(Gly-X-Y)n三肽重复序列是螺旋结构的关键组成部分。目前已发现至少29种不同类型的胶原蛋白。重组III型胶原蛋白在慢性伤口修复与再生、软骨再生、紫外线损伤皮肤愈合等方面发挥重要作用，其抗氧化能力和生物活性是其应用于组织工程、伤口愈合和抗衰老产品的基础。
当前市售胶原蛋白产品主要来源于羊、猪、牛等哺乳动物组织，但动物源胶原蛋白存在免疫排斥风险、病原体携带以及文化和宗教限制等问题。利用工程化毕赤酵母生产重组胶原蛋白是替代动物提取的有效途径，但产量仍有较大提升空间。
研究方法
2.1 菌株构建
hlCOLIII序列来源于实验室保存的基于(Gly-X-Y)n骨架的序列，以III型胶原蛋白α1链的三螺旋结构域为基础设计，并进行了增强蛋白质亲水性的修饰，得到人源化胶原蛋白片段。JM109菌株（实验室保存）和GS115菌株（Invitrogen，美国加利福尼亚）分别用作克隆宿主和表达宿主。表达载体pPIC9K和pGAPZA由实验室保存。多拷贝载体的构建过程如图1所示。
首先通过PCR获得表达盒片段，利用BamH I和Sal I双酶切产生酶切位点，随后用Bgl II和Sal I进行酶切（TaKaRa，中国北京）。使用T4 DNA连接酶（TaKaRa，中国北京）构建2拷贝质粒pPIC9K-2hlCOLIII。后续的pPIC9K-3hlCOLIII、pPIC9K-4hlCOLIII和pPIC9K-5hlCOLIII质粒以类似方式构建。菌株和质粒列于表S1中。
在多层级系统优化中，基因相关分子伴侣、转录因子和翻译相关因子的构建基于pGAPZA质粒。为降低成本，用潮霉素替代博来霉素进行筛选。使用表S2所列引物，从毕赤酵母GS115基因组中扩增相关基因。随后通过同源重组将表达盒串联组装，如图S1A和C所示，并转移至大肠杆菌JM109进行克隆。
【数据】菌株：JM109（克隆宿主）、GS115（表达宿主）；载体：pPIC9K、pGAPZA；酶：BamH I、Sal I、Bgl II、T4 DNA连接酶；筛选标记：潮霉素（替代博来霉素）
2.2 毕赤酵母转化
使用Gene Pulser Xcell电穿孔仪（Bio-Rad，美国加利福尼亚）将线性化质粒电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布于MD琼脂平板（g/L：YNB 13.4，葡萄糖20.0，琼脂20.0），30°C培养2–3天。
【数据】培养基：MD琼脂平板；YNB：13.4 g/L；葡萄糖：20.0 g/L；琼脂：20.0 g/L；温度：30°C；时间：2–3天
2.3 培养条件
从MD琼脂平板挑取毕赤酵母单菌落，接种至含10 mL YPD培养基（g/L：胰蛋白胨20.0，甘油20.0，酵母提取物10.0）中，30°C培养22 h。然后取2%的培养液接种至30 mL BMGY培养基（g/L：甘油10.0，胰蛋白胨20.0，酵母提取物10.0，YNB 13.4，KH2PO4 11.8，K2HPO4 3.0）中，置于250 mL摇瓶中30°C培养24 h。用无菌水清洗两次并弃去上清后，将毕赤酵母菌液转移至30 mL BMMY培养基（g/L：胰蛋白胨20.0，酵母提取物10.0，YNB 13.4，KH2PO4 11.8，K2HPO4 3.0）中。每24 h补加1%甲醇诱导重组蛋白表达。
【数据】YPD培养基：胰蛋白胨20.0 g/L、甘油20.0 g/L、酵母提取物10.0 g/L；BMGY培养基：甘油10.0 g/L、胰蛋白胨20.0 g/L、酵母提取物10.0 g/L、YNB 13.4 g/L、KH2PO4 11.8 g/L、K2HPO4 3.0 g/L；BMMY培养基：胰蛋白胨20.0 g/L、酵母提取物10.0 g/L、YNB 13.4 g/L、KH2PO4 11.8 g/L、K2HPO4 3.0 g/L；温度：30°C；时间：22 h/24 h；甲醇：1%（每24 h）
2.4 hlCOLIII拷贝数测定
按前述方法提取毕赤酵母基因组。构建质粒pPIC9K-GAPDH和pPIC9K-hlCOLIII，梯度稀释后同时建立标准曲线（图S2A和B）。使用以下公式计算基因组中hlCOLIII基因拷贝数：hlCOLIII基因拷贝数 = n(hlCOLIII)/n(GAPDH)。
【数据】计算方法：hlCOLIII基因拷贝数 = n(hlCOLIII)/n(GAPDH)；参照基因：GAPDH
2.5 UPR检测
按前述方法提取总RNA。通过qPCR确认ERO1、KAR2、PDI1和HAC1基因的转录水平。
【数据】检测基因：ERO1、KAR2、PDI1、HAC1；方法：qPCR
2.6 放大培养
5 L发酵罐使用BSM培养基（g/L：K2SO4 18.0，MgSO4·7H2O 14.9，CaSO4 0.95，H3PO4 27.0 mL，甘油40.0，4.4% PTM1（REBIO，中国上海））。发酵过程包括三个阶段：（1）批式阶段：当溶解氧（DO）开始上升时，表明甘油消耗结束。（2）甘油补料阶段：含1.2% PTM1的甘油补料培养基以18 mL/h/L的速率补加，湿重达到180–200 g/L时立即停止补料。（3）甲醇诱导阶段：使用含1.2% PTM1的甲醇补料培养基进行诱导。初始需要甲醇适应期，以较低流速补加，然后持续增加至7.2 mL/h/L。
【数据】BSM培养基：K2SO4 18.0 g/L、MgSO4·7H2O 14.9 g/L、CaSO4 0.95 g/L、H3PO4 27.0 mL/L、甘油40.0 g/L、PTM1 4.4%；甘油补料速率：18 mL/h/L；湿重：180–200 g/L；甲醇补料速率：最高7.2 mL/h/L
2.7 SDS-PAGE
hlCOLIII的SDS-PAGE和产量分析与先前测定方法一致。
【数据】方法：SDS-PAGE；参照：先前测定方法
2.8 蛋白纯化
利用重组蛋白携带的6×His标签进行Ni²⁺柱亲和层析。使用AKTA蛋白纯化仪进行纯化，通过ImageJ软件分析SDS-PAGE条带灰度值评估蛋白纯度。透析hlCOLIII溶液后，冻干样品以进行后续研究。
【数据】纯化方法：Ni²⁺柱亲和层析；仪器：AKTA蛋白纯化仪；分析软件：ImageJ
2.9 扫描电子显微镜（SEM）
SEM方法与先前测定一致。
【数据】方法：SEM；参照：先前测定方法
2.10 抗氧化活性检测
#### 2.10.1 DPPH自由基清除活性
将不同浓度的hlCOLIII溶液与DPPH工作液作为实验组加入。以蒸馏水为对照，室温避光处理30 min后，在517 nm处测定吸光度值。
【数据】波长：517 nm；温度：室温；时间：30 min；条件：避光
#### 2.10.2 ABTS清除活性
制备ABTS工作液：将5 mL 7 mM ABTS与88 μL 140 mM K₂S₂O₈混合，避光反应16 h。将不同浓度的hlCOLIII溶液与ABTS工作液作为实验组加入。30°C反应8 min后，在734 nm处测定吸光度值。
【数据】ABTS：7 mM，5 mL；K₂S₂O₈：140 mM，88 μL；反应时间：16 h（避光）；温度：30°C；时间：8 min；波长：734 nm
#### 2.10.3 超氧阴离子自由基（O₂·⁻）清除活性
在蒸馏水中制备50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.2），用50 mM HCl制备3 mM邻苯三酚溶液。将4.5 mL Tris-HCl缓冲液与300 μL不同浓度的hlCOLIII溶液在25°C混合预热后，加入300 μL邻苯三酚。反应8 min后加入两滴盐酸终止反应，在325 nm处测定吸光度值。
【数据】Tris-HCl缓冲液：50 mM，pH 8.2；邻苯三酚：3 mM（溶于50 mM HCl）；体积：Tris-HCl 4.5 mL + hlCOLIII 300 μL + 邻苯三酚 300 μL；温度：25°C；时间：8 min；波长：325 nm
#### 2.10.4 羟自由基（·OH）清除活性
依次混合1 mL 9 mM FeSO₄溶液、9 mM水杨酸-乙醇溶液、不同浓度的hlCOLIII溶液和8.8 mM H₂O₂溶液后，37°C反应30 min。在510 nm处测定吸光度值。
【数据】FeSO₄：9 mM，1 mL；水杨酸-乙醇：9 mM；H₂O₂：8.8 mM；温度：37°C；时间：30 min；波长：510 nm
2.11 生物活性检测
#### 2.11.1 细胞活性检测
人包皮成纤维细胞（HFF-1）在37°C、5% CO₂的细胞培养箱中培养。将含8×10³个细胞/孔的100 μL细胞悬液接种至96孔板中，培养24 h。用PBS洗涤细胞后，加入不同浓度的hlCOLIII（0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mg/mL），对照组加入DMEM。随后使用10%稀释的Cell Counting Kit-8（CCK-8）溶液在450 nm处测定细胞活力。
【数据】细胞：HFF-1（人包皮成纤维细胞）；接种密度：8×10³个细胞/孔；hlCOLIII浓度：0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL；温度：37°C；CO₂：5%；检测波长：450 nm
#### 2.11.2 细胞增殖
按照方法2.10.1，选择0.5 mg/mL hlCOLIII浓度，对照组给予等体积DMEM。分别培养24、36、48和60 h后测定吸光度。
【数据】hlCOLIII浓度：0.5 mg/mL；时间点：24、36、48、60 h
#### 2.11.3 细胞黏附
向96孔板中分别加入100 μL 0.5 mg/mL hlCOLIII和PBS，4°C孵育24 h。去除多余溶液后，加入热变性（56°C，30 min）的1% BSA溶液孵育1 h。用PBS洗涤孔后，每孔接种1×10⁵个细胞，37°C培养6 h。用PBS洗涤细胞后用CCK-8试剂盒测定。
【数据】hlCOLIII浓度：0.5 mg/mL，100 μL；孵育温度：4°C；时间：24 h；BSA：1%（56°C，30 min热变性）；细胞接种：1×10⁵个/孔；培养温度：37°C；时间：6 h
#### 2.11.4 细胞迁移
使用细胞划痕实验测定细胞迁移。当细胞融合度达到80%至90%时，纵向标记垂直底部形成细胞划痕。用PBS洗涤细胞去除划痕细胞。然后向6孔板中加入2 mL 0.5 mg/mL hlCOLIII，对照组加入等体积DMEM。在0、24和48 h时于显微镜下观察划痕宽度，并据此计算细胞迁移率。
【数据】hlCOLIII浓度：0.5 mg/mL，2 mL；细胞融合度：80%–90%；观察时间：0、24、48 h
研究结果
3.1 基因拷贝数对hlCOLIII表达的影响
近期研究表明，在毕赤酵母中通过上调外源基因拷贝数可在特定范围内提高蛋白表达水平。为提高hlCOLIII表达量，本研究构建了多拷贝菌株。多拷贝菌株可通过体外和体内两种方式获得。Sunga等人报道了利用转化后载体扩增方法（PTVA），通过在抗生素平板上反复传代实现多拷贝菌株的体内扩增。构建多个串联表达盒并将载体整合至基因组中则属于体外构建方法。本研究将这两种技术结合构建多拷贝菌株。
成功在体外构建了含1至5个hlCOLIII基因拷贝数的质粒（图1）。线性化后将这些质粒整合至GS115基因组中。在含遗传霉素（G418）的培养基上连续传代，逐渐增加抗生素浓度以筛选稳定表达的菌株。毕赤酵母在基因整合过程中可能遇到不稳定性问题。因此，从不同G418浓度的平板上挑取菌株，采用qPCR进行定量筛选以确定靶基因的精确拷贝数。表2列出了通过qPCR鉴定的重组菌株，其hlCOLIII基因拷贝数为1至10个。
为探究不同拷贝数的影响，测定了不同hlCOLIII拷贝数菌株的OD 600和hlCOLIII产量时间曲线。诱导144 h后各菌株生长无明显差异，表明增加拷贝数不会对菌株生长产生不利影响（图2A）。在144 h时，10拷贝菌株的hlCOLIII产量显著高于其他菌株，达到0.70 g/L，而1拷贝菌株为0.23 g/L，产量提高了三倍（图2B和C）。结果表明，在特定范围内增加基因拷贝数可以提高产量。
【数据】10拷贝菌株hlCOLIII产量：0.70 g/L；1拷贝菌株产量：0.23 g/L；产量提升：3倍；时间：144 h
3.2 内质网压力检测
毕赤酵母在表达外源蛋白时会经历内质网应激。在此条件下，内质网内未折叠蛋白的积累促使分子伴侣KAR2与IRE1解离，转而结合错误折叠的底物，促进其正确折叠。IRE1释放后发生寡聚化和自身磷酸化，激活其内切核酸酶活性。该酶活性促进HAC1 mRNA的剪接，使其翻译为功能性转录因子HAC1p。随后HAC1p进入细胞核，上调未折叠蛋白反应（UPR）靶基因的表达，包括ERO1和PDI。因此，本研究选择ERO1、KAR2、PDI1和HAC1作为靶基因，检测hlCOLIII的高表达是否引起UPR上调。
结果表明，与GS115相比，ERO1、PDI1和HAC1的转录水平上调（图2D），KAR2无明显变化。PDI1上调最为显著，在1拷贝菌株中增至6.96倍，在10拷贝菌株中增至8.2倍。这些发现表明增加拷贝数会进一步加深UPR。
【数据】PDI1上调：1拷贝菌株6.96倍、10拷贝菌株8.2倍；ERO1、HAC1：转录水平上调；KAR2：无明显变化
3.3 PpHAC1过表达增强hlCOLIII分泌
上述结果表明多拷贝菌株能有效提高hlCOLIII表达量，同时引起一定程度的UPR上调。UPR可通过激活下游基因在一定程度上增强内质网中的蛋白质折叠。然而，当外源蛋白过表达引起的内质网应激持续未解决时，细胞通常会在上游抑制外源基因的转录和翻译，并通过内质网相关降解（ERAD）等机制在下游降解错误折叠蛋白。长期的内质网应激还可进一步触发凋亡通路，诱导细胞凋亡。
为应对这些挑战，共表达分子伴侣已成为一种常见策略。该方法可提高外源蛋白的表达水平、改善其折叠状态并缓解内质网应激。KEX2负责切割外源分泌蛋白前体中的信号肽，其过表达可能提高蛋白分泌效率。LHS1、Ssa4和Kar2是Hsp70家族成员，在翻译后转运过程中与新生多肽链相互作用，维持多肽链的非折叠构象，确保其正确靶向至内质网。BMH2已被鉴定在囊泡运输中发挥关键作用，特别是在蛋白质从内质网到高尔基体的运输以及多聚膜蛋白向细胞表面的正向转运中，从而促进蛋白质表达。在毕赤酵母中，内质网应激触发成熟的HAC1 mRNA剪接并翻译为Hac1p，Hac1p转移至细胞核，与UPR响应元件结合，激活一系列与蛋白质折叠、质量控制、内质网相关降解和脂质合成相关的基因表达。AFT1参与毕赤酵母中的铁调控和碳响应，包括氧化还原过程和脂质代谢。
本研究选择了七个分子伴侣：LHS1、BMH2、HAC1、AFT1、KEX2、Ssa4和Kar2。主要考察了三种来源的HAC1——来自毕赤酵母的PpHAC1、来自酿酒酵母的ScHAC1和来自人的HsHAC1。与10拷贝对照菌株相比，PpHAC1和HsHAC1的过表达分别使hlCOLIII产量提高了15.7%和10.8%（图3A）。共表达PpHAC1获得了最高hlCOLIII产量，达到0.81 g/L。
采用RT-PCR检测UPR的激活情况以验证共表达PpHAC1的效果。数据显示，除HAC1基因外，所有UPR基因的转录水平均下降，表明内质网应激反应降低（图3B）。总之，PpHAC1的过表达除了提高hlCOLIII产量外，还能在一定程度上降低内质网压力。综上所述，可以推测PpHAC1的过表达通过部分缓解内质网应激来增强hlCOLIII的产量。
【数据】PpHAC1过表达：产量提高15.7%；HsHAC1过表达：产量提高10.8%；最高产量：0.81 g/L（PpHAC1共表达）；UPR基因：除HAC1外均下调
3.4 AOX1转录因子对hlCOLIII的影响
P AOX1在甲醇培养条件下可促进外源基因的高水平转录，但在其他碳源条件下受到强烈抑制。P AOX1的活性受Mit1、Mxr1和Prm1等转录因子的正调控。Prm1具有激活自身和Mit1表达的能力，进而诱导P AOX1的激活。Mit1的过表达可增强P AOX1的活性，而Mit1对Prm1的表达发挥反馈抑制作用。Mxr1与P AOX1的抑制密切相关，甘油通过激活细胞质中的Mxr1抑制P AOX1，但当甲醇作为碳源时Mxr1转移至细胞核，从而解除对P AOX1的抑制（图4A）。
本研究探讨了P AOX1转录激活因子对hlCOLIII表达的影响。通过pGAPZA质粒上的串联表达盒成功表达了相关转录因子（图S1A）。Prm1的过表达增强了hlCOLIII的产量，最高达到0.85 g/L（图4B和S1B），并使10-Pp-Prm1菌株中hlCOLIII的转录水平较对照菌株提高了62%（图4C）。这些结果表明Prm1的过表达增强了由P AOX1驱动的基因转录。
【数据】Prm1过表达最高产量：0.85 g/L；转录水平提升：62%（10-Pp-Prm1菌株 vs 对照）
3.5 翻译因子对hlCOLIII产量的影响
翻译是毕赤酵母基因表达过程中的关键阶段，mRNA上的遗传密码在此阶段被解码为蛋白质序列。原文此处未详述具体翻译因子的筛选与效果数据。
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究通过系统优化策略成功构建了高效表达hlCOLIII的10-Pp-Pr-Pab1重组菌株，优化策略涵盖基因剂量、分子伴侣共表达、P AOX1调控和翻译相关因子的表达。在5 L发酵罐中，hlCOLIII产量显著提高至10.3 g/L，与初始表达水平相比增加了44.8倍。同时测定了hlCOLIII的抗氧化和生物活性，结果表明其在ABTS自由基清除以及促进细胞增殖、黏附和迁移方面均表现出良好性能。hlCOLIII良好的抗氧化和生物活性特征提示其在抗氧化营养品和生物医学领域具有广阔的应用前景。
【数据】发酵罐规模：5 L；hlCOLIII产量：10.3 g/L；产量提升：44.8倍
编译者解读
该研究展示了典型的合成生物学系统优化策略——从基因拷贝数、分泌途径工程、转录调控到翻译效率的多层级递进式改造，体现了"量变到质变"的工程思维。值得注意的是，研究者并非简单堆叠各优化模块，而是针对每个层面的瓶颈进行定向破解，如通过共表达PpHAC1缓解内质网应激、通过Prm1增强P AOX1驱动的转录等。10.3 g/L的产量在重组胶原蛋白表达领域处于较高水平，但高拷贝菌株的遗传稳定性及长期传代后的表达一致性仍需进一步考察。此外，抗氧化与生物活性数据的完整性将为后续医用材料开发提供重要参考。
参考来源
Wang J. High-level secretory expression of recombinant type III human-like collagen α1 in Pichia pastoris via multilevel systematic optimization. International Journal of Biological Macromolecules, 2025.
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2025.144270
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2025.144270