来源：Rapid design and production of Alpha-1 antitrypsin fusion proteins in a plant-based cell-free expression system（Free Radical Biology and Medicine）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
α-1抗胰蛋白酶缺乏症（AATD）是一种罕见遗传病，现行疗法依赖每周输注昂贵的血浆来源AAT。将AAT与抗体Fc片段融合有望延长半衰期、减少给药频率，但计算模拟预测Fc结构域可能产生空间位阻，影响AAT与中性粒细胞弹性蛋白酶的结合。本研究利用烟草BY-2细胞来源的ALiCE®无细胞表达平台，在48小时内快速生产了AAT及三种不同连接肽的AAT-Fc变体，并系统评估了其抗弹性蛋白酶功能。结果显示野生型AAT产量达0.92 mg/mL且具有抑制活性，而所有Fc融合变体均因空间位阻丧失结合能力，与计算预测高度一致。
研究背景
AATD是由SERPINA-1基因突变引起的单基因蛋白错误折叠罕见病，已知超过100种等位基因变异，其中Z等位基因占严重缺乏症的95%，使患者易早期发展为蛋白酶相关破坏性慢性阻塞性肺疾病（COPD）/肺气肿。较少见情况下，错误折叠AAT聚合物在肝脏蓄积，导致内质网应激、炎症、纤维化乃至癌症。成熟AAT是含394个残基、52 kDa的糖蛋白，其表面暴露的20–24残基"反应中心环"（RCL）赋予其强效抗丝氨酸蛋白酶活性，尤其是对中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制。此外，AAT的三个糖链及其翻译后修饰对其抗炎和免疫调节功能至关重要。将AAT与免疫球蛋白Fc片段融合是延长血浆半衰期的潜在策略，但Fc结构域可能干扰RCL与弹性蛋白酶的结合，需要实验验证。
研究方法
计算模拟与结构分析
使用NeuroSnap软件（模型版本：Boltz-1x with potentials）预测野生型α-1抗胰蛋白酶（AAT）与人中性粒细胞弹性蛋白酶（HNE）复合物、AAT M358V及二聚体AAT M358V-Fc融合变体的三维结构。融合蛋白使用三种不同连接肽（'SSERKCCVE'、'GGGGS'或'EPKSCDKTHT'）建模，序列来源于UniProtKB（AAT: P01009 [25:418]；IgG1 Fc: P01857-1 [108:329]；HNE: P08246）。对Fc结构域施加共价约束以确保正确二聚化。每个蛋白选择每残基置信度得分（pLDDT）最高的模型进行后续优化。所选模型使用AMBER模拟软件包配合Amber ff19SB力场进行能量最小化。每个系统首先在含有10 Å缓冲层的TIP3P水盒子中溶剂化，并用抗衡离子中和。长程静电相互作用采用Particle Mesh Ewald（PME）方法处理。随后对优化模型进行结构分析。为评估与HNE的相互作用，使用PyMOL将AAT-Fc变体与优化后的AAT-HNE参考复合物中的AAT组分进行结构比对。该方向用于识别潜在的空间冲突，定义为任何HNE原子与AAT-Fc模型距离在3 Å以内。使用Visual Molecular Dynamics（VMD）中的自定义脚本计算RCL的溶剂可及表面积（SASA），并与参考复合物进行比较。所有最终模型使用PyMOL渲染和可视化。
【数据】软件：NeuroSnap (Boltz-1x)；力场：Amber ff19SB；水盒子：TIP3P，10 Å缓冲层；冲突阈值：3 Å；SASA算法：Shrake–Rupley滚动球算法
质粒DNA设计、生产与纯化
使用四种不同质粒用于ALiCE®平台：AAT M358V、AAT-SSE-Fc、AAT-G4S-Fc和AAT-EPK-Fc。AAT质粒构建体在pALiCE02骨架上包含AAT序列（UniProtKB P01009 25:418）及M358V突变，而AAT-Linker-Fc构建体包含相同AAT序列，但在AAT序列C末端引入三种特定连接肽序列（'SSERKCCVE'、'GGGGS'和'EPKSCDKTHT'），后接人IgG1 Fc结构域编码序列（UniProtKB P01857-1 108:329）。将Fc置于AAT C末端的选择是为了确保Protein A纯化后RCL位点（位于C末端附近）的存在，且这是大多数Fc融合蛋白的常规设计。这些构建体使用SnapGene®软件设计，并使用GenScript密码子优化在线工具针对本氏烟草表达进行密码子优化。AAT、AAT-SSE-Fc和AAT-EPK-Fc质粒由GenScript（美国）化学合成，而AAT-G4S-Fc以PCR从模板合成，不同片段使用Infusion Cloning System（Takara Bio Inc.，美国）连接。AAT编码表达质粒转化至DH5α感受态细胞（Thermo Fisher Scientific，美国），AAT-SSE-Fc、AAT-G4S-Fc和AAT-EPK-Fc构建体转化至CopyCutter™ EPI400™（LGC Biosearch Technologies，美国）细菌细胞。质粒DNA通过在37°C培养和诱导转化细菌生产，随后使用QIAprep Spin Miniprep Kit – Plasmid Purification（QIAGEN LLC，德国）提取。质粒经测序验证（Plasmidsaurus®，美国）并储存于−20°C。
【数据】质粒骨架：pALiCE02；连接肽：SSERKCCVE、GGGGS、EPKSCDKTHT；宿主菌：DH5α、CopyCutter™ EPI400™；培养温度：37°C；储存温度：−20°C
ALiCE®反应
质粒在冰上解冻，使用NanoDrop1000（Thermo Fisher Scientific，美国）测量浓度并调整至约300 ng/μL。反应通过移取50 μL体积的ALiCE®反应混合物（LenioBio GmbH，德国），加入5 nM、10 nM或20 nM浓度的DNA，按照制造商手册进行。对于蛋白酶抑制剂混合物（PIC）实验，制备100X储备溶液并以1X、2X或3X浓度加入反应混合物。PIC实验使用Halt™ PIC（Thermo Fisher Scientific，美国）和P9599 PIC（Sigma-Aldrich，美国）。对于苯甲基磺酰氟（PMSF）（Thermo Fisher Scientific，美国），使用1 mM终浓度。任何PIC中均未添加EDTA，因为EDTA与ALiCE®裂解液不兼容。总体而言，质粒DNA和其他化学品的总体积保持在约10 μL，以防止反应混合物过度稀释。反应在23–25°C温度和80–100%相对湿度（RH）条件下，于受控温湿度箱中的Orbit M60数字摇床（Labnet International，美国）上以700 RPM进行。在24和48小时间隔从ALiCE®反应裂解液中收集2 μL样品，稀释于58 μL PBS 1X中用于SDS-PAGE和Western Blot（WB）分析。
【数据】DNA浓度：5、10、20 nM；反应体积：50 μL；温度：23–25°C；湿度：80–100%；转速：700 RPM；取样：24 h、48 h；PIC浓度：1X、2X、3X；PMSF浓度：1 mM
蛋白提取
AAT和AAT-Fc蛋白按照ALiCE®方案从粗反应裂解液中提取。简言之，反应48小时后，将每个反应管中约50 μL的粗ALiCE®裂解液（含质粒、微粒体、酶、目标蛋白、宿主细胞蛋白、细胞代谢物及其他反应组分）在16,000 RCF、4°C离心20分钟。收集第一上清液（S1）至2 mL管中。为从沉淀的微粒体中释放目标蛋白，向反应管中加入50 μL 1%（w/v）正十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）（Thermo Fisher Scientific，美国）水溶液，并加入50 μL PBS 2X，使最终DDM浓度为0.5%（w/v）溶于1X PBS中。反应管在Orbit M60数字摇床（Labnet International，美国）上以300 RPM室温孵育30分钟，短暂涡旋后在16,000 RCF、4°C离心30分钟。收集含可溶性目标蛋白的第二上清液（S2）。S1和S2级分均通过SDS-PAGE、WB和ELISA分析。
【数据】离心：16,000 RCF，20 min，4°C（S1）；DDM浓度：1%（w/v）加入，终浓度0.5%（w/v）；孵育：300 RPM，30 min，室温；第二次离心：16,000 RCF，30 min，4°C
SDS-PAGE与Western Blot分析
SDS-PAGE和WB按照先前发表的方法进行。WB分析中，将免染胶转移至Trans-Blot® Turbo™ Mini PVDF Transfer Pack膜（Bio-Rad，美国），用酪蛋白封闭剂封闭，然后与多克隆山羊抗人AAT-HRP抗体（Bethyl Laboratories，美国）以1:10,000（0.1 μg/mL）稀释度或多克隆山羊抗人IgG-HRP（Southern Biotech，美国）以1:1000（0.5 μg/mL）稀释度孵育。最后，使用增强化学发光底物（Bio-Rad，美国）显色蛋白条带，并以化学发光检测模式检测。Prolastin-C（Griffols，美国）和AAT-Fc（YbdY biotechnologies，韩国）作为阳性对照。
【数据】一抗：山羊抗人AAT-HRP 1:10,000 (0.1 μg/mL)；山羊抗人IgG-HRP 1:1000 (0.5 μg/mL)；阳性对照：Prolastin-C、AAT-Fc
ELISA
使用夹心ELISA定量AAT和AAT-Fc水平。Thermo Scientific™ MaxiSorp™ 96孔板（Thermo Fisher Scientific，美国）在4°C下用100 μL/孔的多克隆兔抗人AAT捕获抗体（Dako，美国）以1:5000（1.46 μg/mL）稀释于PBS 1X中包被过夜。板用PBST（含0.05% Tween 20的PBS 1X）洗涤，用1%酪蛋白PBS 1X（Bio-Rad，美国）室温封闭1小时。洗涤后，加入100 μL/孔的AAT标准品（400至6.25 ng/mL，Calbiochem AAT，Millipore Sigma，美国）和AAT-Fc标准品（800至12.5 ng/mL，YbdY biotechnologies，韩国）以及样品（在PBS 1X中系列稀释），室温孵育1小时。板用PBST洗涤，并与100 μL/孔的多克隆山羊抗人AAT-HRP检测抗体（Bethyl Laboratories，美国）以1:40,000稀释度（0.025 μg/mL）在PBS 1X中室温孵育1小时。最终洗涤后，板用100 μL/孔的TMB底物（Thermo Fisher，美国）显色10–15分钟，并用等体积1N HCl终止。立即使用SpectraMax M4分光光度计（Molecular Devices，美国）在450 nm读取吸光度。
【数据】捕获抗体：兔抗人AAT 1:5000 (1.46 μg/mL)；AAT标准品：400–6.25 ng/mL；AAT-Fc标准品：800–12.5 ng/mL；检测抗体：山羊抗人AAT-HRP 1:40,000 (0.025 μg/mL)；显色：TMB 10–15 min；终止：1N HCl；读数：450 nm
蛋白纯化、渗滤与浓缩
提取后的S1和S2级分合并后进行后续处理。
【数据】原文未详述
研究结果
计算结构分析
图1A–D显示了能量最小化的参考AAT–HNE Michaelis复合物（野生型AAT）与三种分别使用EPK、G4S和SSE连接肽的Met358Val AAT-Fc融合模型的比较。这些连接肽序列的选择基于先前融合蛋白实验数据。连接肽内氨基酸的固有特性已知会影响结构动力学；例如半胱氨酸（Cys）可形成稳定蛋白结构的二硫键，甘氨酸（Gly）和丝氨酸（Ser）因其小侧链通常增强柔性，而脯氨酸（Pro）可通过限制骨架构象诱导刚性。此外，带电残基如谷氨酸（Glu）和赖氨酸（Lys）可通过静电相互作用调节连接肽行为。每个面板中两个AAT原mer以卡通形式呈现，分别为浅蓝色（链A）和柔粉色（链B）；反应中心环（RCL）以紫色显示，工程化连接肽残基以深绿色显示，Fc二聚体以春绿色显示。每个融合体的链A（和链B）与晶体AAT–HNE复合物的AAT部分叠加以便于直接视觉比较，比对后的HNE以灰色卡通显示。
图1对比了野生型AAT与三种Fc融合体在反应中心环（RCL）周围的空间环境。在参考结构（图1A）中，AAT以经典Michaelis样姿态与HNE结合，为RCL可及性提供了无冲突基准。当存在Pro/Thr丰富的EPK连接肽时（图1B），其刚性IgG1铰链几何结构使两个Fc CH2–CH3叶瓣紧贴反应中心环，显著减少了HNE可结合的空间（HNE红色区域所示）。二聚体中两个RCL的质心（COM）距离为37.6 Å，但两个连接肽（深绿色棍状）因其Pro/Thr残基的空间体积而保持良好分离。对于短而柔性的GGGGS（G4S）连接肽（图1C），情况相反：两条连接肽链中富含高柔性甘氨酸残基的五残基相互塌缩，拥挤在原mer之间的区域。此外，原mer间的RCL被拉得更近，COM距离缩短至26.2 Å。特别是链A的RCL似乎完全埋向Fc结构域，严重限制其可及性。对于SSERKCCVE（SSE）连接肽（图1D），连接肽区域显示二聚体中两条链之间的紧密相互作用。连接肽通过链间Glu403–Lys399盐桥稳定。然而，RCL间COM距离扩展至53.1 Å，Fc叶瓣对RCL施加的空间位阻较弱，使该构象比其他两种连接肽更有利于弹性蛋白酶结合。还可以看到链A中的RCL大部分暴露，与链B的RCL相比空间位阻较小。这个笔直九残基间隔物有效使两个Fc叶瓣远离环展开，使蛋白酶接近路径比EPK或G4S构建体明显更少受阻。
基于上述结构分析，我们假设两个几何参数对HNE与AAT-Fc构建体的有效结合至关重要：（i）Fc结构域对对接HNE的直接空间干扰程度，和（ii）反应中心环（RCL）的可及性，其必须可供切割。因此通过测量原子重叠来量化Fc结构域直接空间干扰的程度。每个能量最小化的融合二聚体与参考AAT–HNE Michaelis复合物的AAT亚基比对，并计数范德华表面位于任何HNE原子3.0 Å范围内的每个融合原子（图1B–D中红色）。SSERKCCVE（SSE）连接肽产生最小重叠，每个二聚体2 × 10²个原子；GGGGS（G4S）将计数增加至6 × 10²个原子；而IgG1铰链来源的EPKSCDKTHT（EPK）连接肽产生最大界面，1.3 × 10³个重叠原子。这些结果表明SSERKCCVE（SSE）连接肽设计可能为减少与HNE的空间干扰提供更有利的构型。
为评估假设中第二个关键几何参数（反应中心环的可及性），在VMD 1.9.4中使用Shrake–Rupley滚动球算法（800点Å⁻²）进行溶剂可及表面积（SASA）计算。将1.4 Å（水）至10 Å（约为HNE催化裂隙宽度的两倍）的探针半径应用于每个能量最小化融合模型和野生型AAT（PDB 3NE4）作为参考。使用高达10 Å的半径范围（接近HNE尺寸相关尺度）可以更现实地评估RCL是否充分暴露以容纳蛋白酶。与空间重叠分析结合时，SASA数据（补充图S1）表明SSERKCCVE（SSE）连接肽保留了最有利于弹性蛋白酶访问的几何结构。这是通过最小化空间冲突和最大化RCL暴露实现的，相比GGGGS（G4S）尤其是EPKSCDKTHT（EPK）连接肽（其模型导致显著RCL闭塞）。这一结构排序（SSE > G4S > EPK，基于原子重叠和RCL可及性）表明，仅基于这些几何参数，SSE融合体是变体中最有希望有效与HNE相互作用的候选者。
此外，这些结构观察意味着这些融合蛋白之间抗弹性蛋白酶活性的任何差异可能源于Fc介导的RCL空间屏蔽差异，而非AAT催化装置本身的显著改变。而且，融合的Fc结构域不仅影响初始非共价对接和P1-P1'切割的RCL可及性，还可能空间干扰serpin机制的后续关键构象转变。具体而言，对于不可逆蛋白酶抑制至关重要的RCL广泛插入β-折叠A，可能被Fc部分的存在所阻碍，这可能是某些AAT-Fc构建体抑制功效降低的额外因素。
超越这些特定几何评估，上述整体结构分析的进一步推断表明，三种AAT-Fc构建体可能表现出与单个HNE分子更可行的相互作用。这种1:1化学计量比的偏好是合理的，因为在这样的复合物中RCL可以以较少空间位阻实现HNE接合——这一优势对SSE变体尤为明显。相反，两个HNE分子同时结合可能会遇到显著空间障碍，使这种双重相互作用在生理条件下不太可能发生。
虽然AlphaFold 3等先进结构预测工具为蛋白质折叠和AAT-HNE结合提供了宝贵的见解，但此类工具在完全解析某些结构细节方面也有公认的局限性，特别是准确预测柔性环区域的精确构象或结合时发生的细微构象变化。因此，必须强调湿实验结果是最终验证这些计算模型所必需的。
【数据】COM距离：EPK 37.6 Å、G4S 26.2 Å、SSE 53.1 Å；原子重叠：SSE 2×10²、G4S 6×10²、EPK 1.3×10³；SASA算法：Shrake–Rupley，800点Å⁻²；探针半径：1.4–10 Å
AAT和AAT-Fc质粒合成与生产
根据结构模拟获得的结果，我们希望快速生产蛋白质以验证假设并确定哪种AAT-Fc变体最稳定且与HNE蛋白结合最有效。我们使用pALiCE2载体骨架生产目标蛋白。
图2显示了与ALiCE®系统一起使用的基因构建体。A：AAT构建体，B：AAT-SSE-Fc构建体，C：AAT-G4S-Fc构建体和D：AAT-EPK-Fc构建体。
【数据】载体骨架：pALiCE2；构建体数量：4种
AAT在ALiCE®中的表达与优化
图3显示了质粒浓度（纳摩尔，nM）对AAT产量的影响。8 μL Precision Plus All Blue和Precision Plus All Blue Unstained用作分子量标记物（M）。1 μL粗裂解液样品稀释于29 μL PBS 1X中用于分析。
【数据】样品量：1 μL粗裂解液+29 μL PBS 1X；标记物：8 μL Precision Plus All Blue
图4显示了质粒浓度（纳摩尔，nM）和提取条件（S1：去污剂增溶前和S2：去污剂增溶后）对AAT产量的影响。
【数据】提取条件：S1（增溶前）、S2（增溶后）
图5显示了不同蛋白酶抑制剂混合物（PIC）（24和48小时）和苯甲基磺酰氟（PMSF）（48小时）对AAT滴度的影响。
【数据】PIC处理时间：24 h、48 h；PMSF处理时间：48 h
AAT功能测试
图6显示了使用Band shift实验测试ALiCE®生产的AAT的功能。Prolastin-C用作AAT标准品（Std）。蓝色和橙色箭头标示相关条带。
【数据】标准品：Prolastin-C；AAT与弹性蛋白酶比例：原文未详述
AAT的LC-MS/MS分析
图7显示了基于LC-MS/MS数据的ALiCE®生产AAT的聚糖分布（A）和90.89%的序列覆盖率（B）。信号肽以红色框突出显示，AAT活性位点以绿色框突出显示。
【数据】序列覆盖率：90.89%；信号肽：红色框；活性位点：绿色框
AAT-SSE-Fc在ALiCE®中的表达
图8显示了质粒浓度对AAT-SSE-Fc产量的影响。1 μL粗裂解液样品稀释于29 μL PBS 1X中用于分析。
【数据】样品量：1 μL粗裂解液+29 μL PBS 1X
AAT-SSE-Fc功能测试
图9显示了使用Band shift实验测试ALiCE®生产的AAT-SSE-Fc的功能。Prolastin-C用作AAT标准品。1 μg所有AAT和弹性蛋白酶用于分析。
【数据】用量：1 μg AAT和弹性蛋白酶；标准品：Prolastin-C
所有AAT-Fc变体的Band-shift实验
图10显示了所有AAT-Fc变体和AAT标准品（Prolastin-C）在还原条件下与弹性蛋白酶3:1比例下的Band-shift实验，通过考马斯亮蓝染色凝胶可视化。
【数据】AAT与弹性蛋白酶比例：3:1；条件：还原条件；染色：考马斯亮蓝
残余弹性蛋白酶实验
图11显示了不同AAT-Linker-Fc蛋白变体和商业Prolastin-C（作为AAT标准品）的残余弹性蛋白酶实验。Prolastin-C在12 μg/mL的数据未评估且未显示。标准差以红色显示（n > 2）。
【数据】Prolastin-C 12 μg/mL数据未评估；标准差：红色显示，n > 2
产量汇总
AAT和AAT-Fc变体在ALiCE®反应裂解液中48小时反应后的滴度分别为0.92 mg/mL和0.57 mg/mL。AAT在Band-shift实验中显示出抗弹性蛋白酶活性。相比之下，AAT-Fc变体缺乏Band-shift实验活性，基于残余弹性蛋白酶实验的抗弹性蛋白酶活性较低，数据与计算结构预测一致。
【数据】AAT滴度：0.92 mg/mL；AAT-Fc滴度：0.57 mg/mL；反应时间：48 h
讨论与解读
本研究使用源自烟草BY-2植物细胞培养的真核无细胞表达平台ALiCE®生产了复杂糖蛋白AAT。虽然AAT已在不同类型表达系统中生产但成功有限，由于糖基化问题、半衰期缩短或其他生产挑战，均未导致FDA批准产品。基于本研究结果，ALiCE®平台的表达滴度和时间线非常有前景，在约48小时内实现高达0.92 mg/mL反应裂解液的AAT滴度。虽然已开发了基于原核和真核生物的不同无细胞表达系统，但它们在商业可用性、生产力、生产时间线和翻译后修饰（PTM）能力方面各不相同。大肠杆菌来源无细胞系统的创新已实现高达2.3 mg/mL重组蛋白的滴度，但这些系统通常缺乏人类相关治疗蛋白所需的PTM机制。此外，这些裂解液通常在37°C下连续蛋白生产通常不稳定超过10小时。
本研究的关键发现是：计算结构预测与实验功能数据高度一致——三种AAT-Fc融合变体均因Fc结构域对RCL的空间屏蔽而丧失弹性蛋白酶结合能力，其中SSE连接肽变体空间位阻最小但仍不足以恢复功能。ALiCE®平台的优势在于其真核糖基化能力和快速生产周期，使复杂糖蛋白的"设计-生产-测试"循环可在数天内完成，而非数周或数月。本研究的局限在于Fc融合策略本身的空间位阻问题未能通过连接肽设计完全解决，未来可能需要探索其他半衰期延长策略。
【编译者解读】该研究展示了无细胞表达系统在治疗性蛋白快速评估中的独特价值——从计算预测到功能验证仅需48小时，极大加速了"设计-构建-测试"循环。ALiCE®作为植物来源真核平台，兼具大肠杆菌系统的操作便捷性与哺乳动物细胞的翻译后修饰能力，特别适合糖蛋白候选药物的早期筛选。然而，Fc融合策略在本案例中因空间位阻失败，提示连接肽设计需更精细的蛋白质工程考量。该方法论为其他治疗性融合蛋白的快速可行性评估提供了可借鉴的范式。
参考来源
期刊：Free Radical Biology and Medicine, 2026
DOI: 10.1016/j.freeradbiomed.2025.12.012
DOI: 10.1016/j.freeradbiomed.2025.12.012