来源：Evaluation of Hanseniaspora thailandica YD32 as a potential co-starter with Saccharomyces cerevisiae for sugarcane-juice rum fermentation（LWT）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
朗姆酒的风味复杂度受发酵微生物群落的显著影响。本研究从甘蔗表面及内部组织分离四株本土非酿酒酵母，通过生长、糖利用、乙醇产量、酯类形成及β-葡萄糖苷酶活性等指标筛选，选定Hanseniaspora thailandica YD32与酿酒酵母进行不同初始细胞密度比的共发酵实验。结果表明，接种比例显著影响酵母种群动态与发酵性能，氮源可利用性进一步调节两菌株的生长平衡。YD32具备作为朗姆酒共发酵起始菌株的应用潜力。
研究背景
甘蔗是热带和亚热带地区广泛种植的重要糖料作物，是蔗糖、燃料乙醇及多种甘蔗发酵产品的主要原料。朗姆酒传统上以甘蔗汁或糖蜜为原料生产，其独特风味由原料组成、微生物发酵、蒸馏和陈酿工艺共同塑造。随着甘蔗蒸馏酒市场需求的增长，改善发酵性能和风味复杂度已成为提升产品质量和拓展甘蔗资源价值链的关键。
然而，部分朗姆酒产品仍存在香气复杂度不足或口感粗糙等问题，限制了品质提升和产品差异化。酒精发酵是朗姆酒生产的关键环节，不仅决定乙醇产量，还影响香气活性化合物的形成。工业生产普遍依赖酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），因其发酵能力强、耐受性好。但单一酿酒酵母发酵往往产生相对简单的香气轮廓，有时还伴随较高水平的高级醇等与粗糙口感相关的副产物。非酿酒酵母在甘蔗汁发酵中的应用有望增强终产品的风味复杂度。
研究方法
2.1 原料、试剂与培养基
新鲜甘蔗购自中国广西某种植园，并在24小时内处理。甘蔗汁通过机械压榨获得，经纱布过滤去除粗颗粒，4°C保存不超过24小时。发酵前，果汁经高压灭菌并无菌冷却至30°C。
可溶性固形物、可发酵糖和铵态氮在培养基配制前测定如下：可溶性固形物（°Brix）使用折光仪测定，充分混匀后按制造商说明进行温度补偿，并用蒸馏水校准。可发酵糖测定时，样品离心（8000 rpm，4°C，10 min），上清液用超纯水适当稀释后进行HPLC分析，确保蔗糖、葡萄糖和果糖浓度落在示差折光检测器校准曲线的线性范围内。稀释样品经0.22 μm滤膜过滤，使用碳水化合物分析柱（Aminex HPX-87P/Rezex RCM-Monosaccharide Ca2+）进行HPLC分析，超纯水为流动相（0.6 mL/min），柱温80°C，配示差折光检测器。最终糖浓度按实测浓度乘以相应稀释倍数计算。
酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖、果糖、蔗糖和酵母氮碱（YNB）购自国药集团（中国）。氨苄青霉素（0.1 g/L）加入分离平板以抑制细菌生长。YPD培养基含（g/L）：葡萄糖20.0、蛋白胨20.0、酵母提取物10.0。酵母分离富集培养基以甘蔗汁为基础，添加蔗糖（20 g/L）、酵母提取物（10 g/L）和蛋白胨（10 g/L），pH调至5.0。高、低氮培养基通过调整铵盐添加量获得不同初始铵态氮水平，同时保持相同糖浓度。H. thailandica YD32的选择性计数使用赖氨酸琼脂，含（g/L）：不含氨基酸和硫酸铵的YNB 6.7、葡萄糖20.0、L-赖氨酸盐酸盐5.0、琼脂20.0。
【数据】离心条件：8000 rpm，4°C，10 min；HPLC柱温：80°C；流动相流速：0.6 mL/min；氨苄青霉素浓度：0.1 g/L；YPD组分：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母提取物10 g/L；富集培养基：甘蔗汁+蔗糖20 g/L+酵母提取物10 g/L+蛋白胨10 g/L，pH 5.0；赖氨酸琼脂：YNB 6.7 g/L、葡萄糖20 g/L、L-赖氨酸盐酸盐5 g/L、琼脂20 g/L
2.2 酵母菌株与保藏
四株非酿酒酵母（YD11、YD16、YD121和H. thailandica YD32）分离自新鲜甘蔗表面（外源）和内部组织（内源）。H. thailandica YD32基于26S rDNA D1/D2区域测序鉴定为Hanseniaspora thailandica，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC，北京），保藏号为CGMCC No. 33320。商业酿酒酵母菌株1415购自北京百博生物技术有限公司（中国北京），用作参考发酵酵母。
除非另有说明，菌株在YPD琼脂斜面4°C保存，每4-6周传代一次。长期保藏时，培养物在含30%（v/v）甘油的YPD肉汤中−80°C保存。实验前，菌株在YPD肉汤中30°C、振荡（180 rpm）培养18-24小时至对数后期活化。细胞离心收集，无菌生理盐水或PBS洗涤两次，重悬至所需细胞密度。涉及单培养和共培养比较的接种实验中，细胞密度按活菌计数调整。
【数据】活化条件：YPD肉汤，30°C，180 rpm，18-24 h；长期保藏：−80°C，30%甘油；斜面保藏：4°C，4-6周传代
2.3 甘蔗源酵母的分离与初筛
#### 2.3.1 甘蔗表面与内部组织酵母的分离
内生酵母分离：甘蔗茎用自来水冲洗去除附着土壤和碎屑，无菌水充分冲洗，无菌条件下风干。新鲜甘蔗汁经机械压榨获得。取25 mL果汁无菌转移至含225 mL富集培养基的500 mL锥形瓶中，室温轻轻振荡培养至观察到明显发酵（CO2产生）。富集培养物随后进行十倍梯度稀释，取适当稀释度涂布于含氨苄青霉素（0.1 g/L）的YPD琼脂平板以抑制细菌生长。平板30°C培养48小时。选取形态不同的菌落，在YPD琼脂上划线纯化，4°C保存于YPD琼脂斜面。
外源（表面）酵母分离：甘蔗皮无菌剥离，切成小块，与富集培养基均质化。取25 g皮组织与225 mL富集培养基混合于500 mL锥形瓶中，室温富集培养。富集后，培养物十倍梯度稀释，涂布于含氨苄青霉素（0.1 g/L）的YPD琼脂平板，30°C培养48小时。代表性菌落划线纯化并保存于YPD琼脂斜面4°C。
【数据】样品量：25 mL果汁/225 mL富集培养基（内生）；25 g皮组织/225 mL富集培养基（外源）；氨苄青霉素：0.1 g/L；培养条件：30°C，48 h；稀释方式：十倍梯度稀释
#### 2.3.2 分离菌株的初步筛选
纯化菌株先在种子培养基（YPD肉汤）中30°C活化24小时。活化培养物按2.0%（v/v）接种量接入200 mL无菌甘蔗汁锥形瓶中，30°C培养2-5天。根据CO2产生量和感官香气特征（如果香和酒香）进行初步筛选，选择产气旺盛且香气理想的菌株进行后续分析。
【数据】接种量：2.0%（v/v）；培养基体积：200 mL；培养条件：30°C，2-5 d
2.4 非酿酒酵母分离株的生理特性表征
除非另有说明，生理特性表征所用发酵培养基指按2.1节方法制备的灭菌甘蔗汁。
#### 2.4.1 生长动力学
比较四株分离株在甘蔗发酵基质中的生长性能时，将YD11、YD16、YD121和H. thailandica YD32的活化培养物按1%（v/v）接种量接入含50 mL灭菌甘蔗汁的250 mL锥形瓶中，30°C振荡（180 rpm）培养。每2小时取样1 mL，适当稀释后用微孔板读数仪测定600 nm处光密度。绘制生长曲线，从指数期计算最大比生长速率（μmax）。
【数据】接种量：1%（v/v）；培养基体积：50 mL；培养条件：30°C，180 rpm；取样间隔：每2 h；检测波长：OD600
#### 2.4.2 乙醇、pH和温度耐受性测定
乙醇、pH和温度耐受性测定作为补充筛选试验，评估四株本土非酿酒酵母分离株对发酵相关胁迫条件的适应能力。活化酵母培养物接种于含不同乙醇浓度的YPD培养基、调至不同初始pH值的YPD培养基，或在不同温度下培养。培养24小时后通过测定OD600评估生长情况。
【数据】评估指标：OD600；培养时间：24 h；具体乙醇浓度、pH梯度、温度梯度：原文未详述
#### 2.4.3 β-葡萄糖苷酶活性与比活力
β-葡萄糖苷酶活性以对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（pNPG）为底物，采用广泛使用的比色法并稍作修改进行测定。通过测定400 nm处吸光度生成对硝基苯酚（pNP）标准曲线（0-1.0 mmol/L）。产酶时，YD11、YD16、YD121和H. thailandica YD32的活化培养物按2%（v/v）接种量接入250 mL锥形瓶中的发酵培养基，30°C振荡（180 rpm）培养24小时。培养物离心（8000 rpm，4°C，10 min），上清液作为粗酶提取物。活性测定时，0.1 mL粗酶提取物与0.2 mL溶于100 mmol/L柠檬酸-磷酸缓冲液（pH 5.0）的pNPG溶液（0.75%，w/v）混合，40°C孵育20分钟。反应……
【数据】底物：pNPG（0.75%，w/v）；缓冲液：100 mmol/L柠檬酸-磷酸缓冲液（pH 5.0）；反应条件：40°C，20 min；检测波长：400 nm；pNP标准曲线范围：0-1.0 mmol/L；接种量：2%（v/v）；产酶培养：30°C，180 rpm，24 h；离心：8000 rpm，4°C，10 min
研究结果
3.1 本土非酿酒酵母分离株的发酵性能与香气相关性状
用于发酵的灭菌甘蔗汁初始组成见表1。果汁可溶性固形物为18 ± 1 °Brix，初始pH为5.1 ± 0.2。蔗糖是主要的可发酵糖，初始浓度为145 ± 15 g/L，而葡萄糖和果糖浓度低得多，分别为7 ± 3 g/L和6 ± 2 g/L。总可发酵糖浓度（蔗糖、葡萄糖和果糖之和）为158 ± 15 g/L。初始NH4+-N浓度为42 ± 4 mg N/L，表明甘蔗汁基质含有可测量的铵态氮供酵母生长和发酵利用。这些组成数据为解读后续本土非酿酒酵母分离株的生长、糖消耗、乙醇产量和香气相关性状提供了必要的背景信息。
四株本土非酿酒酵母分离株在该灭菌甘蔗汁基质中的发酵性能表现出明显的菌株依赖性差异（图1a）。四株分离株中，YD121和H. thailandica YD32在发酵早期阶段生长相对较快，OD600值高于YD16和YD11。YD121在最初8-10小时内OD600增长最快，而H. thailandica YD32在后期保持相对较高的生长水平。相比之下，YD11在整个发酵过程中生长最低，表明其对甘蔗汁基质的适应能力较弱。这种菌株依赖性生长行为与先前报道一致，即非酿酒酵母的发酵性能和技术潜力具有高度的物种和菌株特异性。
为进一步确定观察到的生长差异是否与糖利用相关，发酵过程中监测了蔗糖、葡萄糖和果糖的残留浓度（图1b-d）。与甘蔗汁初始糖组成一致，蔗糖是主要可发酵糖，在96小时测定期间被四株分离株逐渐消耗（图1b）。其中，H. thailandica YD32的蔗糖消耗最为显著，其次是YD121和YD16，而YD11在发酵结束时残留蔗糖浓度相对较高。与蔗糖相比，葡萄糖和果糖初始浓度低得多，发酵期间变化不太明显（图1c和d）。然而，H. thailandica YD32对葡萄糖和果糖的利用也相对更强，表明该分离株利用甘蔗汁基质中主要可发酵糖的能力更强。这些结果支持以下观点：筛选非酿酒酵母菌株不应仅依赖生长曲线，还应包括底物利用和发酵性能参数。
所有组在96小时测定期间乙醇浓度逐渐增加，但最终取样点测得的乙醇浓度因菌株而异（图1e）。发酵96小时后，H. thailandica YD32在所测本土非酿酒酵母分离株中乙醇产量最高，其次是YD121和YD16，YD11乙醇产量最低。这一模式与糖消耗曲线基本一致，特别是蔗糖消耗，表明乙醇积累的差异主要与菌株利用可发酵糖的能力有关。然而，与强发酵性酿酒酵母菌株的典型预期相比，这些非酿酒酵母分离株产生的乙醇浓度仍属中等水平。这表明这些分离株对甘蔗汁发酵的贡献可能不仅限于酒精发酵能力，还可能涉及香气相关代谢特性。需要指出的是，该96小时测定设计为初步筛选实验，而非确定分离株的最大发酵能力。96小时后仍有大量残糖，尤其是H. thailandica YD32发酵组。因此，96小时观察到的乙醇浓度不应解释为这些分离株能产生的最大乙醇水平。相反，这些数据描述了它们在所测甘蔗汁条件下的相对短期发酵性能，为选择代表性非酿酒酵母进行后续共发酵实验提供了基础。
非酿酒酵母的选择不仅考虑乙醇产量，还考虑其在发酵过程中改变香气复杂度和产生菌株特异性代谢产物的能力。通过比较总酯产量和β-葡萄糖苷酶活性进一步评估了四株分离株的香气相关潜力（图1f）。H. thailandica YD32在所测分离株中总酯浓度和β-葡萄糖苷酶活性最高，表明其对香气形成和糖苷衍生香气释放的潜在贡献更强。酯类形成与酵母代谢密切相关，为发酵饮料贡献果香和花香，而β-葡萄糖苷酶可水解糖苷结合的香气前体，释放挥发性化合物以增强香气复杂度。在甘蔗基酒精发酵中，酯类也是重要的香气活性化合物，对终产品的感官特征贡献显著。因此，H. thailandica YD32相对较高的酯产量和β-葡萄糖苷酶活性表明，该分离株可能在甘蔗汁发酵过程中促进香气形成。
综合来看，96小时筛选结果表明，在所测甘蔗汁条件下，H. thailandica YD32在所测分离株中表现出相对良好的生长、较强的糖利用、适中的乙醇产量和较高的香气相关潜力。因此，选择H. thailandica YD32作为代表性非酿酒酵母分离株，用于后续与酿酒酵母的共发酵实验。
【数据】甘蔗汁初始组成：可溶性固形物18 ± 1 °Brix，pH 5.1 ± 0.2，蔗糖145 ± 15 g/L，葡萄糖7 ± 3 g/L，果糖6 ± 2 g/L，总可发酵糖158 ± 15 g/L，NH4+-N 42 ± 4 mg N/L；发酵时间：96 h；YD32乙醇产量为四株中最高（具体数值原文未详述）；YD32总酯浓度和β-葡萄糖苷酶活性为四株中最高（具体数值原文未详述）
3.2 酿酒酵母与H. thailandica YD32初始细胞密度比对甘蔗汁共发酵中酵母种群动态和发酵性能的影响
为评估初始细胞密度比对酵母种群动态和发酵性能的影响，使用酿酒酵母和H. thailandica YD32在灭菌甘蔗汁中进行单培养和共培养发酵。共培养按酿酒酵母与H. thailandica YD32的不同初始细胞密度比接种，即1:1、1:5、1:9、5:1和9:1。在96小时发酵测定中监测物种特异性活菌数曲线、残留总可发酵糖和乙醇产量。
活菌数曲线显示，初始细胞密度比强烈影响共培养系统的种群结构（图a-g'）。在单培养发酵中，酿酒酵母在整个测定期间保持高活菌数水平，证实其在甘蔗汁基质中的强发酵适应性。这一结果与先前报道一致，即酿酒酵母在酒精发酵中的优势地位与其高发酵能力、乙醇耐受性以及对营养受限和产乙醇环境的生理适应有关。
共培养系统中，较高的H. thailandica YD32初始比例改善了其在发酵培养基中的存续能力，而无论其初始细胞密度如何，酿酒酵母始终保持竞争性优势。初始接种比例对酵母存活、糖消耗和乙醇产量有强烈影响。不同接种比例下，残留总可发酵糖和乙醇产量呈现显著差异，表明接种比例是调控混合起始发酵中H. thailandica YD32贡献的重要可控因素。
【数据】接种比例：1:1、1:5、1:9、5:1、9:1（酿酒酵母:YD32）；发酵时间：96 h；监测指标：物种特异性活菌数、残留总可发酵糖、乙醇产量（具体数值原文未详述）
3.3 氮源条件对酿酒酵母与H. thailandica YD32共培养发酵的影响
在不同氮源条件下对酿酒酵母和H. thailandica YD32进行了铵态氮动态、生物量和pH的监测。高氮条件下，NH4+-N浓度随时间的变化趋势与低氮条件明显不同（图3a和b）。OD600和pH在发酵过程中的变化也因氮源条件而异（图3c）。
铵态氮的可利用性影响了共培养发酵中酵母种群动态，进而调节酿酒酵母与H. thailandica YD32之间的生长平衡。高氮条件下，两菌株的生长竞争格局与低氮条件存在差异，表明氮源供给是影响混合发酵中菌群结构的关键环境因子。
【数据】氮源条件：高氮、低氮（具体浓度原文未详述）；监测指标：NH4+-N浓度、OD600、pH（具体数值原文未详述）
讨论与解读
本研究评估了Hanseniaspora thailandica YD32作为酿酒酵母共起始菌株在甘蔗汁发酵中的潜力。在所测本土非酿酒酵母分离株中，YD32表现出良好的短期发酵性能和香气相关性状，包括生长、糖利用、乙醇产量、酯类形成和β-葡萄糖苷酶活性。这些特征支持其被选用于后续与酿酒酵母的单培养和共培养发酵实验。
酿酒酵母与YD32的初始细胞密度比强烈影响甘蔗汁共发酵中的酵母种群动态和发酵性能。较高的YD32初始比例改善了其在混合系统中的存续能力，而酿酒酵母在所有测试条件下均保持强发酵竞争力。活菌数曲线、残留总可发酵糖和乙醇产量的综合分析表明，初始接种比例是调控YD32在混合起始发酵中贡献的重要可控因素。不同铵态氮条件下的氮竞争实验进一步表明，铵态氮可利用性影响酿酒酵母与YD32之间的生长平衡。这些发现提示，在设计甘蔗汁朗姆酒混合起始发酵策略时，应同时考虑接种策略和氮源可利用性。
编译者解读
本研究的意义在于系统性地建立了"筛选-表征-共发酵验证"的非酿酒酵母应用评估链条。将接种比例和氮源供给作为两个可控工艺参数进行定量考察，为工业朗姆酒发酵的菌株配比优化提供了直接参考。YD32兼具适中的乙醇产量和较高的酯类形成及β-葡萄糖苷酶活性，恰好弥补了酿酒酵母香气单一的短板。值得注意的是，文中96小时筛选实验设计为初步筛选而非最大发酵能力测定，残糖量仍然较高，后续若能在实际生产条件下验证其风味贡献和发酵稳定性，将更有说服力。氮源调节作为种群平衡的杠杆，也提示了通过营养工程精细化调控混合发酵的可能性。
参考来源
Xu, Z.-H. (2026). Evaluation of Hanseniaspora thailandica YD32 as a potential co-starter with Saccharomyces cerevisiae for sugarcane-juice rum fermentation. LWT, 2026. DOI: 10.1016/j.lwt.2026.119667
DOI: 10.1016/j.lwt.2026.119667