来源：Discovery of a lignocellulosic hydrolysate-tolerant Saccharomyces cerevisiae strain and elucidation of a novel stress resistance mechanism（Biomass and Bioenergy）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
木质纤维素水解液中的抑制物严重制约酿酒酵母在生物制造中的发酵性能。本研究通过EMS辅助的适应性实验室进化（ALE），经90轮连续传代获得广谱耐受菌株40B。表型分析显示其在抑制物胁迫下生长和发酵性能显著提升；多组学分析揭示了抗氧化防御、能量代谢、膜完整性等协同适应机制，并首次报道酰胺-tRNA合成酶上调这一新型酵母适应策略。功能验证确认YEF1、FDH1、CRZ1过表达及PTC4、ISC1、GPA1突变在胁迫响应中的关键作用。
研究背景
木质纤维素生物质——尤其是玉米秸秆、小麦秸秆和甘蔗渣等农业废弃物——是可持续生物制造的可再生丰富原料。其水解可产生可发酵糖，用于生物乙醇及其他生物基产品生产。然而，预处理和水解过程中产生的弱酸、呋喃衍生物及酚类化合物等抑制物，严重损害酿酒酵母的细胞功能，显著降低其生长和乙醇生产效率。尽管酿酒酵母在酒精发酵中表现出一定耐受性，但复合抑制物仍是工业规模生物质利用的主要障碍。已有研究探索了基因工程、代谢工程和适应性进化等策略，但多集中于单一抑制物条件，对复合抑制物胁迫下酵母的系统适应机制认识仍有限。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本实验所用原始菌株酿酒酵母YBA_08（GenBank登录号KF141699.1和OK172582.1）分离自中国四川省宜宾市某白酒酿造厂。耐受菌株F20A、F20B、F20C、F40A、F40B、F40C、F65A、F65B、F65C通过适应性进化获得。单倍体酿酒酵母BY4742菌株和酿酒酵母INVSc1菌株保存于实验室菌种库。酿酒酵母敲除菌株BY4741由哥德堡大学Beidong Liu教授惠赠。大肠杆菌DH5α购自上海生工生物工程股份有限公司。质粒pUG6-TEF1p和pDDGFP-2由实验室保存。基因过表达菌株BY-ADE17、BY-GEX1、BY-GEX2、BY-CRZ1、BY-FDH1、BY-HXT10、BY-GPA1、BY-PTC4、BY-ISC1、BY-STE3、BY-YEF1为本研究构建。基因突变菌株M-GPA1、M-ISC1、M-PTC4亦为本实验构建。GFP标签定位菌株同样在本研究中构建。所有酿酒酵母菌株在YPD培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖）中、30°C、200 rpm振荡培养。大肠杆菌DH5α在LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl）中、37°C、250 rpm振荡培养。所有质粒的选择标记为200 mg/L氨苄青霉素。
【数据】菌株：YBA_08、F20A-F65C系列、BY4742、INVSc1、BY4741、DH5α；培养基：YPD（1%酵母提取物/2%蛋白胨/2%葡萄糖）、LB（10 g/L胰蛋白胨/5 g/L酵母提取物/5 g/L NaCl）；温度：30°C（酵母）、37°C（大肠杆菌）；转速：200 rpm（酵母）、250 rpm（大肠杆菌）；抗生素：200 mg/L氨苄青霉素
2.2 玉米秸秆水解液的制备
制备玉米秸秆水解液时，将玉米秸秆粉末过40目筛，干燥72小时以上，然后置于锥形瓶中。粉末浓度设定为12%（w/v），加入2%（w/v）的98%硫酸溶液。锥形瓶在220 rpm下振荡，30°C维持1天。随后混合物在121°C高压灭菌1小时。用10 mol/L NaOH调节pH至4.8。随后向混合物中加入纤维素酶（20 U/g）和β-葡萄糖苷酶（30 U/g），在50°C恒温振荡孵育72小时。最后将溶液通过0.22 μm滤膜过滤。过滤后的玉米秸秆水解液保存于−20°C。
【数据】秸秆粉末：过40目筛；干燥：>72h；固含量：12%（w/v）；硫酸：2%（w/v）98%硫酸；预处理：220 rpm、30°C、1天；高压灭菌：121°C、1h；pH调节：10 mol/L NaOH至pH 4.8；酶解：纤维素酶20 U/g + β-葡萄糖苷酶30 U/g、50°C、72h；过滤：0.22 μm滤膜；保存：−20°C
2.3 EMS辅助的适应性实验室进化（ALE）
将YBA_08菌株的新鲜细胞接种至20 mL YPD培养基中，30°C过夜培养。当OD600达到1.0时，收集1×10⁸个细胞至2 mL EP管中。细胞样品用0.1 mM磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）洗涤两次，重悬于970 μL PBS中。重悬细胞与30 μL（3%）EMS（甲基磺酸乙酯，Solarbio-E8150）混合，30°C孵育1小时进行诱变。加入等体积的5%无菌硫代硫酸钠溶液中和EMS毒性，细胞样品用5%无菌硫代硫酸钠洗涤两次、无菌水洗涤一次。然后将样品转移至含2 mL 10×YP、2 mL 20%葡萄糖、玉米秸秆水解液（培养基中糠醛浓度随菌株抗性增加而提高）的20 mL YPH液体培养基中，30°C、200 rpm培养。每轮进化开始时施加EMS诱变。每轮包括EMS处理以引入遗传多样性，随后是恢复期和在逐渐增加的水解液胁迫下的渐进进化。每轮突变株的单菌落通过PCR鉴定，引物见表S3。鉴定后的突变菌株保存于−80°C备用。最终经60轮进化筛选获得135株进化菌株。
【数据】初始接种：OD600=1.0时收集1×10⁸细胞；EMS浓度：3%（30 μL）；诱变条件：30°C、1h；中和：5%无菌硫代硫酸钠等体积；培养：YPH液体培养基（含2 mL 10×YP + 2 mL 20%葡萄糖 + 玉米秸秆水解液）、30°C、200 rpm；进化轮数：60轮；获得菌株数：135株
（图1见结果部分对应处）
2.4 荧光显微镜与细胞分析
细胞分析按照Wang等人[20]的方法进行。简要而言，使用Axio Imager A2显微镜（Carl Zeiss AG，Oberkochen，Germany）进行荧光显微观察，评估ROS积累、核染色质紊乱、线粒体膜损伤和液泡膜损伤。ROS、染色质、线粒体和液泡的染色剂分别为2′7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）（Sigma-35845）、二氨基苯基吲哚（DAPI）（Sangon Biotech-E607303-0002）、MitoTracker™ Green FM（Thermo Fisher Scientific-M7514）和MDY-64（Thermo Fisher Scientific-Y7536）。染色前，所有试剂和缓冲液均在30°C预热。为确保实验结果准确性，每张明场图像至少检查100个细胞。
【数据】染色剂：DCFH-DA（ROS）、DAPI（染色质）、MitoTracker Green FM（线粒体）、MDY-64（液泡）；预热温度：30°C；细胞计数：每张明场图像≥100个细胞
2.5 基因组测序与验证
提取的基因组DNA用Taq DNA聚合酶和上述引物进行PCR扩增。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检验。构建DNA文库——插入片段大小为350 bp的双端文库。使用Illumina NovaSeq PE150平台进行基因组测序（北京诺禾致源生物信息技术有限公司）。以酿酒酵母YBA_08为参考菌株，分别与K7（日本）[21]、YJSH1（中国）[22]、N85（中国）[23]、CEN.P113-7D（欧洲）[24]比对，确定进化基因中的单核苷酸多态性（SNP）、插入缺失（InDel）、结构变异（SV）和拷贝数变异（CNV），并构建全基因组突变谱（WGMP）。
【数据】测序平台：Illumina NovaSeq PE150；文库类型：双端、插入片段350 bp；参考菌株：YBA_08；比对菌株：K7、YJSH1、N85、CEN.P113-7D
2.6 RNA-seq与验证
收集处理0小时和3小时的原始菌株和进化菌株细胞，进行总RNA提取。使用TTTTT偶联磁珠从总RNA中分离mRNA，通过逆转录合成cDNA。将片段添加测序接头，PCR扩增构建测序文库。采用Illumina NovaSeq 6000平台进行片段测序。基因表达水平使用每千碱基每百万碱基转录片段数（FPKM）方法分析。样品间差异表达使用DEGseqR软件从三个生物学重复中分析，阈值标准为|log2（倍数变化）|≥1（FDR<0.05）[25]。差异表达基因（DEG）从KEGG和GO数据库进行注释[26]。转录组和重测序数据的质量控制如图S1所示，详细质控参数见表S4和表S5。
【数据】处理时间点：0h、3h；测序平台：Illumina NovaSeq 6000；差异表达阈值：|log2(foldchange)|≥1，FDR<0.05；生物学重复：3个
2.7 酶活测定
糠醛处理0小时和6小时后，收集原始菌株YBA_08和耐受菌株40B的细胞。使用辅酶I MAD含量检测试剂盒和辅酶II CAT含量检测试剂盒（Solarbio，北京，中国）按照制造商说明书测定细胞内MAD和CAT。通过碱性提取和超声破碎获得细胞中的MAD和CAT。将提取液加入试剂盒，测定吸光度变化。根据600 nm和240 nm波长处吸光度变化计算样品中MAD和CAT含量。
【数据】处理时间：0h、6h；检测波长：600 nm（MAD）、240 nm（CAT）；试剂盒：Solarbio辅酶I MAD含量检测试剂盒、辅酶II CAT含量检测试剂盒
2.8 基因功能验证
基因过表达模板来源于酿酒酵母YBA_08，使用酵母DNA提取试剂盒（Omega Bio-Tek，Norcross，GA，USA）分离。基因扩增所用引物详见表S2，重组菌株验证的电泳结果如图S2所示。引物设计和构建基于ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit V3（Vazyme，南京，中国）。经BamHI和XhoI双酶切及纯化后，靶向特定基因的PCR产物与PUG6载体连接，在基因5′端引入TEF1启动子。重组质粒在大肠杆菌DH5α菌株中确认后，通过电转化导入酿酒酵母BY4742菌株，具体方法如文献所述。
【数据】限制性内切酶：BamHI、XhoI；启动子：TEF1；载体：PUG6；宿主菌：E. coli DH5α、S. cerevisiae BY4742；转化方法：电转化
研究结果
3.1 通过EMS辅助适应性实验室进化获得抑制物耐受酿酒酵母菌株
为获得对多种木质纤维素水解液抑制物具有增强耐受性的酿酒酵母菌株，本研究采用了EMS辅助的适应性实验室进化（ALE）策略。在进化过程中，木质纤维素水解液中代表性抑制物——包括乙酸、糠醛和酚类化合物——的浓度逐步提高，以施加持续的选择压力。经过多轮EMS辅助适应性进化和筛选，获得一株命名为40B的耐受菌株。如图1所示，在高浓度木质纤维素水解液环境中，菌株40B相比亲本菌株表现出显著生长优势。这些结果表明，通过EMS辅助的适应性实验室进化成功获得了对多种抑制物具有广谱耐受性的酵母菌株。
【数据】进化策略：EMS辅助ALE；抑制物类型：乙酸、糠醛、酚类化合物；获得菌株：40B；表型：高浓度水解液中显著生长优势
3.2 进化菌株在多抑制物胁迫下的表型特征
为评估进化菌株在木质纤维素水解液胁迫下的耐受表型，对菌株40B和亲本菌株YBA-08的细胞完整性和损伤进行了比较。暴露于木质纤维素水解液后，菌株40B的内质网（ER）结构完整性相比YBA-08显著改善，ER损伤减少30%（图2）。此外，在高抑制物条件下，菌株40B的细胞核损伤显著降低（P < 0.05），表明抑制物胁迫期间细胞稳定性增强。这些表型差异证明，进化菌株在复合抑制物条件下维持了更好的细胞器完整性，与其在木质纤维素水解液环境中增强的生长性能一致。
为进一步表征氧化应激相关表型，比较了菌株40B和亲本菌株YBA-08的细胞内活性氧（ROS）水平和抗氧化酶活性。随着过氧化氢浓度的增加，两株菌中ROS积累细胞的比例均增加。然而，在7.5 mM过氧化氢处理下，约80%的YBA-08细胞积累ROS，而40B菌株仅约50%的细胞显示ROS积累（图3）。此外，暴露于木质纤维素水解液后，菌株40B相比YBA-08表现出显著较低的丙二醛（MDA）水平和较高的超氧化物歧化酶（SOD）活性，表明抑制物胁迫下脂质过氧化减少、抗氧化酶活性增强（图3）。这些结果表明，进化菌株在木质纤维素水解液和氧化胁迫条件下表现出改善的氧化应激相关表型[29]。
【数据】ER损伤减少：30%；核损伤：P<0.05显著降低；7.5 mM H₂O₂下ROS积累细胞比例：YBA-08约80% vs 40B约50%；MDA水平：40B显著低于YBA-08；SOD活性：40B显著高于YBA-08
3.3 与抑制物耐受相关的基因组突变
为鉴定与增强的抑制物耐受性相关的遗传变化，对菌株40B进行了全基因组测序，并与亲本菌株YBA-08进行比较。基因组分析显示，菌株40B中1428个基因积累了单核苷酸多态性（SNP）和插入缺失（InDel）突变。这些突变分布于参与多种细胞过程的基因中，包括信号转导、线粒体功能和应激反应。值得注意的是，在数个先前与胁迫适应相关的基因中鉴定到突变，包括PTC4、ISC1和GPA1。此外，在IRA1和IRA2中检测到突变，这两个基因编码cAMP-PKA信号通路的负调控因子。对于转录组分析鉴定的数个候选基因（包括PTC4、ISC1和GPA1），观察到的耐受表型不能仅由转录变化完全解释。全基因组测序揭示这些基因在菌株40B中存在非同义突变，提示序列变异可能导致了进化菌株与亲本菌株之间的功能差异。
【数据】突变基因数：1428个；突变类型：SNP、InDel；关键突变基因：PTC4、ISC1、GPA1、IRA1、IRA2；突变性质：非同义突变
3.4 转录组响应揭示协调的胁迫适应通路
为进一步研究抑制物耐受相关的转录响应，在木质纤维素水解液胁迫下对菌株40B和亲本菌株YBA-08进行了比较转录组分析。RNA-seq分析鉴定到两菌株间1307个差异表达基因（DEG）（P < 0.05），其中675个为共有DEG，632个为进化菌株中独特检测到的DEG。基于GO和KEGG注释的功能富集分析显示，菌株40B中上调基因显著富集于氧化应激响应、能量代谢、细胞器组织和蛋白质合成相关过程（图S3）。值得注意的是，数个氨酰-tRNA合成酶基因——包括Glu-tRNA合成酶和Asp-tRNA合成酶——在菌株40B中显著上调，表达量分别增加约1.5倍和2.3倍（表S1）。此外，多个转录调控因子如HAP3、AFT1和SMP1在进化菌株中也表现出表达水平改变。总体而言，这些转录组结果揭示了进化菌株在多抑制物胁迫下的协调转录重塑。
【数据】DEG总数：1307个（P<0.05）；共有DEG：675个；40B特有DEG：632个；Glu-tRNA合成酶上调：约1.5倍；Asp-tRNA合成酶上调：约2.3倍；差异表达转录因子：HAP3、AFT1、SMP1
3.5 关键基因的过表达与突变功能验证
为验证基因组和转录组分析鉴定的候选基因的功能贡献，选取11个基因（ADE17、GEX1、GEX2、CRZ1、FDH1、HXT10、GPA1、PTC4、ISC1、STE3和YEF1）进行功能验证。每个基因在强TEF1启动子控制下过表达，所得菌株在五种代表性木质纤维素水解液抑制物条件下进行评估（图4）。结果显示，ISC1、FDH1和ADE17的过表达在所有测试抑制物环境中均显著增强耐受性，其中ISC1在香草醛和糠醛胁迫下赋予约15-20%的耐受性提升。CRZ1和GEX1的过表达在大多数抑制物条件下也导致耐受性增强。相比之下，GPA1和YEF1的过表达导致抑制物胁迫下生长降低，表明对耐受性有负面影响。
为进一步区分基因剂量和序列变异的影响，构建并评估了基因敲除菌株、野生型过表达菌株和过表达菌株40B中鉴定到的突变等位基因的菌株（图5和图S4）。对于GPA1，敲除导致香草醛耐受性显著下降（log2 < −14），而野生型过表达和突变等位基因表达均提高耐受性。ISC1和PTC4也观察到类似模式——敲除显著降低耐受性，而过表达和突变等位基因表达在不同抑制物条件下不同程度地增强耐受性。除基于生长的评估外，表现出增强耐受性的菌株在抑制物胁迫下显示较低的细胞内ROS积累和减少的线粒体损伤，而耐受性降低的菌株则表现出增加的氧化应激相关表型。总之，这些结果表明基因剂量和序列变异共同促成了多抑制物条件下的差异耐受表型。
【数据】验证基因数：11个（ADE17、GEX1、GEX2、CRZ1、FDH1、HXT10、GPA1、PTC4、ISC1、STE3、YEF1）；启动子：TEF1；抑制物条件数：5种；ISC1耐受性提升：15-20%（香草醛和糠醛胁迫）；GPA1敲除：香草醛耐受性log2 < −14；效应方向：ISC1/FDH1/ADE17正向、GPA1/YEF1负向
讨论与解读
本研究通过EMS辅助的适应性实验室进化获得了对多种木质纤维素水解液抑制物具有显著增强耐受性的进化酿酒酵母菌株40B。通过整合基因组、转录组、表型和功能分析，本研究为酵母如何适应真实木质纤维素水解液所代表的复合多抑制物环境提供了连贯的解释。菌株40B增强的耐受性并非源于单一主导机制，而是能量代谢、氧化应激防御、胁迫信号传导和蛋白质稳态的协同调控。这一适应性响应的核心特征之一是能量代谢的增强，尤其是三羧酸（TCA）循环——SDH1、IDP2和FUM1等关键TCA循环基因的上调提示代谢通量增加以支持抑制物胁迫下的ATP生成和氧化还原平衡。虽然TCA循环激活此前已与乙酸、糠醛和HMF等单一抑制物的耐受性相关联，但多数先前研究在简化条件下进行；本研究结果突出了复合抑制物胁迫下TCA循环增强的重要性，将中心代谢定位为复杂水解液环境中维持细胞功能的关键枢纽。强化抗氧化防御是另一主要组成部分。
编译者解读： 该研究的方法论亮点在于将EMS化学诱变与ALE相结合，大幅提升了突变多样性，使菌株在60轮内即获得广谱耐受性。从合成生物学应用角度，40B菌株中氨酰-tRNA合成酶上调这一新机制的发现，为理性设计工业菌株提供了全新靶点。值得注意的是，GPA1和YEF1过表达反而降低耐受性，提示基因剂量效应的复杂性——这提醒我们在构建细胞工厂时，不能简单采用"过表达即有益"的策略。未来若能将40B菌株的关键突变组合导入工业底盘菌株，或可进一步提升木质纤维素水解液的发酵效率。
参考来源
Zhang Z. Discovery of a lignocellulosic hydrolysate-tolerant Saccharomyces cerevisiae strain and elucidation of a novel stress resistance mechanism. Biomass and Bioenergy, 2026. DOI: 10.1016/j.biombioe.2026.108941
DOI: 10.1016/j.biombioe.2026.108941