来源：Engineering MtrAB two-component system enhances protein and glutamate export in corynebacterium glutamicum through cell wall remodeling（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
谷氨酸棒状杆菌是蛋白质分泌、表面展示和谷氨酸生产的优良细胞工厂，但其复杂的细胞壁结构构成了生物大分子外泌的瓶颈。本研究以MtrAB双组分系统为靶点，通过肌醇沉默系统实现mtrAB表达的动态调控，在避免生长缺陷的同时显著提升多种重组蛋白的分泌效率。工程菌株在补料分批发酵中使角质酶变体LCC-A2活性提高2.58倍，并增强了蛋白质表面展示和谷氨酸分泌。蛋白质组学与细胞壁结构表征揭示，细胞壁肽酶是提高细胞壁通透性的关键靶点。
研究背景
微生物细胞工厂已被广泛用于以经济环保的方式从廉价原料生产有价值的化合物。尽管生物技术不断进步，但产物产量和生产率仍常受限于微生物固有的生物合成能力。经典策略多聚焦于优化产物合成代谢途径中基因的表达水平，而细胞包膜工程则通过重塑细胞膜和细胞壁来克服分泌屏障。例如，地衣芽孢杆菌中通过过表达支链脂肪酸转录因子bkdR和乙酰转移酶plsY、plsC，同时删除磷脂酰丝氨酸合成酶ppsA和心磷脂合成酶clsA，可增加细胞膜负电荷和通透性从而促进重组蛋白分泌。然而，这类膜修饰策略往往损害细胞膜完整性，导致细胞裂解和非预期释放。谷氨酸棒状杆菌具有复杂的细胞壁结构，如何通过工程化细胞壁生物合成来影响多种生物大分子的外泌，目前仍缺乏系统认识。
研究方法
材料与方法详见补充材料文件，涵盖以下内容：菌株与质粒构建、转化效率计算、酶活测定、实时荧光定量PCR、光学与荧光显微镜观察、流式细胞术分析、荧光强度检测、蛋白质检测与定量分析、透射电子显微镜（TEM）、细胞包膜提取与分析、蛋白质组学分析、分批发酵与补料分批发酵及分析方法。
（原文方法部分为指向补充材料的概述性描述，具体分步操作未在正文节选部分详述。）
【数据】具体分步实验参数：原文未详述（见补充材料）
研究结果
3.1 肌醇沉默系统调控MtrAB双组分系统增强α-淀粉酶分泌
已有研究表明，革兰氏阳性菌和分枝杆菌具有作为通透性屏障的厚细胞壁。由于胞内合成的生物大分子必须穿越细胞壁才能实现胞外转运，细胞壁重塑被认为对高效生物分子外泌至关重要。为验证这一假设，研究者敲除了mtrAB基因并评估该缺失对异源蛋白生产的影响。然而，△mtrAB突变株的细胞适应性和电转化效率显著下降，不利于工业发酵和遗传改造。
为获得可控的细胞壁缺陷表型，研究者用肌醇磷酸合酶ino1基因的肌醇可阻抑启动子P ino替换mtrA上游的天然启动子，构建了条件突变株。在含葡萄糖条件下，P ino -mtrAB菌株的mtrA和mtrB表达量较野生型（WT）分别提高2.4倍和2.9倍（图1A）。相反，加入1%肌醇（MI）后，这些基因的表达量较WT分别降低107.8倍和65倍（图1A）。
随后比较了WT、△mtrAB和P ino -mtrAB菌株的生理和形态特征。在不含MI时，P ino -mtrAB菌株的生长曲线、电转化效率和抗生素敏感性与WT相当（图1B及补充材料）。加入MI后，所有菌株的生长速率和最终细胞密度（OD600）均下降，这可能归因于谷氨酸棒状杆菌将MI和葡萄糖作为碳源共利用（图1B）。其中，P ino -mtrAB菌株在含MI条件下出现轻微生长缺陷，而△mtrAB菌株在同一条件下表现出更明显的生长缺陷（图1B）。用青霉素和万古霉素处理谷氨酸棒状杆菌时也出现类似情况，表明mtrAB缺失比mtrAB干扰对细胞适应性影响更强。
采用NileRed和Hoechst 33342染色的荧光显微镜分析细胞形态。mtrAB缺失导致细胞长度增加、形态不规则，与既往研究一致（Möker et al., 2004）（图1C及补充材料）。P ino -mtrAB菌株在未诱导时呈现野生型形态，但加入MI后表现出与△mtrAB突变株相似的严重形态改变（图1C及补充材料）。这些结果表明，肌醇沉默系统能实现mtrAB表达的严密调控，可在正常细胞状态与细胞壁缺陷状态之间切换。
已知谷氨酸棒状杆菌存在两种主要分泌途径：通用分泌（Sec）途径和双精氨酸转运（Tat）途径。为阐明MtrAB TCS在蛋白质分泌过程中的作用，研究者测定了由不同信号肽（Cg2402，Sec型；Cg1052，Tat型）介导、受强组成型启动子H36控制的αAL胞外活性。对于经Sec途径分泌的αAL，在无MI条件下，△mtrAB菌株24 h时胞外Sec-α-淀粉酶（SαAL）活性较WT提高110.3%，40 h时进一步提高至132.4%（图1D）。这一提升伴随着两个时间点OD600均降低10%。相比之下，P ino -mtrAB菌株与WT在这些条件下未观察到胞外SαAL活性或OD600的显著差异。值得注意的是，补充MI后，P ino -mtrAB菌株和△mtrAB菌株表现出相当的OD600和胞外SαAL活性，均与WT显著不同。具体而言，P ino -mtrAB菌株24 h时胞外SαAL活性较WT提高94.0%，但40 h时该增强降至61.1%（图1D）。相应地，其OD600在24 h和40 h分别降低22%和18%。
Tat途径依赖性分泌呈现平行趋势。无MI条件下，mtrAB缺失使胞外Tat-α-淀粉酶（TαAL）活性在24 h提高40.9%，40 h提高36.4%，而P ino -mtrAB菌株在无MI时无变化（图1E）。含MI条件下，P ino -mtrAB菌株的胞外TαAL活性与△mtrAB菌株相当，24 h和40 h分别提高53%和22.2%，同时OD600在相应时间点分别降低20%和7%（图1E）。SDS-PAGE分析进一步证实降低mtrAB表达确实有利于αAL生产。
值得注意的是，MI提高了整体OD600和OD540（αAL活性的比色指标），这可归因于谷氨酸棒状杆菌在LBB培养基中将MI作为辅助碳源分解代谢。
为研究干扰MtrAB TCS活性对αAL总产量的影响，研究者测定了胞内αAL活性。有趣的是，与WT相比，△mtrAB菌株的胞内SαAL和TαAL活性在24 h分别降低24.9%和22.1%，48 h进一步降低35.2%和69.3%。然而，补充MI使△mtrAB菌株的胞内αAL活性恢复至WT水平（图1D和1E）。这种恢复可能源于MI补充促进αAL合成增加，形成分泌瓶颈，导致αAL在△mtrAB菌株胞内积累。此外，mtrAB的缺失和敲低均提高了胞外αAL活性与总αAL活性的比值。这些结果表明，mtrAB干扰引起的胞外蛋白质产量增加并非源于蛋白质合成升高，而是源于蛋白质分泌改善。
【数据】mtrA/mtrB表达倍数：2.4/2.9倍（葡萄糖）；降低倍数：107.8/65倍（1% MI）；SαAL活性提升：110.3%（24h）、132.4%（40h，△mtrAB）；94.0%（24h）、61.1%（40h，P ino -mtrAB+MI）；TαAL活性提升：40.9%（24h）、36.4%（40h，△mtrAB）；53%（24h）、22.2%（40h，P ino -mtrAB+MI）；OD600变化：-10%（两时间点，△mtrAB）、-22%/-18%（P ino -mtrAB+MI）；胞内αAL活性变化：-24.9%/-22.1%（24h）、-35.2%/-69.3%（48h）；MI浓度：1%（w/v）；时间点：24h、40h、48h
3.2 mtrAB干扰稳健增强蛋白质分泌
蛋白质分泌是一个依赖背景的过程，受培养基、宿主生物和蛋白质特性等多种因素影响。为研究不同培养基对工程菌株蛋白质分泌的影响，以报告蛋白SαAL的胞外活性表征分泌能力。结果表明，△mtrAB菌株在BHI培养基和含2%蔗糖的CGXII培养基中SαAL活性分别提高2.0倍和2.7倍。同时，P ino -mtrAB菌株在相同培养基中补充MI后，SαAL活性分别提高1.6倍和2.2倍（图2A）。
结构分析显示，大多数谷氨酸棒状杆菌（非参考菌株ATCC13032）携带由cspB编码的PS2蛋白组成的表面层（S-layer）。该蛋白组装成高度稳定的二维晶体阵列覆盖细胞表面。为确定mtrAB干扰是否能在不同细胞包膜背景下改善蛋白质分泌，研究者将上述遗传修饰引入BZH001菌株。如图2B所示，BZH002菌株的SαAL活性提高1.9倍。引人注目的是，BZH003菌株仅提高1.2倍，这可能是由于P ino启动子的泄漏表达。值得注意的是，BZH002菌株在培养过程中出现明显细胞聚集，表明mtrAB缺失对细胞生理产生更显著的影响。
【数据】SαAL活性提升倍数：2.0倍（BHI）、2.7倍（CGXII+2%蔗糖，△mtrAB）；1.6倍（BHI）、2.2倍（CGXII+2%蔗糖，P ino -mtrAB+MI）；BZH002：1.9倍；BZH003：1.2倍；蔗糖浓度：2%（w/v）
3.3 肌醇沉默系统的重建与表征
（本节原文内容未在提供的节选中完整呈现，以下为可获得的翻译内容）
【数据】该节具体参数：原文节选未完整呈现
3.4 细胞壁工程提高蛋白质表面展示和谷氨酸产量
【数据】该节具体参数：原文节选未完整呈现
3.5 蛋白质组学分析阐明酶活性和谷氨酸产量提高的机制
【数据】该节具体参数：原文节选未完整呈现
3.6 细胞壁结构对蛋白质和谷氨酸跨包膜外泌的影响
【数据】该节具体参数：原文节选未完整呈现
讨论与解读
本研究探究了谷氨酸棒状杆菌中MtrAB双组分系统介导的细胞壁重塑对异源蛋白质分泌、表面展示和谷氨酸排泄的功能与机制。mtrAB干扰稳健地提升了多种重组蛋白的分泌。优化后的肌醇沉默系统被引入肌醇分解代谢缺陷菌株，实现了mtrAB表达的动态调控且不消耗诱导物。工程菌株在补料分批发酵中使LCC-A2活性提高2.58倍，并在摇瓶中改善了蛋白质表面展示和谷氨酸排泄。进一步研究发现，MtrAB双组分系统调控的细胞壁肽酶是通过细胞壁重塑增加细胞壁通透性、促进蛋白质和谷氨酸外泌的关键靶点。
编译者解读：本研究巧妙地将"生长缺陷"这一基因敲除的负面效应转化为可控的调控开关——肌醇沉默系统实现了细胞壁缺陷表型的可逆切换，这在工业发酵中极具实用性。从合成生物学角度看，该工作揭示了一个重要原则：细胞壁工程不应仅着眼于合成通路本身，细胞壁肽酶这类"降解因子"同样是提高产物外泌的潜在靶点。不足之处在于，部分结果依赖补充材料，正文对具体分子机制的阐述略显简略。未来若能解析MtrAB调控肽酶表达的精确信号网络，将有助于将该策略推广至其他革兰氏阳性宿主。
参考来源
Zou, Y. (2025). Engineering MtrAB two-component system enhances protein and glutamate export in corynebacterium glutamicum through cell wall remodeling. Bioresource Technology. DOI: 10.1016/j.biortech.2025.133024
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.133024