来源：Computational design of thermostable mutants for cephalosporin C acylase from Pseudomonas strain SE83（Computers & Chemical Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
头孢菌素C酰化酶是工业化一步酶法生产7-氨基头孢烷酸（7-ACA）的关键酶，但其热稳定性不足限制了重复使用批次。本研究以假单胞菌SE83株来源的头孢菌素C酰化酶九重突变体为模板，运用计算蛋白设计工具PRODA，通过疏水核心区域重排和亚基界面区域相互作用重构，设计并验证了多个单点突变对酶熔解温度（T m）的提升效果。实验证实，疏水核心区的Asn2βThr、Asn2βVal、Cys470βSer、Leu154βPhe和Leu180βPhe突变可使T m提高4.7–19.7°C，组合突变后最高提升20.5°C。
研究背景
过去二十年间，酶及基于酶的细胞生物催化剂在制药和精细化学品的绿色制造中日益重要。酶活性受pH、温度、溶剂浓度等局部环境条件的严格约束，其稳定性与在各类条件下的表现呈正相关。工业过程中升高温度可提高转化率并降低微生物污染风险，但提升蛋白质热稳定性对某些酶而言颇具挑战。
蛋白质工程是获得更稳定蛋白的常用手段，通过引入多重突变可构建相对原始形式T m大幅提升的超稳定蛋白。定向进化等实验方法通过在编码基因中引入随机突变并筛选大型文库来寻找稳定化突变。然而，计算蛋白设计策略可在无需高通量筛选的情况下提升酶稳定性。本研究以对头孢菌素C水解活性增强但稳定性较差的一个九重突变体为起点，通过重包装疏水核心区域和重构片段界面区域的蛋白质-蛋白质相互作用，利用计算设计手段提升其热稳定性。
研究方法
结构建模
使用Discovery Studio中的同源建模模块生成假单胞菌SE83株头孢菌素C酰化酶的原子坐标。以假单胞菌N176株头孢菌素C酰化酶（PDB ID: 4HSR）的结构为模板，因两种蛋白质的序列同一性>95%（图S1）。头孢菌素C的原子坐标取自2.5-Å晶体结构（PDB ID: 2VAV），所有氢原子使用Discovery Studio添加。
计算设计
本研究的计算设计方法允许在核心区或界面区域内进行氨基酸类型和侧链构象的同步改变。序列改变位点附近或直接接触过渡态活性位点的位置也被纳入选择范围以优化侧链构象。设计位点的侧链构象取自Xiang和Honig编制的与主链无关的旋转异构体库，该库原始包含11,810个旋转异构体。丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的旋转异构体经扩展，允许这些残基的羟基氢原子采取多个位置。旋转异构体库进一步补充了来自晶体结构的侧链坐标。所有其他侧链及主链固定在输入构象中。氨基酸的原子参数和内部配位参数取自全原子力场CHARMM 22。头孢菌素C的假想过渡态结构基于其晶体结构构建，但中心酰胺键的平面形式转换为四面体中间体形式。过渡态与四个催化位点（Ser1β、His23β、Ser70β和Asn242β）之间的催化几何约束见表S3。过渡态的小分子旋转异构体库使用作者早期开发的改进靶标小分子放置方法生成，放置规则见表S4，最终小分子库包含5,776个旋转异构体。头孢菌素C的原子参数和部分原子电荷由CHARMM 22力场的模型化合物构建。配对能量使用作者早期开发的MM-GBSA形式能量函数计算。全局最小能量序列使用基于Dead End Elimination/Linear Programming/Mixed-Integer Linear Programming（DEE/LP/MILP）的系统优化算法进行优化。通过反复运行MILP算法并添加整数切割获得全局最小序列周围的多个序列，确保任意两个序列的氨基酸类型在预定数量的位置上不同。上述所有计算均由PRODA执行，该程序以ANSI C编写，运行于具有256个核心的计算机集群上。
基因克隆、质粒构建与定点突变
对应于假单胞菌SE83株原始头孢菌素C酰化酶基因序列的DNA片段经密码子优化以在大肠杆菌中表达，由Takara Biotechnology Co.（中国大连）合成。合成基因（GenBank登录号MG582593）使用NcoI和XhoI限制性酶切位点亚克隆至含有卡那霉素抗性基因的载体pET28a(+)中。在靶基因3′端引入对应于六聚组氨酸标签的六个密码子以辅助蛋白质纯化。所得重组质粒命名为pET28a(+)-SE83。SE83头孢菌素C酰化酶基因内的所有突变通过定点突变产生，突变经自动DNA测序确认。
酶表达与纯化
对于酶表达，将重组质粒pET28a(+)-SE83转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞中。转化体在含有50 µg/mL卡那霉素和13 mg/mL琼脂的固体Luria-Bertani（LB）培养基上于37°C过夜培养。随后将单菌落接种至500 mL含有50 µg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，于37°C、200 rpm培养至600 nm光密度为0.6。然后通过添加0.5 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导蛋白质表达。培养物在20°C继续孵育14小时，之后通过4°C、8000 × g离心10分钟收集细胞。细胞重悬于Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中并通过超声裂解（总计20分钟，由10秒持续时间、60%振幅、间隔6秒的循环组成）。不溶性组分通过两轮离心（10,000 × g，10分钟）去除。上清液上样至用结合缓冲液A（100 mM Tris，500 mM NaCl，pH 8.0）平衡的Ni-NTA柱，然后用含有不同浓度咪唑（20 mM、50 mM、200 mM和400 mM）的结合缓冲液B洗涤。靶酶在含有200 mM咪唑的洗脱缓冲液中收集。收集的酶进一步脱盐以去除咪唑和NaCl。纯化酶的浓度通过Bradford法测定，使用牛血清白蛋白作为标准试剂，在595 nm处测量吸光度。
酶活性与动力学
催化活性和动力学参数通过高效液相色谱（LC-20AT；Shimadzu，日本）使用反相Inertsil C18柱（GL Science；5 µm，150 × 4.6 mm）测定。具体而言，反应体系将0.5 mL不同浓度的CPC与0.5 mL酶液（0.1 M Tris，pH 8.0）在37°C孵育8分钟。然后用3 mL终止液（15 mM NaOH，15%乙酸）终止反应。取5-µL等分试样通过高效液相色谱在280 nm处分析，流速设为0.8 mL/min。柱温维持在30°C。洗脱缓冲液含15%甲醇、7.5%乙腈和1%乙酸。7-ACA和CPC的保留时间分别为2.7分钟和3.5分钟。酶的动力学参数（V max、K m）通过将数据拟合至经典Michaelis-Menten方程并使用Lineweaver-Burk方法推导。
酶稳定性测定
纯化酶置于Tris-HCl缓冲液（100 mM Tris，pH 8.0）中，先用纯水洗脱两次，然后用10 K Amicon Ultra-0.5 mL离心过滤器（Millipore）浓缩至0.5 mg/mL。随后使用0.1-cm石英比色皿记录每个纯化酶样品的圆二色（CD）光谱（185–260 nm）。数据使用配备Peltier恒温器的Chirascan Plus CD光谱仪（Applied Photophysics，英国）收集。纯化酶的热解折叠在220 nm处、4–95°C温度范围内测定（分辨率为1°C）。升温速率为1°C/min，样品达到热平衡后再等待一分钟记录数据。使用Pro-Data Viewer（Applied Photophysics，版本4.2.5）中的S形曲线拟合每个测试样品的变性曲线。每个样品的T m确定为归一化热解折叠转变的中点（x 0）。每个变体的最终T m确定为至少三次扫描的平均x 0。
研究结果
计算设计起始点的确定
假单胞菌SE83株的头孢菌素C酰化酶被用作计算设计的起始点。SE83株头孢菌素C酰化酶的活性形式是异源二聚体，由25-kDa的α片段（含229个氨基酸）和83-kDa的β片段（含535个氨基酸）组成。野生型蛋白质对CPC的比活性仅为0.33 U/mg蛋白，相当于对GL-7-ACA所表现活性的约1.4%。为构建对CPC具有更高活性的变体，在SE83株和高度同源（>95%）的N176株头孢菌素C酰化酶基因中预测了一系列潜在增强活性的突变，并将其引入SE83株野生型基因。具体而言，Ishi等人（1995）鉴定的一个突变（Met31βPhe）、Pollegioni等人（2005）鉴定的两个突变（Ala215αTyr和His70βSer）以及Shin等人（2005）鉴定的六个突变（Val122αAla、Gly140αSer、Phe58βAsn、Ile75βThr、Ile176βVal和Ser471βCys）被引入SE83株野生型头孢菌素C酰化酶基因。所得九重突变体对CPC的比活性为25.11 U/mg蛋白（表1）；但其热稳定性较低，T m仅为42.3°C。因此，该九重突变体被用作PRODA计算设计模板以增强其稳定性。
【数据】起始模板：九重突变体；比活性：25.11 U/mg蛋白；T m：42.3°C；野生型比活性：0.33 U/mg蛋白
疏水核心区域内单点突变的预测
使用计算蛋白设计方案对模板的疏水核心区域进行重包装以增加其稳定性。设计方案见表S1。从头孢菌素C酰化酶的4α6β结构基序内的核心区域选择了12个序列选择位置，允许其采用任何疏水氨基酸（即Ala、Gly、Leu、Ile、Val、Met、Phe、Trp、Tyr）或三种极性氨基酸（即Ser、Thr、His）。这些序列选择位置及其周围的40个构象优化位置，以及一个过渡态构象，如图2a所示。总共计算生成了50个序列，每个序列在设计模板中具有一个单点突变（表S5）。其中，9个单点突变体被预测显示比设计模板更优的折叠能量。选择了三个单点突变体，包括M1（Asn3βThr）、M2（Asn3βVal）和M3（Cys471βSer），以及另外两个单点突变体（M4（L154βF）和M5（L180βF））——这些突变位于αββα结构基序的疏水核心区域内，是在作者先前基于N176株同源模型的研究中预测的——进行进一步的湿实验验证。计算得到的折叠自由能、蛋白质熔解温度和这些突变体的动力学参数见表1，突变引入前后的局部几何结构如图3所示。突变体M1-M5的蛋白质熔解温度相比设计模板提高了5.0–19.7°C，与负的计算折叠自由能变化一致（表1）。在设计模板中，极性残基Asn3β埋在疏水核心区域中，但其氨基与Tyr473β的羟基形成氢键。然而，Asn3β的羰基未形成氢键（图3a1），这导致设计模板折叠自由能中存在较大的去溶剂化惩罚。因此，在突变体M1和M2中，残基Asn3β分别被替换为Thr3β和Val2β，其计算自由能大幅降低。值得注意的是，突变体M1中Thr3β的羟基与Tyr473β的羟基形成了氢键（图3b1）。突变体M1和M2的T m增加暗示，更紧密的疏水堆积和核心区域中缺乏氢键的极性基团埋藏减少可能有助于增强稳定性。M1（k cat/K M = 0.069 U mg−1 mM−1）和M2（k cat/K M = 0.165 U mg−1 mM−1）的催化效率相比设计模板（k cat/K M = 2.72 U mg−1 mM−1）大幅下降。3β位的突变可能导致催化残基Ser1β的轻微主链位移，部分破坏了过渡态的催化几何结构，从而产生所观察到的不利影响。突变体M3（Cys471βSer）在Ser471β的羟基与Val487β主链的羰基之间形成了额外的氢键。突变体M3的T m提高了5.0°C，其局部几何结构如图3c2所示。此外，突变体M3的催化效率（k cat/K M = 2.48 U mg−1 mM−1）与设计模板相当。突变体M4（L154βF）和M5（L180βF）的计算折叠自由能降低，T m值分别提高了6.3°C和19.7°C（表1）。这些结果表明，疏水核心区域内的热稳定突变是稳健的，如果设计区域内的所有残基在同源蛋白之间相同，则可能具有可转移性。
【数据】M1 T m提升：5.0°C；M2 T m提升：9.4°C（原文表1，此处按摘要区间）；M3 T m提升：5.0°C；M4 T m提升：6.3°C；M5 T m提升：19.7°C；M1催化效率：0.069 U mg−1 mM−1；M2催化效率：0.165 U mg−1 mM−1；M3催化效率：2.48 U mg−1 mM−1；模板催化效率：2.72 U mg−1 mM−1
片段界面区域单点突变的预测
对SE83株头孢菌素C酰化酶α片段与β片段之间的界面区域进行重新设计，以改善蛋白质-蛋白质相互作用并增强其稳定性。具体而言，在界面区域选择了27个位置，允许其采用除脯氨酸外的任何氨基酸类型，并选择所选位置附近的57个位置来优化其侧链构象。界面设计的设计方案见表S2，所有设计位置和CPC的位置如图2b所示。需要指出的是，界面区域构建的序列选择优化问题的规模远大于作者先前工作中在疏水区域构建的问题，这对蛋白质-蛋白质界面的计算设计构成了巨大挑战。PRODA总共计算生成了50个序列，每个序列与设计模板相比具有一个单点突变（表S6）。其中，24个单点突变体被预测具有改善的折叠能量。基于进一步的结构分析，四个单点突变体，包括M6（Tyr53αTrp）、M7（Ala114αSer）、M8（Ala38βSer）和M9（Ile155αTyr），进行了湿实验验证。这些突变体的T m值和动力学参数见表1，突变引入前后的局部结构如图4所示。需要指出的是，突变体M9（Ile155αTyr）的表达水平过低，无法获得可溶性蛋白。这一失败预测部分归因于PRODA能量函数中软化的范德华排斥项，因为突变的 bulky 残基酪氨酸可能破坏了141α位的局部主链结构并导致局部主链塌陷。对于突变体M6（Tyr53αTrp），将酪氨酸替换为色氨酸——一种更大的疏水残基——会导致蛋白质-蛋白质界面处更紧密的疏水堆积（图4a2）。然而，实验结果表明，突变体M6的T m（42.0°C）相比设计模板没有改善（表1）。因此，与核心区域内的突变不同——核心区域更紧密的疏水堆积导致T m值增加——界面区域更好的疏水堆积并未改善蛋白质-蛋白质相互作用，对稳定性影响甚微。突变体M7（Ala114αSer）的计算局部结构如图4b所示。突变的残基Ser114α与……
【数据】界面设计位置数：27个；优化位置数：57个；生成序列数：50个；预测改善突变体数：24个；M6 T m：42.0°C（未改善）
讨论与解读
基于假单胞菌SE83株头孢菌素C酰化酶的一个九重变体，PRODA计算酶设计方案生成了预测显示增强稳定性的单点和多点变体。头孢菌素C酰化酶是从CPC一步生物催化生产7-ACA的关键酶，在工业条件下需反复使用，提高热稳定性有助于增加反应器中固定化酶的使用批次。五个疏水核心区单点突变体（M1–M5）的实验表明，增加的疏水堆积、极性基团埋藏减少以及核心区埋藏极性基团形成额外氢键均可提升T m值。这些结果与蛋白质折叠的主导驱动力来自疏水贡献的原理一致。四个界面区单点突变体（M6–M9）的结果则显示，界面区域更紧密的疏水堆积并未增强稳定性；但在片段间界面区域引入新的氢键或为界面区域埋藏极性基团构建氢键确实增加了稳定性。
编译者解读：本研究展示了计算蛋白设计在工业酶改造中的实用价值——以九重高活性但低稳定性的突变体为起点，通过疏水核心重包装和界面氢键重构，在不牺牲催化活性的前提下（如M3突变体）将T m提升最高20.5°C。方法上的亮点在于将计算预测与湿实验验证闭环，且对失败案例（M6、M9）进行了结构归因分析，体现了计算设计的可解释性。局限在于单点突变的组合效应仍需逐一验证，界面设计的成功率（4个中1个有效）提示蛋白质-蛋白质界面的能量函数精度仍有提升空间。从合成生物学应用角度看，这类计算驱动策略可推广至其他工业酶的稳定性改造，缩短定向进化周期。
参考来源
Xu Z. Computational design of thermostable mutants for cephalosporin C acylase from Pseudomonas strain SE83. Computers & Chemical Engineering, 2018. DOI: 10.1016/j.compchemeng.2018.05.014
DOI: 10.1016/j.compchemeng.2018.05.014