来源：Insights into thermostability enhancement of a PL-5 alginate lyase through rational design（Enzyme and Microbial Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
褐藻胶的高粘度特性严重制约了其工业化应用，而褐藻胶裂解酶可通过β-消除反应降解褐藻胶、降低粘度。然而，天然褐藻胶裂解酶热稳定性差，难以适应高温工业环境。本研究从文山罗尔斯通氏菌56D2中克隆并表征了一个PL-5家族褐藻胶裂解酶RwAly5A，该酶具有宽pH耐受性、低盐依赖性和宽底物谱。研究团队基于分子动力学模拟，针对柔性环区域引入脯氨酸取代，成功构建了D20P、D227P和A229P三个突变体，其在50°C下的半衰期分别提高至野生型的1.14倍、4.69倍和2.28倍，同时保留了大部分催化活性。
研究背景
褐藻胶是一种由β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古洛糖醛酸（G）组成的阴离子多糖，广泛存在于多种褐藻细胞壁中，占其干重的10%–40%。褐藻胶为细胞基质提供结构稳定性和机械支撑，也是众多海洋微生物的重要碳源。此外，其具有良好的生物相容性、成膜性和增稠性，在食品、医药、化妆品和生物材料等领域具有广阔应用前景。然而，天然褐藻胶分子量高、结构复杂，其水溶液粘度极高，严重限制了实际应用和高效利用。
褐藻胶裂解酶通过β-消除途径降解褐藻胶，生成不饱和寡糖，显著降低褐藻胶水溶液的粘度，使其从粘稠胶体状态转变为流动性良好的溶液，从而大幅提升褐藻胶的可加工性和利用效率。这些酶广泛分布于藻类、海洋无脊椎动物等多种生命形式中。然而，天然褐藻胶裂解酶普遍存在热稳定性差的缺陷，限制了其在高温环境中的应用。提升天然褐藻胶裂解酶的热稳定性，将更好地满足工业化生产的需求。
研究方法
2.1 质粒、培养基与菌株
编码褐藻胶裂解酶的基因 rwaly5a（GenBank登录号：WP_342455401.1）被确定为本研究的目标基因。为在大肠杆菌中实现高效异源表达，进行了密码子优化。优化后的基因由武汉天一华煜基因科技有限公司化学合成，并插入pET-24a(+)表达载体中，重组蛋白C端融合6×His标签以方便纯化。Luria–Bertani（LB）培养基含10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L NaCl（固体培养基另加13 g/L琼脂）。Terrific Broth（TB）培养基含12 g/L胰蛋白胨、24 g/L酵母提取物、9.4 g/L磷酸氢二钠、2.2 g/L磷酸二氢钾。RwAly5A质粒及其突变体由本实验室使用质粒提取试剂盒提取。分子克隆和蛋白表达分析分别使用大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)菌株。
【数据】基因登录号：WP_342455401.1；载体：pET-24a(+)；标签：6×His（C端）；LB培养基：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl；TB培养基：12 g/L胰蛋白胨、24 g/L酵母提取物、9.4 g/L Na₂HPO₄、2.2 g/L KH₂PO₄；菌株：E. coli DH5α、E. coli BL21(DE3)
2.2 试剂与材料
卡那霉素和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）购自北京索莱宝科技有限公司。胰蛋白胨和酵母提取物购自Oxoid有限公司（Thermo Fisher Scientific）。NaCl购自国药集团化学试剂有限公司。高保真DNA聚合酶、限制性内切酶DpnI和质粒提取试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。褐藻酸钠购自青岛聚大洋藻业集团有限公司。高纯度聚甘露糖醛酸（polyM）和聚古洛糖醛酸（polyG）（纯度约97%）购自青岛Bz Oligo生物科技有限公司。用于蛋白定量的BCA蛋白 assay 试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司。HisTrap™ HP镍离子亲和层析柱购自常州天地人和生物科技有限公司。
【数据】IPTG来源：Solarbio；polyM/polyG纯度：约97%；褐藻酸钠来源：青岛聚大洋藻业集团
2.3 RwAly5A序列分析
rwaly5a序列从NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）下载。RwAly5A的氨基酸序列可在GenBank数据库中以登录号WP_342455401.1获取。使用WebLogo（http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）评估氨基酸序列的保守性。使用ExPASY网站（https://web.expasy.org/protparam/）预测蛋白质的理论等电点（pI）和分子量。使用MEGA 11软件包（http://www.megasoftware.net/download_form）以邻接法构建系统发育树。使用AlphaFold 3（https://alphafoldserver.com/）对RwAly5A进行结构预测，并通过分子动力学（MD）模拟评估模型质量。
【数据】序列分析工具：WebLogo、ExPASY、MEGA 11、AlphaFold 3；建树方法：邻接法
2.4 分子动力学模拟
MD模拟使用AlphaFold 3生成的蛋白质模型进行。采用OPLS-2005蛋白质力场作为基本参数。模拟过程中，蛋白质结构位于含有SPC水分子的立方体中心。模拟在等温（NPT）系综中进行，系统温度控制在300 K，共包含32,368个原子。盒边界经过策略性配置，确保蛋白质最远点距盒边界的最小距离为10 Å，以建立足够的溶剂层。系统使用0.15 M NaCl中和。能量最小化后，在300 K和1 atm条件下使用Berendsen恒温器和恒压器进行100 ns生产MD模拟。原子坐标每1 ns记录一次，用于后续评估。
【数据】力场：OPLS-2005；水模型：SPC；系综：NPT；温度：300 K；原子数：32,368；溶剂层最小距离：10 Å；盐浓度：0.15 M NaCl；模拟时间：100 ns；记录间隔：1 ns
2.5 突变体重组质粒的构建
采用定点突变技术构建工程化突变体，以已构建的pET-24a-RwAly5A质粒为扩增模板，配合特异性设计的突变引物（表S1）。PCR体系为10 μL，包含1 μL模板（pET-24a-RwAly5A）、各0.4 μL引物（10 μM）、5.4 μL PrimeSTAR MIX，加ddH₂O补足至10 μL。热循环条件为：95°C预变性3 min，随后30个循环的95°C变性15 s、60°C退火15 s、72°C延伸5 min，最后72°C终延伸5 min。随后，将扩增产物与0.5 μL DpnI内切酶共同孵育，选择性降解亲本DNA模板。产物转化至大肠杆菌DH5α中，并在含30 μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上筛选。通过DNA测序确认突变成功。
【数据】PCR体系：10 μL（1 μL模板、0.4 μL各引物(10 μM)、5.4 μL PrimeSTAR MIX）；PCR条件：95°C 3 min；30×(95°C 15s, 60°C 15s, 72°C 5min)；72°C 5min；DpnI用量：0.5 μL；卡那霉素浓度：30 μg/mL
2.6 重组RwAly5A及突变体的表达与纯化
使用pET-24a(+)表达载体组装工程化突变体质粒，包括pET-24a-D20P、pET-24a-A224P、pET-24a-V225P、pET-24a-V226P、pET-24a-D227P、pET-24a-A229P、pET-24a-K233P、pET-24a-L241P、pET-24a-F242P和pET-24a-W244P。这些构建体被转入大肠杆菌BL21(DE3)细胞中进行蛋白表达分析。转化菌涂布于含卡那霉素（30 μg/mL）的LB琼脂培养基上，37°C培养过夜。转化子在LB培养基中作为种子培养物生长6–8 h，然后以1%（v/v）接种量接种至100 mL TB培养基中。当OD₆₀₀达到0.6时，加入IPTG至终浓度0.02 mM，随后在18°C下继续培养。使用高速冷冻离心机（12,000 rpm，10 min）收集细胞。细胞经超声破碎后离心（12,000 rpm，4°C）。所得上清液上样至预先用上样缓冲液（20 mM磷酸盐缓冲液；PB，500 mM NaCl，pH 7.3）平衡的Ni-NTA Sepharose柱。使用50 mM咪唑去除非特异性结合蛋白，随后使用250 mM咪唑回收重组变体。基质用100%咪唑洗脱缓冲液充分冲洗。纯化后的酶在冰上透析6 h以去除咪唑，并使用12.5%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分析。
【数据】突变体：D20P、A224P、V225P、V226P、D227P、A229P、K233P、L241P、F242P、W244P；卡那霉素：30 μg/mL；IPTG：0.02 mM；诱导温度：18°C；离心：12,000 rpm、10 min；上样缓冲液：20 mM PB、500 mM NaCl、pH 7.3；咪唑洗脱：50 mM（去杂）、250 mM（洗脱）；透析：冰上6 h；SDS-PAGE：12.5%
2.7 酶活测定
标准测定体系包含0.9 mL 0.3%（w/v）底物（褐藻酸钠、polyM或polyG），配制于20 mM PB（pH 8.0，100 mM NaCl）中，以及0.1 mL分离蛋白。反应通过将反应管置于100°C水浴10 min终止。使用热变性酶制剂的平行反应作为阴性对照。褐藻胶裂解酶活性通过直接监测235 nm处吸光度的增加来测定，该增加源于褐藻胶裂解酶β-消除裂解机制产生的不饱和糖醛酸的积累。在指定测定条件下，一个酶活单位（U）定义为每分钟使235 nm处吸光度增加0.1所需的蛋白量。所有酶在活性测定前均调整至0.2 mg/mL（由Bradford法测定）。所有实验均进行三次生物学重复（n = 3）。数据以平均值±标准差（SD）表示。两组间比较采用t检验评估野生型与各突变体比活性差异的显著性。显著性水平标记为：P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001。
【数据】底物浓度：0.3%（w/v）；缓冲液：20 mM PB（pH 8.0，100 mM NaCl）；反应终止：100°C、10 min；检测波长：235 nm；酶活单位定义：ΔA₂₃₅/min=0.1为1 U；蛋白浓度：0.2 mg/mL；重复：n=3；统计方法：t检验
2.8 RwAly5A及突变体的酶学性质
#### 2.8.1 RwAly5A的最适反应pH和pH稳定性
使用50 mM缓冲液体系在宽pH范围内测定最适pH：柠檬酸-Na₂HPO₄（pH 3.0–8.0）、Na₂HPO₄-NaH₂PO₄（PB，pH 6.0–8.0）、Tris-HCl（pH 7.0–9.0）和甘氨酸-NaOH（pH 8.6–10.6）。将最大活性标准化为100%。对于pH耐受性评估，将0.3 mL不同pH缓冲液与0.3 mL纯酶混合，混合物置于4°C放置6 h。处理后的酶溶液与底物反应后测定酶活性。
【数据】缓冲液体系：柠檬酸-Na₂HPO₄（pH 3.0–8.0）、Na₂HPO₄-NaH₂PO₄（pH 6.0–8.0）、Tris-HCl（pH 7.0–9.0）、甘氨酸-NaOH（pH 8.6–10.6）；缓冲液浓度：50 mM；处理条件：4°C、6 h
#### 2.8.2 RwAly5A的最适温度
最适温度的测定方法原文未详述完整步骤，但根据后续结果部分可知，RwAly5A在0–70°C范围内与褐藻酸钠反应测定相对酶活性，并在0–70°C孵育1 h后测定剩余相对活性。
【数据】温度范围：0–70°C；孵育时间：1 h
研究结果
3.1 RwAly5A的生物信息学分析
rwaly5a具有963 bp的开放阅读框，编码320个氨基酸的蛋白质。通过SignalP 5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）鉴定并去除信号肽后，成熟酶RwAly5A的预测分子量为32.98 kDa，pI为7.95。系统发育分析表明RwAly5A属于PL-5家族（图1A）。与已表征的PL-5家族褐藻胶裂解酶相比，其与嗜麦芽窄食单胞菌K279a的Smlt1473氨基酸序列相似性最高，为36.67%。使用AlphaFold 3建模的三级结构为PL-5家族典型的（α/α)ₙ环状折叠结构（图1B）。AlphaFold 3服务器对RwAly5A的结构预测表明模型稳定可靠。与来自鞘氨醇单胞菌A1的已知晶体结构PL-5家族褐藻胶裂解酶A1-III（PDB：1HV6）进行了结构比较。结合保守性分析，在RwAly5A中鉴定出三个高度保守的催化残基（Tyr184、Arg177和Asn129）（图1C和1D）。
【数据】ORF长度：963 bp；氨基酸数：320；分子量：32.98 kDa；pI：7.95；与Smlt1473相似性：36.67%；催化残基：Tyr184、Arg177、Asn129
3.2 RwAly5A的重组表达与纯化
SDS-PAGE分析证实重组RwAly5A具有高纯度，在34 kDa附近显示出一条清晰条带（图2），与（His)₆标签融合蛋白的理论分子量（33.80 kDa）一致。重组RwAly5A的比活性测定为18.06 ± 0.21 U/mg。
【数据】SDS-PAGE条带位置：约34 kDa；理论分子量：33.80 kDa；比活性：18.06 ± 0.21 U/mg
3.3 RwAly5A的酶学性质
#### 3.3.1 最适反应pH和pH稳定性
RwAly5A在Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液中的最适pH为8.0，在此微碱性条件下表现出高活性。在Tris-HCl缓冲液体系（pH 8.0–8.95）、甘氨酸-NaOH缓冲液（pH 8.6–10.6）和Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液（pH 7.6–8.0）中，其相对酶活性维持在70%以上。然而，在pH 3.0–7.0的酸性环境中，相对酶活性显著下降（图3A）。这些结果表明重组RwAly5A能在中性至微碱性条件下高效降解褐藻酸钠。
RwAly5A在4°C条件下暴露6 h后，在所有测试缓冲液体系中于pH 4.6–10.6范围内均保持70%以上的相对活性（图3B），表明RwAly5A在宽pH范围内保持良好的稳定性，但其稳定性特征受缓冲液组成显著影响。Tris-HCl、甘氨酸-NaOH和Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液在高pH下的优异表现突显了pH偏好以及缓冲液特异性效应，这些体系可能比Na₂HPO₄-柠檬酸提供更兼容的离子环境。在Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液中稳定性明显较低。在更酸性的条件下（pH 3–4），相对活性急剧下降。总之，RwAly5A在中性至弱碱性环境中表现出良好的pH稳定性，特别是在Na₂HPO₄-NaH₂PO₄、Tris-HCl和甘氨酸-NaOH缓冲液中。相比之下，来自门多萨假单胞菌的PL-5家族褐藻胶裂解酶（PMD）在48 h后仍保留80%以上的活性，但仅在较窄的pH 5.0–9.0范围内。尽管PMD在温和条件下具有优异的长期稳定性，但RwAly5A更宽的pH耐受性赋予其独特优势，使其更能适应波动或非优化的工业环境。
【数据】最适pH：8.0（Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液）；高活性pH范围：Tris-HCl pH 8.0–8.95、甘氨酸-NaOH pH 8.6–10.6、Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH 7.6–8.0（>70%活性）；pH稳定性范围：4.6–10.6（4°C、6 h、>70%活性）；PMD对照：pH 5.0–9.0、48 h、>80%活性
#### 3.3.2 最适反应温度和热稳定性
RwAly5A与褐藻酸钠反应的最适操作温度测定为50°C，高于大多数已报道的PL-5家族褐藻胶裂解酶（其最适温度通常为20–45°C）。相对酶活性从0°C到50°C逐渐增加，在50°C时达到最大值，值得注意的是，酶在60°C和70°C时仍保持80%以上的催化能力（图4A）。
关于热稳定性，RwAly5A在室温下表现出强的活性保持能力。RwAly5A在0–40°C暴露1 h后保持80%以上的相对活性，从40°C开始出现明显下降，在50°C孵育时活性急剧下降，在70°C孵育1 h后完全丧失活性（图4A），表明其热稳定性窗口相对狭窄。这一模式反映了PL-5家族褐藻胶裂解酶中的常见限制，即尽管在温和条件下表现出中等催化效率，但普遍缺乏工业应用所需的稳健热稳定性。值得注意的是，这种在最适温度下活性最大但同时在该温度下快速失活的现象在许多酶中经常观察到，推测是因为酶在短时间内保持足够的活性以实现最大产物释放，但随后迅速发生热变性。
时间依赖性热失活实验显示，RwAly5A在50°C下10 min后酶活性急剧下降，在60°C下50 min后完全丧失酶活性（图4B）。综合来看，这些结果表明RwAly5A在生理和环境条件下具有较高的热稳定性，但在高温下会迅速发生温度依赖性失活。
【数据】最适温度：50°C；60°C和70°C相对活性：>80%；热稳定性：0–40°C、1 h、>80%活性；50°C失活：10 min内急剧下降；60°C完全失活：50 min；PL-5家族最适温度范围：20–45°C
#### 3.3.3 不同NaCl浓度的影响
0.1 M NaCl的低浓度刺激RwAly5A达到其最大观测酶活性。RwAly5A在无NaCl条件下保持约70%的相对活性，而当NaCl浓度高于0.1 M时活性逐渐下降，在高盐浓度下几乎完全丧失（图5）。这种盐依赖性模式在褐藻胶裂解酶中广泛观察到，反映了该酶家族许多成员的共同特征。值得注意的是，RwAly5A对NaCl的依赖性较弱，这使其在低盐条件下具有更好的适用性。低浓度NaCl可能稳定了酶的活性构象或底物相互作用。然而，过高的离子强度破坏了催化反应和酶稳定性所需的关键静电相互作用。
【数据】最适NaCl浓度：0.1 M；无NaCl时相对活性：约70%；高盐浓度：活性几乎完全丧失
#### 3.3.4 金属离子和螯合剂的影响
不同金属离子和螯合剂对RwAly5A的催化性能表现出显著的调控作用。部分一价金属和碱土金属离子（Li⁺、K⁺、NH₄⁺、Mg²⁺和Ca²⁺）适度增强了酶活性，这与Ca²⁺和Mg²⁺是许多褐藻胶裂解酶常见激活剂的报道一致。相比之下，Mn²⁺、Ba²⁺和Fe³⁺发挥抑制作用，使活性降低10–20%。此外，EDTA螯合导致活性出现可比的轻微下降（约12%），表明系统中存在的内源金属离子部分贡献了观察到的激活效应，但对催化机制并非绝对必需。最显著的抑制来自表面活性剂SDS，其几乎完全消除了酶活性，表明对催化至关重要的结构完整性或特异性相互作用被严重破坏（表1）。综合来看，RwAly5A是一种金属刺激但非金属依赖的酶，其催化功能主要依赖结构完整性而非金属辅因子，这由EDTA抗性和SDS敏感性所证实。
【数据】激活离子：Li⁺、K⁺、NH₄⁺、Mg²⁺、Ca²⁺；抑制离子：Mn²⁺、Ba²⁺、Fe³⁺（活性降低10–20%）；EDTA抑制：约12%；SDS：几乎完全抑制
#### 3.3.5 RwAly5A的底物特异性
RwAly5A对测试的三种底物均表现出高降解能力，其中对褐藻酸钠的降解效率最高。其对polyM和polyG的降解效率达到对褐藻酸钠的80%以上（图6）。PL-5家族褐藻胶裂解酶通常以对polyM的严格底物特异性为特征。相比之下，RwAly5A表现出更广泛的底物谱。
【数据】polyM相对活性：>80%（以褐藻酸钠为100%）；polyG相对活性：>80%（以褐藻酸钠为100%）
3.4 突变体的构建、表达与热稳定性表征
基于MD模拟的RMSF分析，RwAly5A的柔性环区域被鉴定为潜在的热不稳定位点（图7A）。以褐藻酸钠为底物进行突变体的功能与结构表征（图7B）。通过脯氨酸取代策略，在柔性环区域引入突变，构建了D20P、D227P和A229P突变体。这些突变体在50°C下的半衰期分别延长至野生型的1.14倍、4.69倍和2.28倍，同时保留了大部分催化活性。
【数据】半衰期提升倍数：D20P为1.14倍、D227P为4.69倍、A229P为2.28倍（50°C条件下）
讨论与解读
本研究成功表征了一种来自文山罗尔斯通氏菌56D2的PL-5家族褐藻胶裂解酶RwAly5A，该酶具有宽pH耐受性（4.6–10.6）、低盐依赖性和宽底物谱等优良特性。针对其热稳定性差的缺陷，研究团队基于MD模拟鉴定柔性环区域，通过脯氨酸取代策略构建了D20P、D227P和A229P三个突变体，其50°C半衰期分别达到4.28、17.63和8.59 min，为野生型的1.14倍、4.69倍和2.28倍，同时保留了大部分催化活性。
脯氨酸取代提升热稳定性的机制在于脯氨酸的吡咯烷环结构限制了肽键的二面角构象，降低了柔性环区域的构象熵，从而减少了蛋白质在高温下的去折叠倾向。该方法在多种酶的热稳定性改造中已被验证有效。未来工作可考虑将这些有益的单点突变进行组合，构建双突变或三突变体，可能产生协同增强效应。此外，引入二硫键、盐桥和氢键等稳定性导向策略，有望同时提升热稳定性和催化效率。
编译者解读
本研究展示了计算驱动酶工程的一个典型范例——将MD模拟与理性设计相结合，精准定位柔性环区域进行靶向突变。该方法相较于随机突变或定向进化，显著减少了筛选工作量，且突变位点具有明确的机制解释。D227P突变使半衰期提升近4.7倍，效果显著，但突变后催化活性的保留程度需进一步量化。值得注意的是，RwAly5A本身具有宽pH耐受性和宽底物谱的优良特性，这为其在褐藻胶生物转化、寡糖制备等工业场景中的应用奠定了基础。后续若能将有益突变叠加并结合其他稳定化策略，有望获得综合性能更优的工业级酶制剂。
参考来源
Lin S. Insights into thermostability enhancement of a PL-5 alginate lyase through rational design. Enzyme and Microbial Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.enzmictec.2026.110953
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2026.110953