来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
**导语**
灵芝多糖作为传统药用真菌的核心活性成分，其抗氧化功能备受关注，但微生物发酵对多糖精细结构及细胞保护活性的重塑效应仍缺乏系统证据。本研究首次结合液态深层发酵与氧化应激肝细胞模型，解析了一种新型发酵灵芝多糖的均一组分，并揭示了其通过激活内源性抗氧化酶系、阻断线粒体凋亡通路来抵御H₂O₂诱导的HepG2细胞损伤的分子机制。该发现为发酵灵芝多糖在功能性食品和肝脏保护制剂中的高值化利用提供了关键理论支撑。
**研究背景**
灵芝（*Ganoderma lucidum*）在中国及东亚地区有数千年的药用历史，其多糖类成分被公认为主要的生物活性物质，具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化和保肝等多重功效。传统灵芝多糖多从子实体或孢子粉中提取，然而人工栽培周期长、活性批次差异大，限制了产业化应用。液态深层发酵技术可在短期内获得大量菌丝体及胞外多糖，并可通过调控培养基组成定向富集活性多糖，是突破资源瓶颈的有效途径。然而，发酵过程会改变多糖的分子量分布、单糖组成、糖苷键类型及链构象，这些精细结构变化与抗氧化活性的构效关系尚未厘清。
氧化应激是肝细胞损伤的核心诱因，过量活性氧（ROS）会攻击生物膜、蛋白质和DNA，导致细胞凋亡或坏死。HepG2人肝癌细胞株保留了正常肝细胞的多种代谢功能，被广泛用作构建氧化应激模型的工具细胞。已有研究证实灵芝多糖可清除自由基，但多数研究仅检测体外化学抗氧化指标，缺乏从细胞氧化还原稳态和信号通路层面的深入剖析。因此，系统表征发酵灵芝多糖的结构特征，并在H₂O₂诱导的HepG2细胞模型中评估其抗氧化保护活性，对于开发基于发酵工程的灵芝功能配料具有重要的科学意义与应用价值。
**研究方法**
**1. 发酵多糖制备与纯化**
采用灵芝菌株在优化培养基中进行液态深层发酵，收集发酵液经醇沉、Sevag法脱蛋白、透析后获得粗多糖。进一步利用DEAE-52阴离子交换柱和Sephadex G-100凝胶渗透柱分级纯化，得到均一多糖组分GLP-F（命名为发酵灵芝多糖）。
**2. 结构表征技术体系**
采用高效凝胶渗透色谱（HPGPC）测定分子量；通过PMP柱前衍生-高效液相色谱法分析单糖组成；利用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）鉴定特征官能团；通过高碘酸氧化、Smith降解结合甲基化-GC/MS联用技术解析糖苷键连接方式；借助核磁共振波谱（¹H NMR、¹³C NMR、HSQC、HMBC）完成重复单元的精细结构鉴定；采用刚果红实验和原子力显微镜（AFM）观察三股螺旋构象及链形态。
**3. 细胞抗氧化实验设计**
以HepG2细胞为模型，实验分五组：空白对照组、H₂O₂损伤组（200 μM H₂O₂处理4 h）、以及低、中、高剂量GLP-F预处理组（分别添加50、100、200 μg/mL GLP-F作用24 h，再加入H₂O₂共孵育）。通过MTT法检测细胞存活率；采用DCFH-DA荧光探针结合流式细胞术测定胞内ROS水平；试剂盒检测超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活力和谷胱甘肽（GSH）含量及丙二醛（MDA）水平；利用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术分析凋亡率；Western blot检测Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bax、Caspase-3等关键蛋白表达。所有实验均独立重复三次，数据用以评估GLP-F的抗氧化保护活性及相关信号通路。
**研究结果**
**1. 多糖纯化与结构特征**
经两步柱层析获得均一多糖组分GLP-F，HPGPC显示单一对称峰，重均分子量（Mw）约为2.8 × 10⁴ Da。单糖组成分析表明，GLP-F主要由葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）和甘露糖（Man）组成，摩尔比约为5.2∶1.8∶1.0，同时含少量岩藻糖和鼠李糖。FT-IR谱图呈现出典型的多糖特征吸收峰：3400 cm⁻¹附近宽峰为O–H伸缩振动，2925 cm⁻¹为C–H伸缩振动，890 cm⁻¹附近吸收提示存在β-糖苷键。甲基化分析结合GC-MS鉴定出主要糖苷键型为→4)-Glcp-(1→、→6)-Galp-(1→和→2,6)-Manp-(1→，主链由→4)-Glcp-(1→重复单元构成，→6)-Galp-(1→构成侧链，通过→2,6)-Manp-(1→连接分支，分支点位于甘露糖的O-2和O-6位。NMR谱图进一步确认了糖残基的异头构型（端基质子信号δ 4.5～5.2 ppm），GLP-F的主链结构可推定为以(1→4)-β-D-Glcp为主链，在部分葡萄糖残基的O-6位连接有(1→6)-α-D-Galp侧链，并通过(1→2,6)-α-D-Manp形成支化点，这是一种不同于子实体多糖的新型结构。刚果红实验提示GLP-F在水溶液中具有三股螺旋构象；AFM图像显示多糖分子呈分散的球状与短棒状形态，链高约1.2～1.8 nm，暗示分子内/分子间氢键维持了紧密的链构象。
**2. 细胞保护活性与机制**
MTT结果表明，GLP-F在50–200 μg/mL范围内对HepG2细胞无细胞毒性，且能显著逆转H₂O₂导致的细胞活力下降。200 μM H₂O₂使细胞存活率降至51.3%，而200 μg/mL GLP-F预处理组存活率回升至86.7%。ROS检测显示，GLP-F呈剂量依赖性地清除胞内ROS，高剂量组荧光强度较损伤组降低约62%。与损伤组相比，GLP-F预处理使SOD和CAT活力分别升高1.8倍和2.1倍，GSH含量增加约1.5倍，同时脂质过氧化产物MDA含量下降54%，表明抗氧化防御体系被有效激活。流式凋亡分析显示，H₂O₂诱导后细胞凋亡率达32.5%，GLP-F高剂量预处理将其显著抑制至13.2%。Western blot结果揭示分子机制：GLP-F促进转录因子Nrf2核转位，上调其下游靶蛋白HO-1的表达；同时上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，下调促凋亡蛋白Bax和活化的Caspase-3水平，Bcl-2/Bax比值显著升高，表明GLP-F同时启动了Nrf2/HO-1抗氧化通路并阻断了线粒体凋亡通路。
**讨论与展望**
该研究证实液态深层发酵可产生结构新颖的灵芝多糖GLP-F，其主链以(1→4)-β-D-Glcp为骨架，通过(1→6)-Gal和(1→2,6)-Man分支，形成了不同于传统子实体多糖的支化模式。这种中等分子量、具有一定分支度和三股螺旋构象的结构特征，被认为有助于其与细胞表面受体的识别和内化，从而高效激活胞内抗氧化信号。尤为关键的是，GLP-F能够同时调控Nrf2/HO-1氧化应激防御系统和Bcl-2家族调控的线粒体凋亡途径，从多靶点协同发挥肝细胞保护作用，这为“结构-细胞活性”关联提供了更深层次的理解。
本研究仍存在一些有待拓展的方向：首先，GLP-F的具体吸收途径及其在体内的代谢归宿尚不明确，未来需借助荧光标记和动物模型追踪其药代动力学行为；其次，发酵工艺参数（如碳氮比、溶氧、发酵时间）对多糖结构及活性的调控规律值得系统探究，以实现定向制备；第三，可通过分子对接或表面等离子体共振技术进一步明确GLP-F与Nrf2或相关受体的直接互作模式。总体而言，该研究为发酵灵芝多糖作为功能性护肝成分的开发奠定了坚实基础，也为食药用真菌活性多糖的构效关系研究提供了新的视角。
**参考来源**
Yang Zhao, Qinyang Li, Minghui Wang, Yuhua Wang, Chunhong Piao. Structural characterization of polysaccharides after fermentation from *Ganoderma lucidum* and its antioxidant activity in HepG2 cells induced by H₂O₂. *Food Chemistry: X*, DOI: 10.1016/j.fochx.2023.100682.
DOI: 10.1016/j.fochx.2023.100682