来源：Semantic Scholar | 编译：DNA Lab Space
**导语**
灵芝（*Ganoderma lingzhi*）作为传统药用真菌，其活性成分在功能食品和医药领域备受关注，但人工栽培周期长、受环境影响大。深层发酵技术可实现菌丝体及其代谢产物的快速、可控生产，是灵芝资源高效利用的重要途径。Oliveira-Junior 等发表于 *Brazilian Journal of Biology* 的研究，通过比较六种不同营养基质对灵芝深层发酵的影响，揭示培养基组成对纤维素酶、漆酶等水解酶及酚类、黄酮类抗氧化活性物质的显著调控作用。该研究为灵芝深层发酵过程的定向优化和增值化利用提供了新依据。
1. 研究背景
灵芝属真菌富含多糖、三萜、糖蛋白、酚类及黄酮类等生物活性物质，具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤等多种药理活性。传统的子实体栽培和孢子粉采集周期长达数月，且易受虫害、气候和重金属污染等因素的制约。相比之下，深层发酵（submerged fermentation）能够在数天至十余天内完成菌丝体快速增殖，并在发酵液中同步积累次级代谢产物，显著缩短生产周期，提高批次一致性，成为天然产物生物制造的理想平台。
深层发酵过程不仅能够生产灵芝菌丝体，还能通过调节培养基组成定向诱导真菌分泌多种胞外酶，如纤维素酶（CMC酶、滤纸酶）、木聚糖酶、漆酶、锰过氧化物酶等。这些酶类在木质纤维素降解、生物转化、食品加工及环境治理中具有重要应用价值。同时，灵芝在液体培养条件下会向胞外释放具备抗氧化活性的多酚、黄酮及多糖等物质，这为其作为一种“多功能发酵液”的整体应用提供了可能。然而，以往研究多聚焦于单一目标（如菌丝体产量或单一活性物质），缺乏对胞外酶系与抗氧化活性成分联产的综合比较。培养基成本及其组成对酶活性和抗氧化活性的影响规律尚不清晰，制约了发酵工艺的规模化与产品多元化发展。
2. 研究方法
Oliveira-Junior 等以 *Ganoderma lingzhi* 标准菌株为对象，系统考察了六种不同碳氮源组合的液体培养基对发酵产物谱的影响。研究采用的培养基包括：GP 培养基（葡萄糖-蛋白胨）、MC 培养基（麦芽提取物-酪蛋白胨）、SY 培养基（蔗糖-酵母提取物）、SMY 培养基（可溶性淀粉-麦芽提取物-酵母提取物），以及两种以农副产品为基础的低成本培养基——WM 培养基（小麦麸皮浸提液）和 RH 培养基（米糠浸提液）。所有培养基灭菌后在 28 °C、150 r/min 的摇瓶条件下接种 10%（v/v）的种子液，深层发酵 10 天。
实验的技术路线从宏观到微观分三层展开，形成了对发酵过程“组成-活性-功能”的系统性评价。首先，发酵结束后，通过离心分离菌丝体和发酵上清液。菌丝体干燥后称重，获得生物量（g/L）；发酵上清液用于测定胞外粗酶液活力和抗氧化活性。
在酶活力检测方面，研究团队采用分光光度法测定了五种关键胞外酶活性：（1）纤维素酶体系，包括内切葡聚糖酶（CMC酶）和总纤维素酶活力（滤纸酶，FPase），分别以羧甲基纤维素钠和 Whatman No.1 滤纸为底物，通过二硝基水杨酸（DNS）法测定释放的还原糖；（2）木聚糖酶，以山毛榉木聚糖为底物；（3）漆酶，以 ABTS（2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）为底物，在 420 nm 处监测氧化产物；（4）锰过氧化物酶（MnP），以酚红为底物。所有酶活力单位统一为国际单位（U），以每毫升发酵液每分钟释放 1 μmol 产物所需的酶量计算。
抗氧化活性评价方面，研究人员从总活性物质含量和自由基清除能力两个维度进行表征。总酚含量（TPC）采用福林-酚试剂法，以没食子酸为标准品；总黄酮含量（TFC）通过氯化铝比色法，以槲皮素为对照。抗氧化能力包括 DPPH 自由基清除率、ABTS·⁺ 清除率、铁离子还原/抗氧化能力（FRAP）和还原力测定。此外，还通过铁离子螯合试验考察了其对过渡金属离子的螯合能力。以上所有分析至少进行三次重复，结果以“均值 ± 标准差”表示，采用方差分析（ANOVA）及 Tukey 多重比较检验（p < 0.05）分析各组间的显著性差异。
3. 研究结果
该研究获得了一系列具有重要实践价值的核心数据，集中体现在生物量、酶活性和抗氧化活性三个维度对培养基类型的差异化响应。
**生物量**方面，六种培养基中，葡萄糖-蛋白胨（GP）和蔗糖-酵母提取物（SY）培养基显示出最优的菌丝体生长，发酵 10 天生物量分别达到 8.2 g/L 和 7.8 g/L。相比之下，以小麦麸皮浸提液为主的 WM 培养基虽然成本最低，但生物量仅为 3.5 g/L。这一结果体现简单糖类和有机氮源对灵芝菌丝体快速增殖的促进效应，而农业副产物中复杂的木质纤维素结构利用率较低，导致生长受限。
**胞外酶生产**是本研究的突出亮点。不同培养基对灵芝胞外酶的表达谱呈现出显著的“底物诱导”趋势。在纤维素酶活力上，以小麦麸浸提液（WM）和米糠浸提液（RH）为培养基时，CMC 酶活力分别高达 12.4 U/mL 和 10.7 U/mL，约为 GP 培养基的 3.5 倍和 3.0 倍。滤纸酶活力也在 WM 培养基中达到峰值（4.1 U/mL）。木聚糖酶活性在 RH 培养基中最为突出（28.6 U/mL），充分体现了米糠中半纤维素成分的强诱导作用。漆酶是灵芝降解木质素的关键酶。研究发现，漆酶活性在 SMY 和 WM 培养基中较高，分别达到 158.2 U/L 和 131.7 U/L，而 GP 培养中的漆酶活性极低（< 20 U/L）。锰过氧化物酶活力整体水平较低，但仍以农业副产物培养基显著优于合成培养基。总体而言，富含天然纤维和木质纤维素成分的 WM 和 RH 培养基，虽然不利于菌丝体快速生长，但却是诱导灵芝分泌木纤维素降解酶系的理想底物，能够实现酶系的全方位高产。
**抗氧化活性物质积累**方面，总酚和总黄酮含量及相应的自由基清除能力在不同培养基间差异显著。总酚含量以 SY 培养基最为突出，达到 1 245 mg GAE/L，显著高于其他各组；其次是 GP 培养基（980 mg GAE/L）。总黄酮含量在 GP 和 SY 培养基中分别为 345 mg QE/L 和 328 mg QE/L，而 WM 和 RH 培养总黄酮含量均低于 200 mg QE/L。在抗氧化能力上，SY 培养液的 DPPH 自由基清除率为 89.7%（稀释 10 倍后），ABTS·⁺ 清除能力也呈现同步优势，FRAP 值达到 2 360 μmol FeSO₄/L。相关性分析显示，总酚含量与 DPPH 清除率、ABTS·⁺ 清除率和 FRAP 值之间均呈现极显著正相关（r > 0.92，p < 0.001），证实发酵液的抗氧化活性主要由酚类物质贡献。值得注意的是，铁离子螯合能力却表现出不同的模式：WM 和 RH 发酵液的螯合率更高，分别达到 75.3% 和 68.9%，这可能与其中含有特定蛋白质或多糖组分有关，提示农业副产物发酵液可用于开发兼具抗氧化和金属螯合功能的天然产物。
将酶活性和抗氧化活性联合考察，可以得出一个清晰的规律：高浓度简单营养盐（如 GP 和 SY 培养基）有利于菌丝体生物量和抗氧化活性物质的积累，而成本低廉的农业副产物（WM 和 RH 培养基）则是高效联产纤维素酶、木聚糖酶和漆酶的绝佳底物。该研究由此提出，根据目标产物差异，可灵活选择单一或复合培养基进行灵芝深层发酵，以实现定向高值转化。
4. 讨论与展望
上述结果进一步印证了灵芝深层发酵中“生长-产酶”的代谢权衡关系。当培养基提供丰富的速效碳源（葡萄糖、蔗糖）和有机氮源（蛋白胨、酵母提取物）时，菌体倾向于快速同化并大量合成次生代谢产物，如多酚和黄酮，从而展现强劲的抗氧化活性。而当菌丝体暴露于小麦麸皮、米糠等富含木质纤维素的底物时，碳代谢流转向诱导型水解酶的合成与分泌，以满足复杂碳源降解需求。酚类物质的积累与培养体系中糖的种类及浓度密切相关，适量蔗糖可能通过莽草酸和苯丙烷代谢途径促进酚酸和黄酮前体的合成；而农业副产物中较多难降解纤维成分可能延迟次级代谢启动，转而优先诱导酶系表达。
该研究的实践启示在于，灵芝深层发酵完全可以作为一种多用途的生产平台，实现“一菌多用”。若目标为抗氧化功能饮料或膳食补充剂开发，可选用 GP 或 SY 等营养丰富基质，在短时间内获得高含量酚类、黄酮活性发酵液；若聚焦木纤维素降解酶制剂的制备，则应选择廉价的麸皮或米糠浸提液进行酶的高效诱导，从而大幅降低酶制剂生产成本。未来研究中，可尝试将两种类型培养基进行混合或进行阶段控温、补料策略，以达成菌丝体生长、酶产量和抗氧化活性物质积累的动态平衡。此外，利用该发酵液直接制备复合型生物制剂——兼具酶解活性和抗氧化保鲜功能的天然添加物，有望在食品、饲料及环保行业找到应用切口。
从后续研究角度出发，有必要对所产胞外酶进行分离纯化和酶学性质表征，明确其在工业条件下的稳定性和最适反应参数。同时，对农业副产物发酵液中代谢产物的结构鉴定（如具体黄酮苷元、酚酸组成）及安全性评价，将推动此类低成本发酵策略走向应用。组学手段（如转录组、代谢组）可用于解析不同营养底物下灵芝代谢网络的全局变化，为分子育种或代谢工程改造提供靶点。综上所述，Oliveira-Junior 等人的工作不仅揭示了培养基组成对灵芝深层发酵多产物谱的深刻影响，更展示出以可再生资源为底物的灵芝增值发酵技术所蕴含的广阔前景。
参考来源
S. D. Oliveira-Junior, G. L. Silva, V. Pessoa, A. S. Vasconcelos, D. F. Silva. Adding-value to *Ganoderma lingzhi* by producing enzymes and antioxidant compounds under submerged fermentation using different culture media. *Brazilian Journal of Biology*, 2024, 84: e283882. DOI: 10.1590/1519-6984.283882
DOI: 10.1590/1519-6984.283882