来源：Estimating the microbial lipid synthesis and environmental impacts of Yarrowia lipolytica under four cultivation modes（Renewable Energy）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
利用有机废弃物发酵获得的高浓度挥发性脂肪酸（VFAs）作为产油酵母的碳源，是降低微生物脂质生产成本的重要途径，但高浓度VFAs对细胞生长的抑制效应是核心瓶颈。本研究以30 g/L乙酸为碳源，系统比较了解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）在单阶段分批、两阶段分批、连续培养和连续细胞回流培养四种模式下的脂质合成性能，并结合生命周期评价（LCA）考察各模式的环境影响。结果显示，连续细胞回流培养实现了最高脂质产量4.3 g/L，其全球变暖潜能仅为两阶段培养的五分之一，展现出工业化应用潜力。
研究背景
产油微生物合成的微生物脂质在食品、化妆品和生物燃料领域具有重要应用价值，尤其是作为第三代生物柴油原料备受关注。产油酵母是目前最有前景的产油微生物，但发酵阶段成本高是工业化生产的主要瓶颈。据报道，微生物脂质生产成本约为每吨油1300至9000美元，主要取决于原料和培养模式。挥发性脂肪酸（VFAs）主要由短碳链酸（C1-C6）组成，可从多种有机废弃物发酵中廉价获得，其转化途径短、理论脂质转化效率高于糖类底物，是产油酵母的理想碳源。然而，高浓度VFAs对酵母细胞生长产生不利影响，显著降低VFAs利用率和脂质产量。Fei等人首次报道了初始浓度超过5 g/L的VFAs对Cryptococcus albidus培养的抑制作用。因此，设计有效的培养策略以应对酸抑制并提高脂质产量至关重要。
研究方法
2.1 菌株与培养基
解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）CICC-31596购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。菌株保存于酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）琼脂培养基中，温度为4 ± 1 °C。种子培养基组成及活化方法参照前期研究[12]。种子接种物在28 °C、180 r/min条件下培养24 h，使OD600达到1.4–1.6。
【数据】菌株：Yarrowia lipolytica CICC-31596；保存温度：4 ± 1 °C；种子培养温度：28 °C；转速：180 r/min；时间：24 h；OD600：1.4–1.6
2.2 培养方法
#### 2.2.1 分批培养方法
单阶段和两阶段分批培养均在3 L反应器中进行，温度维持在28 °C，搅拌转速为180 rpm。反应器工作体积为2.5 L，接种比例为10%。以乙酸为碳源，浓度为30 g/L；氯化铵为氮源，浓度根据碳氮比（C/N）75进行调整。初始pH通过添加3M NaOH溶液精确调节至约7.0，培养过程中不再调整。四种培养模式的通气速率均设定为1.8 vvm（每分钟每体积培养基的通气体积）。单阶段分批培养持续144 h。两阶段分批培养中，Y. lipolytica首先在C/N比为15的培养基中培养，40 h后收获培养物，通过离心和重悬处理作为第二阶段的接种物。第二阶段将C/N比提高至75。各种培养模式如图1所示。pH调节策略与单阶段分批培养相同。
【数据】反应器体积：3 L；工作体积：2.5 L；温度：28 °C；转速：180 rpm；接种比例：10%；乙酸浓度：30 g/L；C/N比：75（单阶段）/15→75（两阶段）；初始pH：7.0（3M NaOH调节）；通气速率：1.8 vvm；单阶段培养时间：144 h；两阶段第一阶段时间：40 h
#### 2.2.2 连续培养方法
连续培养在3.0 L CSTR中进行，温度维持在28 °C，搅拌转速为180 r/min。以乙酸（30 g/L）为碳源，氯化铵（0.71 g/L）为氮源，培养基C/N为75。初始pH用3M NaOH溶液调节至7.0。新鲜补料培养基的pH也调节至约7.0。加入10%接种物后在分批培养条件下生长24 h，然后启动连续培养。当DCW/OD比值在12 h内变化小于5%时，认为达到稳态。至少经过五次培养基更换后达到稳定条件。随后，使用蠕动泵引入新鲜发酵培养基，从第60小时开始维持稀释率为0.06 h⁻¹。在连续细胞回流培养中，从反应器提取的部分液体通过中空纤维膜进行离心分离，收获的细胞随后重新引入反应器。基于上述常规连续培养方法，细胞回流可提高反应器中的细胞密度，进一步改善脂质产量。
【数据】反应器体积：3.0 L CSTR；温度：28 °C；转速：180 r/min；乙酸浓度：30 g/L；氯化铵浓度：0.71 g/L；C/N比：75；初始pH：7.0（3M NaOH）；接种比例：10%；分批培养时间：24 h；稳态判定：DCW/OD变化<5%/12 h；稀释率：0.06 h⁻¹；启动时间：第60小时
2.3 分析方法
细胞密度以OD600值表示，通过分光光度计（DR-6000，HACH公司，美国）测量。Y. lipolytica的生物量以DCW表示。取30 mL培养液中的细胞，在5000 r/min下离心10 min收获，用蒸馏水洗涤，重复两次。离心后的细胞在105 °C下干燥24 h至恒重后测量DCW。脂质按照Bligh和Dyer[30]酸热法的改良方法[12]从细胞中提取。使用氯仿/甲醇（1:1，v/v）溶液从破碎细胞中提取脂质，随后通过氮吹干燥。脂质混合物在5000g下离心25 min，确保完全溶解在溶剂中。随后，有机相用0.15%（w/v）NaCl溶液洗涤两次。纯化的氯仿层在氮气流下蒸发至干燥。脂质产量以每升培养基中脂质的克数表示。脂质分级通过配备火焰离子化检测器（FID）和TR-WAXMS色谱柱（Thermo Scientific，30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）的GC-MS QP2010 ultra（Shimadzu，日本）测定，操作步骤参照文献[12]。乙酸浓度使用Shimadzu HPLC-2030系统（Shimadzu，日本）测定，该系统配备火焰离子化检测器（FID）和惰性Sutain C18色谱柱（5 μm × 4.6 mm × 150 mm）。流动相由纯甲醇和磷酸二氢钠缓冲溶液（10 mmol/L）组成，体积比为15:85，pH调节至2.5。整个分析过程中流速维持在1 ml/min。进样量为10 μL，柱温箱温度设定为30 °C，检测波长为210 nm。总铵态氮浓度（TAN）按照德国标准方法（DIN标准38 406）测定，适用于水、废水和污泥的检验[31]。pH使用pH计（Hach HQ4200，美国）测量。
【数据】OD600测量：分光光度计DR-6000；离心条件：5000 r/min、10 min；干燥条件：105 °C、24 h；脂质提取：氯仿/甲醇（1:1，v/v）；离心：5000g、25 min；洗涤：0.15%（w/v）NaCl溶液；GC-MS：QP2010 ultra，TR-WAXMS柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）；HPLC：Shimadzu HPLC-2030，C18柱（5 μm × 4.6 mm × 150 mm）；流动相：甲醇/磷酸二氢钠缓冲液（10 mmol/L）=15:85，pH 2.5；流速：1 ml/min；进样量：10 μL；柱温：30 °C；检测波长：210 nm
2.4 生命周期评价方法
使用生命周期分析软件SimaPro 9.0对培养阶段的微生物油生产进行了全面的LCA，采用"从摇篮到坟墓"方法（EPA，2010）。该方法涵盖从原材料获取和加工到生产、运输、销售、使用、回收和最终处置的所有阶段。
【数据】LCA软件：SimaPro 9.0；方法：cradle-to-grave（EPA，2010）
2.5 统计分析
脂质含量表示为每克DCW回收的脂质克数。脂质产量定义为每升培养基产生的脂质克数。所有统计分析在Microsoft Excel 2021和Origin 2024b中进行。所有数值均为3次独立实验的平均值。
【数据】脂质含量单位：g lipid/g DCW；脂质产量单位：g lipid/L medium；统计分析软件：Microsoft Excel 2021、Origin 2024b；独立实验次数：3
研究结果
3.1 单阶段和两阶段分批培养
单阶段分批培养是实验室测试的基本且高效的模式。原则上，单阶段分批培养在封闭系统中进行，所有反应组分（产油酵母和底物）在开始时一次性供给，反应在无外部干预的情况下进行[13]。由于产油酵母在细胞增殖和微生物脂质合成之间对C/N有不同的偏好，两阶段分批培养被设计用于以葡萄糖为碳源提高微生物脂质产量，并进一步促进新碳源的适应和利用[32]。本研究提出了一种改良的两阶段分批培养模式，第一阶段和第二阶段均使用30 g/L乙酸作为碳源，而第二阶段底物的氮含量降低（C/N比从15升至75），从而创造限氮环境。
如图2所示，两阶段培养有效提高了生物量。单阶段培养中的Y. lipolytica已进入稳定期，甚至可能进入衰退期，而两阶段分批培养中的Y. lipolytica仍处于指数生长期。单阶段和两阶段分批培养结束时的DCW分别为2.47 g/L和8.64 g/L，表明Y. lipolytica的生物量增加了2.5倍。两阶段分批培养中Y. lipolytica的生物量增长归因于第一阶段适合细胞增殖的C/N比以及第二阶段培养基的更换——更换后的培养基具有更高的营养含量，促进了Y. lipolytica的生物量积累。相反，在初始C/N比为75的单阶段培养中，由于分批模式下仅提供少量氮源，细胞产量较低。初始高C/N比无法维持，培养开始后C/N无法控制且不断变化。Y. lipolytica持续生长直至氮耗尽，残留C/N持续增加直到碳被消耗，最终获得27.81%的微生物脂质含量。
当培养基中同时存在碳和氮时，细胞增殖是主要过程。在氮限制条件下，Y. lipolytica通常在生长周期早期积累微生物脂质，然后将这些化合物转化为一系列低分子量化合物，如柠檬酸[5]。在两阶段培养中，当C/N比从15增加至75时，Y. lipolytica的微生物脂质含量从第一阶段的16.56%增加至第二阶段的28.32%。氮限制引发了多种生理和代谢适应[33]。首先，氮缺乏触发线粒体柠檬酸积累[34]。氮缺乏导致AMP（腺苷一磷酸）作为铵的替代来源被AMP脱氨酶催化分解。酵母异柠檬酸脱氢酶被AMP变构激活，因此AMP浓度的降低导致异柠檬酸脱氢酶活性降低[35]。这导致异柠檬酸积累，进而引起柠檬酸积累。柠檬酸随后通过线粒体载体家族的专用反向转运体离开线粒体（例如，来自Y. lipolytica的Ymh2转运体已被证明能有效转运柠檬酸以交换α-酮戊二酸）[36]。其次，线粒体柠檬酸积累进一步导致乙酰-CoA池增加，以驱动Y. lipolytica中的脂肪酸合成。乙酰-CoA的来源包括胞质乙酰-CoA合成酶和线粒体池中乙酰-CoA转化为柠檬酸。在转化机制中，ATP-柠檬酸裂解酶（ACL）发挥核心作用，能够将柠檬酸分解为草酰乙酸和乙酰-CoA。该活性的存在与产油表型相关，ACL已通过Y. lipolytica中的敲除实验[37,38]和过表达实验[39]直接与微生物脂质生产相关联。
Ana S. Pereira等人提出了一种Y. lipolytica NCYC 2904和W29的两阶段补料分批培养模式，包括在葡萄糖或甘油中的第一阶段生长期，随后在18 g/L VFAs（乙酸、丙酸和丁酸）培养基中进行产脂阶段，最终获得23%的微生物脂质含量和2.9 g/L的微生物脂质产量[18,19]。然而，前期类似研究通常仍需要葡萄糖或甘油作为第一阶段碳源。本研究首次在两个阶段均使用高浓度乙酸作为碳源，实现了2.44 g/L的微生物脂质产量。这是通过维持28.32%的微生物脂质含量并显著提高生物量（DCW）至8.64 g/L实现的。两阶段培养通过在第一阶段补充营养并在第二阶段触发细胞应激反应，构成了提高生物量和微生物脂质积累的有效策略。然而，两阶段分批培养方法需要至少两个容器进行实施，如果使用不同容器，则因需要卸料和装料而给大规模应用带来挑战。在这种情况下，需要多个生物反应器。或者，在整个过程中使用同一生物反应器可被视为重复分批方法的改良。这种方法需要在填充新培养基之前对第一个容器进行原位清洗和灭菌，同时在重新接种前将细胞维持在低温状态。这些操作导致培养停止的停机时间，从而增加了整个过程的额外成本[40]。
【数据】单阶段DCW：2.47 g/L；两阶段DCW：8.64 g/L；生物量增加倍数：2.5倍；单阶段脂质含量：27.81%；两阶段第一阶段脂质含量：16.56%；两阶段第二阶段脂质含量：28.32%；两阶段脂质产量：2.44 g/L；C/N比：15→75
3.2 连续培养
在连续培养中，从第60小时开始以恒定稀释率添加新鲜培养基。在适应期，由于部分初始细胞被排出，生物量下降，导致底物中乙酸和铵态氮积累增加，如图3所示。从第204小时起，DCW/OD600的比值变化小于5%，DCW达到约6.8 g/L。这种稳定化可能归因于开放系统对Y. lipolytica生长的影响，导致稳定期延长。
如图4所示，在此稳定期内，生物反应器中的生物量逐渐积累，脂质含量也增加。随着新鲜培养基的持续流入，发酵液中残留的VFAs逐渐减少。第516小时后，生物量开始持续下降；然而，脂质含量保持在约30%的相对稳定水平，最大脂质产量为3.16 g/L。
在已报道的研究中，Gong等人利用含有乙酸的玉米秸秆水解液作为碳源培养Cryptococcus curvatus，积累了5.05 g/L生物量和3.35 g/L脂质，但培养仅运行约60小时，勉强达到稳定状态[41]。本研究中对Y. lipolytica的连续培养持续了708 h，生物量浓度达到11.04 g/L，脂质产量为3.16 g/L，分别比单阶段培养高约3.5倍。连续从培养基中去除酵母细胞确保了更年轻的Y. lipolytica细胞群体维持比分批培养更高的产物产量。Gorte等人培养了……
【数据】连续培养启动时间：第60小时；稳态起始：第204小时；稳态DCW：约6.8 g/L；脂质含量稳定值：约30%；最大脂质产量：3.16 g/L；生物量下降起始：第516小时；培养总时长：708 h；生物量浓度：11.04 g/L；脂质产量：3.16 g/L；提升倍数：约3.5倍
讨论与解读
本研究评估了Y. lipolytica在四种不同模式下的培养效果。单阶段分批培养是一种快速简便的方法，特别适用于研究影响因素。两阶段分批培养通过在第一阶段优化碳氮营养促进细胞增殖来积累更高的生物量，从而增强微生物脂质生产。然而，该模式与其他三种模式相比具有显著更大的负面环境影响。连续细胞回流培养取得了最有利的结果，实现了4.3 g/L的脂质产量和34.93%的脂质含量，这归因于生物反应器内Y. lipolytica生物量的增加积累。此外，该模式的全球变暖潜能仅为两阶段培养的五分之一，相对于石化柴油可减少约1300 kgCO₂eq/t的温室气体排放，从而提供可观的环境效益。本研究的主要局限性在于缺乏对工艺参数的深入分析——如果不全面理解温度、pH和搅拌速率等参数与培养过程的相互作用，对工艺条件优化的支持是不充分的。
编译者解读：本研究以30 g/L乙酸为碳源直接比较四种培养模式，数据链条完整，特别是将连续细胞回流培养与生命周期评价结合，跳出了"只谈产量"的实验室思维。连续细胞回流培养在脂质产量（4.3 g/L）和环境足迹上的双重优势，提示细胞密度维持可能是高浓度VFAs条件下突破酸抑制的关键杠杆。不过，708 h的连续培养时长对工业化放大的能耗和膜污染问题，原文着墨有限，经济可行性仍需进一步验证。从合成生物学应用角度看，若能结合菌株的乙酸耐受性工程改造，该工艺的工业落地潜力会更大。
DOI: 10.1016/j.renene.2025.123186