来源：Genomic analysis of regulatory mechanisms governing EPS66A biosynthesis in Streptomyces changanensis HL-66（Pesticide Biochemistry and Physiology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
植物免疫激发子EPS66A是一种由长安链霉菌（Streptomyces changanensis）HL-66产生的α-(1,4)/(1,6)-葡聚糖胞外多糖，对多种植物病害具有显著防控效果，但其天然发酵产量低，制约了规模化应用。本研究对HL-66进行了全基因组测序与功能解析，并通过基因敲除与过表达实验揭示了糖基转移酶基因GTy与全局调控基因bldD在EPS66A生物合成中的差异化调控作用。田间与离体实验表明，EPS66A（200 μg/mL）对烟草花叶病毒、苹果炭疽叶枯病、核桃细菌性黑斑病和枣炭疽病的防效分别达90.21%、87.95%、77.41%和68.55%，优于商品化壳寡糖对照。
研究背景
链霉菌是广泛分布于土壤中的革兰氏阳性放线菌，具有丰富的次级代谢能力，是多种生物活性化合物的重要来源。迄今已有大量链霉菌来源的代谢产物被成功开发为生物农药并应用于农业生产，在可持续植物保护体系中发挥着关键作用。在众多生物活性代谢物中，微生物胞外多糖（EPSs）因其独特的免疫调节活性而受到关注——它们有助于土壤改良、促进植物生长并缓解非生物胁迫。作为微生物来源的免疫激发分子，EPSs可作为微生物相关分子模式（MAMPs）激活植物模式触发免疫（PTI），诱导广谱防御反应。然而，EPS的生物活性高度依赖于其精细的化学结构，且野生菌株的产量往往难以满足应用需求。因此，解析EPS生物合成的遗传基础与调控机制，对于提高产量和推动产业化具有重要意义。
研究方法
2.1 实验材料
长安链霉菌HL-66分离自中国陕西子午谷土壤（34°01′18.66″ N，108°53′02.92″ E），保存于高氏一号琼脂斜面培养基（可溶性淀粉20 g/L、KNO₃ 1 g/L、NaCl 0.5 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L、K₂HPO₄ 0.5 g/L、FeSO₄·7H₂O 0.01 g/L、琼脂15 g/L，pH 7.2），4°C保存。烟草花叶病毒（TMV）、围小丛壳菌（Glomerella cingulata）、胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和核桃细菌性黑斑病菌（Xanthomonas arboricola pv. juglandis）保存于本实验室。供试植物包括烟草（Nicotiana glutinosa）、苹果（Malus domestica）、冬枣（Ziziphus jujuba cv. ‘Dongzao’）和核桃（Juglans regia）。
【数据】菌株：Streptomyces changanensis HL-66；培养基：高氏一号琼脂（pH 7.2）；保藏温度：4°C；采样坐标：34°01′18.66″ N，108°53′02.92″ E
2.2 EPS66A植物病害防效评价
EPS66A从长安链霉菌分泌物中提取，用无菌双蒸水稀释后进行后续实验。EPS66A对TMV的保护效果参照Sun等（2022）的方法评价。EPS66A对胶孢炭疽菌、围小丛壳菌和核桃细菌性黑斑病菌的保护活性采用离体组织实验评价。采集近三个月内未施用杀菌剂的健康苹果叶片。选择大小一致的冬枣果实，用无菌水冲洗。采集健康四年生核桃幼苗的完全展开顶叶。所有样品用水冲洗，75%乙醇表面消毒30 s，风干。将EPS66A溶液（200 μg/mL）喷洒于样品表面。每个处理设三个生物学重复，每个重复含三个样品。2%氨基寡糖素溶液（200 μg/mL）作为阳性对照，无菌水作为阴性对照。对于苹果叶片和枣果，在超净工作台内用无菌接种针制造伤口（直径5 mm）。将含活跃生长菌丝的琼脂块（直径5 mm）置于伤口上，菌丝面朝下。接种后的组织用保鲜膜覆盖以保持高湿度24 h，随后用无菌水喷雾维持湿润条件。接种5天后测量病斑直径，按以下公式计算防效：防效（%）=（对照病斑直径−处理病斑直径）/（对照病斑直径）×100。对于核桃叶片，在EPS66A处理24 h后，按照Wu等（2024）的方法接种核桃细菌性黑斑病菌悬浮液（OD₆₀₀ = 1.0），叶片在高湿度下维持24 h。接种7天后记录病斑面积。根据病斑面积占叶片总面积的比例划分病情等级（0%、0–5%、5–10%、10–20%、25–50%和50–100%），对应病情级值为0、1、3、5、7和9。病情指数和防效按以下公式计算：病情指数（%）= [Σ（各级发病数×级值）]/（调查总数×最高级值）×100；防效（%）=（对照病情指数−处理病情指数）/对照病情指数×100。
【数据】EPS66A浓度：200 μg/mL；阳性对照：2%氨基寡糖素（200 μg/mL）；75%乙醇消毒时间：30 s；伤口直径：5 mm；琼脂块直径：5 mm；保湿时间：24 h；病斑测量时间：接种后5天；核桃叶片病情调查时间：接种后7天；接种菌液OD₆₀₀：1.0
2.3 全基因组测序、组装与注释
长安链霉菌HL-66的全基因组测序由北京擎科生物科技有限公司使用Oxford Nanopore和Illumina HiSeq测序平台完成，分别产生长读段和短读段数据。基因组组装使用Nanopore测序数据，采用Flye v2.9进行从头组装以生成初始contigs，随后使用Pilon v1.24结合Illumina短读段数据进行校正，获得高质量的基因组组装结果。基因组组分预测方面，使用Prokka v1.14.6预测蛋白质编码基因，使用RepeatMasker v4.1.2-p1识别重复序列。次级代谢物生物合成基因簇使用antiSMASH v6.0.0预测和分析。功能注释方面，将预测的蛋白质编码序列与UniProt、KEGG、GO、Pfam、COG、TIGRFAMs、RefSeq和NR数据库进行比对，使用BLAST+ v2.11.0，E值阈值≤1e⁻⁵。
【数据】测序平台：Oxford Nanopore + Illumina HiSeq；组装软件：Flye v2.9 + Pilon v1.24；基因预测：Prokka v1.14.6；重复序列：RepeatMasker v4.1.2-p1；基因簇预测：antiSMASH v6.0.0；BLAST E值阈值：≤1e⁻⁵
2.4 GTy和bldD基因分析
预测蛋白的氨基酸序列相似性分析使用DNAMAN软件（https://www.lynnon.com）完成。蛋白分子量和理论等电点使用ExPASy服务器的ProtParam工具预测（https://web.expasy.org/protparam/）。潜在磷酸化位点使用NetPhos预测服务器分析（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）。信号肽和跨膜螺旋分别使用SignalP（https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）和TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测。蛋白保守结构域使用NCBI保守结构域数据库（CDD；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd）鉴定，功能结构域进一步使用SMART在线工具分析（https://smart.embl-heidelberg.de）。二级结构元件（包括α-螺旋和β-折叠）使用NPSA平台中的SOPMA程序预测（https://npsa.lyon.inserm.fr/）。蛋白三级结构使用SWISS-MODEL同源建模服务器建模（https://swissmodel.expasy.org）。
【数据】分析工具：DNAMAN、ProtParam、NetPhos、SignalP-5.0、TMHMM、NCBI CDD、SMART、SOPMA、SWISS-MODEL；原文未详述具体蛋白序列登录号
2.5 大肠杆菌感受态细胞制备
将大肠杆菌ET12567（湖北淼灵质粒公司）接种于含氯霉素（25 μg/mL）和卡那霉素（50 μg/mL）的Luria-Bertani（LB）液体培养基（蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、酵母提取物5 g/L，pH 7.2）中，37°C、200 rpm振荡培养过夜。将过夜培养物以1%（v/v）比例转接至新鲜LB培养基中，在相同条件下培养至OD₆₀₀达到0.4–0.6。将细胞置于冰上冷却30 min，4°C、4500 ×g离心5 min收集菌体。用预冷的0.1 M CaCl₂轻轻重悬菌体，冰上孵育15 min，CaCl₂处理重复一次。再次在相同条件下离心收集菌体，最终重悬于100 μL预冷的0.1 M CaCl₂中，获得化学感受态大肠杆菌ET12567细胞。
【数据】培养基：LB（pH 7.2）；抗生素：氯霉素25 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL；培养温度：37°C；转速：200 rpm；接种比例：1%（v/v）；收集OD₆₀₀：0.4–0.6；冰浴时间：30 min；离心：4500 ×g、4°C、5 min；CaCl₂浓度：0.1 M；孵育时间：15 min；最终重悬体积：100 μL
2.6 突变株与重组菌株的构建
#### 2.6.1 基因敲除质粒的构建
使用CTAB法提取长安链霉菌HL-66基因组DNA。质粒提取和DNA纯化使用商业试剂盒（天根，北京）。基因敲除采用同源重组策略，参照先前描述的方案。将bldD和GTy基因的上游（U）和下游（D）同源臂与卡那霉素抗性基因（KanR）组装，生成U-KanR-D片段。序列验证后，使用In-Fusion克隆将该片段插入经EcoRI/XbaI消化的pKC1139载体中，获得重组质粒pKC1139-U-KanR-D。将重组质粒通过热激法转化至大肠杆菌ET12567中，验证阳性转化子并用作属间接合转移的供体菌株。
#### 2.6.2 过表达质粒的构建
以长安链霉菌HL-66基因组DNA为模板，通过PCR扩增bldD和GTy-FR片段。纯化后，在靶基因上游引入强组成型启动子（ermEp），克隆至pSET152载体（湖北淼灵质粒公司）中，构建过表达质粒pSET152:ermEp-bldD和pSET152:ermEp*-GTy。将重组质粒转化至大肠杆菌ET12567中，验证阳性转化子。
【数据】DNA提取方法：CTAB法；敲除策略：同源重组（U-KanR-D片段）；限制性内切酶：EcoRI/XbaI；载体：pKC1139（敲除）、pSET152（过表达）；启动子：ermEp*（强组成型）；转化方法：热激法；供体菌株：E. coli ET12567
研究结果
3.1 EPS66A对多种植物病害的保护活性评价
除特别说明外，所有实验均设三个独立生物学重复（n = 3）。对EPS66A的植物保护潜力进行了评价（图1）。在TMV实验中，EPS66A在200 μg/mL浓度下达到最高抑制率，为90.21%（图1b）；因此选择该浓度进行后续实验。抗病毒活性未呈现严格的浓度依赖性——400 μg/mL处理组的保护效果（86.96%）略低于200 μg/mL组。在50和100 μg/mL浓度下，EPS66A的保护效果仍显著高于2%氨基寡糖素对照，抑制率分别为62.04%和76.09%。在苹果炭疽叶枯病离体实验中，经EPS66A预处理的叶片病斑面积小于对照（图1c和f），保护效果为87.95%，显著高于2%氨基寡糖素对照。对于枣炭疽病，EPS66A抑制了病斑扩展，保护效果为68.55%，与2%氨基寡糖素对照无显著差异（图1d和g）。在核桃细菌性黑斑病实验中，EPS66A处理减少了病原菌侵染，保护效果为77.41%，显著高于2%氨基寡糖素对照（图1e和h）。
【数据】TMV抑制率：200 μg/mL时90.21%、400 μg/mL时86.96%、100 μg/mL时76.09%、50 μg/mL时62.04%；苹果炭疽叶枯病防效：87.95%；枣炭疽病防效：68.55%；核桃细菌性黑斑病防效：77.41%；对照：2%氨基寡糖素
3.2 长安链霉菌HL-66基因组序列分析
对长安链霉菌HL-66进行全基因组测序，三代测序（Nanopore）共获得1,312,792,716 bp的clean reads（表S2），二代测序（Illumina）共获得1,347,446,189 bp的clean reads（表S3）。基因组组装结果显示，HL-66的基因组大小为6.818 Mb（表S4）。以2000 bp滑动窗口计算，二代和三代测序的平均测序深度分别为187.45×和187.03×，表明测序质量高且基因组覆盖度充足。组装后获得3个contigs，总长度为6,817,869 bp，GC含量为74%（图2）。基因组注释显示，HL-66含有90个tRNA基因、18个rRNA基因、1个tmRNA基因和43个misc_RNA基因，表明其具有完善的翻译能力和复杂的基因调控网络（表S5）。基因组中共预测到76个CRISPR阵列、7个基因组岛和5个前噬菌体。重复序列分析（表S6）显示，HL-66基因组中重复序列总长度为245,575 bp，占基因组的3.51%，包括3635个简单序列重复、458个低复杂度重复和2个DNA转座子。基因组序列已提交至EMBL/NCBI国际核苷酸序列数据库，登录号为CP102332。
【数据】基因组大小：6.818 Mb（6,817,869 bp）；GC含量：74%；contigs数：3；测序深度：二代187.45×、三代187.03×；tRNA基因：90个；rRNA基因：18个；tmRNA基因：1个；misc_RNA基因：43个；CRISPR阵列：76个；基因组岛：7个；前噬菌体：5个；重复序列总长：245,575 bp（占3.51%）；简单序列重复：3635个；低复杂度重复：458个；DNA转座子：2个；GenBank登录号：CP102332
3.3 长安链霉菌HL-66基因组功能注释
从基因组中共预测到6081个编码基因，其中6018个获得功能注释（表S7）。注释结果显示，NR、UniProt和RefSeq数据库的注释基因比例均超过98%，Pfam和GO注释分别占76.57%和68.85%。TIGRFAM注释占43.61%，KEGG注释约占22.86%，COG注释占2.35%。COG注释（图3b）鉴定出20个功能类别，涵盖143个基因。占比较高的类别包括转录（K，25个，17.48%）、信号转导机制（T，22个，15.38%）、核糖体结构与生物发生（J，16个，11.18%）以及氨基酸转运与代谢（E，13个，9.09%）。参与防御机制（V）的基因较少，仅2个（1.40%）；胞内运输、分泌和囊泡运输类别（U）仅1个基因（0.70%）。此外，碳水化合物转运与代谢类别（G）包含10个基因（6.76%），如海藻糖合酶、磷酸烯醇式丙酮酸合酶和葡萄糖/阿拉伯糖脱氢酶，这些基因参与核苷酸糖生物合成途径。
基于GO注释（图3a），4187个基因被赋予功能分类，分为细胞组分、分子功能和生物学过程三大类。在细胞组分的20个亚类中，与膜结构相关的基因占比最高，包括膜的固有组分（1077个，25.72%）、细胞质（332个，7.93%）和质膜（256个，6.11%）。在分子功能类别中，DNA结合（464个，11.08%）和ATP结合（442个，10.56%）的基因数量最多。在生物学过程类别中，参与DNA模板化转录调控（159个，3.80%）和跨膜转运（95个，2.27%）的基因尤为富集。
KEGG注释结果（图3c）显示，代谢途径在基因组中占主导地位。占比最大的是碳水化合物代谢，涉及12个亚途径共448个基因。基因数相对较多的亚途径包括糖酵解/糖异生（50个，13.59%）、丙酮酸代谢（48个，13.04%）、氨基糖和核苷酸糖代谢（48个，13.04%）、淀粉和蔗糖代谢（47个，12.77%）以及戊糖和葡萄糖醛酸相互转化及二羧酸代谢（45个，12.23%）。
【数据】编码基因总数：6081个；功能注释基因数：6018个；NR/UniProt/RefSeq注释率：>98%；Pfam注释率：76.57%；GO注释率：68.85%；TIGRFAM注释率：43.61%；KEGG注释率：22.86%；COG注释率：2.35%；COG类别：20类143个基因；GO注释基因数：4187个；碳水化合物代谢基因数：448个（12个亚途径）
3.4 长安链霉菌HL-66次级代谢物生物合成基因簇分析
使用antiSMASH v6.0生物信息学工具对长安链霉菌HL-66基因组中的次级代谢物生物合成基因簇进行预测和分析。预测结果显示，HL-66基因组含有22个次级代谢物生物合成基因簇（表S8），涵盖萜类、非核糖体肽合成酶（NRPS）和聚酮合酶（PKS）等多种类型。其中，簇3、5、6、8和21分别与土臭素（geosmin）、套索肽（lassopeptide）、四氢嘧啶（ectoine）、去铁胺B（desferrioxamine B）和异海绵烯（isorenieratene）的已知基因簇具有100%相似性。NRPS和PKS是微生物次级代谢物生物合成的关键酶。在HL-66中，与PKS和NRPS相关的基因簇包括簇1、11、17、20和22（图4），这些基因簇与已报道的抗生素生物合成基因簇相似性较低，提示长安链霉菌HL-66可能含有新的抗生素生物合成途径。簇2与SapB（孢子相关蛋白）生物合成基因簇具有100%相似性。SapB是一种由18个氨基酸组成的羊毛硫肽化合物，其生物合成受bld基因家族调控。值得注意的是，22个预测的生物合成基因簇中没有一个与EPS66A生物合成直接相关。然而，基因组功能注释揭示了一组可能参与EPS产生的基因，包括糖基转移酶GTy（GT2家族）、pgm、UDP-葡萄糖galU和一个ABC转运蛋白（表S9）。尽管这些基因未被antiSMASH归类为典型的次级代谢物基因簇，但其功能与EPS66A的核苷酸糖依赖性生物合成途径高度一致，提示它们可能协同参与EPS66A的生物合成和分泌。
【数据】次级代谢物基因簇总数：22个；100%相似性基因簇：簇3（geosmin）、5（lassopeptide）、6（ectoine）、8（desferrioxamine B）、21（isorenieratene）、2（SapB）；PKS/NRPS相关基因簇：1、11、17、20、22；SapB氨基酸数：18个；EPS相关候选基因：GTy（GT2家族）、pgm、galU、ABC转运蛋白
3.5 碳水化合物活性酶分析
基于CAZy数据库注释，在长安链霉菌HL-66基因组中共鉴定到225条碳水化合物活性酶序列，分属六大功能类别（图5a）。其中，糖苷水解酶（GHs）数量最多，有103个成员；多糖裂解酶（PLs）数量最少，有12个成员。糖基转移酶（GTs）是参与多糖、寡糖及其他糖基化化合物生物合成的关键酶。HL-66基因组含有42个G
【数据】碳水化合物活性酶总数：225个；GHs：103个；PLs：12个；GTs：42个（原文截断，其余类别数据未详述）
讨论与解读
本研究证实EPS66A对烟草花叶病毒、苹果炭疽叶枯病和核桃细菌性黑斑病具有较强防效，而对枣炭疽病的防效相对较弱，表明EPS66A是一种有前景的广谱生物农药候选分子。这些发现也提示，靶向全局调控因子和途径特异性酶是提高微生物多糖产量的有效策略。长安链霉菌HL-66具有较高的GC含量和紧凑的基因组结构，符合链霉菌属的典型基因组特征。链霉菌基因组通常含有丰富的生物合成基因簇（BGCs），但生物信息学分析显示，在标准实验室培养条件下，这些BGCs中的许多基因保持转录沉默。antiSMASH分析预测HL-66基因组中有22个次级代谢物生物合成基因簇，涵盖NRPS、PKS和萜类等多种类别。其中NRPS和PKS是微生物次级代谢物生物合成的关键酶系统。
【编译者解读】本研究通过全基因组测序与基因功能验证相结合的策略，系统解析了EPS66A生物合成的遗传基础。值得关注的是，antiSMASH预测的22个基因簇均未直接对应EPS66A，而功能注释却锁定了一组与核苷酸糖依赖性途径高度一致的候选基因——这提示传统基因簇预测工具对胞外多糖类产物的识别存在盲区。将全局调控因子bldD与途径特异性糖基转移酶GTy的功能进行区分，为后续通过多靶点工程改造提高EPS66A产量提供了明确靶点。不过，GTy在EPS66A糖链延伸中的具体催化机制及产物结构-活性关系仍有待进一步阐明。
参考来源
Li A. Genomic analysis of regulatory mechanisms governing EPS66A biosynthesis in Streptomyces changanensis HL-66. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2026. DOI: 10.1016/j.pestbp.2026.107305
DOI: 10.1016/j.pestbp.2026.107305